Imūnmodulējošie metabolīti ir galvenā audzēja mikrovides (TME) iezīme, taču, izņemot dažus izņēmumus, to identitāte lielākoties joprojām nav zināma. Šeit mēs analizējām audzējus un T šūnas no pacientu ar augstas pakāpes serozu karcinomu (HGSC) audzējiem un ascīta, lai atklātu šo dažādo TME nodalījumu metabolomu. Ascītam un audzēja šūnām ir ievērojamas metabolītu atšķirības. Salīdzinot ar ascītu, audzējā infiltrējošās T šūnas ir ievērojami bagātinātas ar 1-metilnikotīnamīdu (MNA). Lai gan MNA līmenis T šūnās ir paaugstināts, nikotīnamīda N-metiltransferāzes (enzīma, kas katalizē metilgrupu pārnesi no S-adenozilmetionīna uz nikotīnamīdu) ekspresija ir ierobežota ar fibroblastiem un audzēja šūnām. Funkcionāli MNA inducē T šūnas sekrēt audzēju veicinošo citokīnu - audzēja nekrozes faktoru alfa. Tādēļ no TME atvasinātā MNA veicina T šūnu imūno regulāciju un ir potenciāls imunoterapijas mērķis cilvēka vēža ārstēšanai.
Audzēja izcelsmes metabolītiem var būt spēcīga inhibējoša ietekme uz pretvēža imunitāti, un arvien vairāk pierādījumu liecina, ka tie var kalpot arī kā galvenais slimības progresēšanas virzītājspēks (1). Papildus Varburga efektam nesen ir uzsākts darbs, lai raksturotu audzēja šūnu vielmaiņas stāvokli un tā saistību ar audzēja mikrovides (TME) imūno stāvokli. Pētījumi ar peļu modeļiem un cilvēka T šūnām ir parādījuši, ka glutamīna metabolisms (2), oksidatīvais metabolisms (3) un glikozes metabolisms (4) var neatkarīgi iedarboties uz dažādām imūnšūnu apakšgrupām. Vairāki metabolīti šajos ceļos kavē T šūnu pretvēža funkciju. Ir pierādīts, ka koenzīma tetrahidrobiopterīna (BH4) blokāde var kaitēt T šūnu proliferācijai, un BH4 palielināšanās organismā var pastiprināt CD4 un CD8 mediēto pretvēža imūnreakciju. Turklāt kinurenīna imūnsupresīvo efektu var atjaunot, ievadot BH4 (5). Izocitrātdehidrogenāzes (IDH) mutanta glioblastomas gadījumā enantiometaboliskā (R)-2-hidroksiglutarāta (R-2-HG) sekrēcija kavē T šūnu aktivāciju, proliferāciju un citolīzes aktivitāti (6). Nesen tika pierādīts, ka metilglioksālu, kas ir glikolīzes blakusprodukts, ražo mieloīdās izcelsmes supresoru šūnas, un metilglioksāla pārnešana uz T šūnām var kavēt efektora T šūnu funkciju. Ārstēšanas laikā metilglioksāla neitralizācija var pārvarēt mieloīdās izcelsmes supresoru šūnu (MDSC) aktivitāti un sinerģiski uzlabot kontrolpunktu blokādes terapiju peļu modeļos (7). Šie pētījumi kopumā uzsver no TME atvasināto metabolītu galveno lomu T šūnu funkcijas un aktivitātes regulēšanā.
T šūnu disfunkcija ir plaši ziņota olnīcu vēža gadījumā (8). Tas daļēji ir saistīts ar vielmaiņas īpašībām, kas raksturīgas hipoksijai un patoloģiskai audzēja asinsvadu sistēmai (9), kā rezultātā glikoze un triptofāns tiek pārveidoti par blakusproduktiem, piemēram, pienskābi un kinurenīnu. Pārmērīgs ekstracelulārais laktāts samazina interferona-γ (IFN-γ) veidošanos un veicina mielosupresīvu apakšgrupu diferenciāciju (10, 11). Triptofāna patēriņš tieši kavē T šūnu proliferāciju un kavē T šūnu receptoru signalizāciju (12–14). Neskatoties uz šiem novērojumiem, in vitro T šūnu kultūrā, izmantojot optimizētas barotnes, vai aprobežojoties ar homologiem peļu modeļiem in vivo, no kuriem neviens pilnībā neatspoguļo cilvēka vēža heterogenitāti un fizioloģisko makro un mikro vidi.
Olnīcu vēža kopīga iezīme ir izplatīšanās vēderplēves dobumā un ascīta parādīšanās. Šūnu šķidruma uzkrāšanās ascītā ir saistīta ar progresējošu slimību un sliktu prognozi (15). Saskaņā ar ziņojumiem, šī unikālā telpa ir hipoksiska, tajā ir augsts asinsvadu endotēlija augšanas faktora (VEGF) un indoleamīna 2,3-dioksigenāzes (IDO) līmenis, un tajā infiltrējas T regulatorās šūnas un mieloīdās inhibējošās šūnas (15–18). Ascīta vielmaiņas vide var atšķirties no paša audzēja vides, tāpēc T šūnu pārprogrammēšana vēderplēves telpā nav skaidra. Turklāt galvenās atšķirības un neviendabīgums starp ascītu un metabolītiem, kas atrodas audzēja vidē, var kavēt imūnšūnu infiltrāciju un to funkciju audzējos, un ir nepieciešami turpmāki pētījumi.
Lai atrisinātu šīs problēmas, mēs izstrādājām jutīgu šūnu atdalīšanas un šķidruma hromatogrāfijas tandēma masas spektrometrijas (LC-MS/MS) metodi, lai pētītu dažādus šūnu tipus (tostarp CD4+ un CD8+ T šūnas), kā arī audzējos un starp tiem. Tās metabolīti aptver šūnas tajā pašā ascītā un audzēja vidē, kur atrodas pacients. Mēs izmantojam šo metodi kopā ar augstas dimensijas plūsmas citometriju un vienas šūnas RNS sekvencēšanu (scRNA-seq), lai sniegtu ļoti izšķirtspējīgu portretu par šo galveno populāciju vielmaiņas stāvokli. Šī metode atklāja ievērojamu 1-metilnikotīnamīda (MNA) līmeņa paaugstināšanos audzēja T šūnās, un in vitro eksperimenti parādīja, ka MNA imūnmodulējošā ietekme uz T šūnu funkciju iepriekš nebija zināma. Kopumā šī metode atklāj savstarpējo vielmaiņas mijiedarbību starp audzējiem un imūnšūnām un sniedz unikālu ieskatu imūnregulācijas metabolītos, kas varētu būt noderīgi T šūnu bāzes olnīcu vēža imunoterapijas ārstēšanā. Ārstēšanas iespējas.
Mēs izmantojām augstas dimensijas plūsmas citometriju, lai vienlaikus kvantitatīvi noteiktu glikozes uzņemšanu [2-(N-(7-nitrofenil-2-oksa-1,3-diaza-4-il)amino)-2-dezoksiglikoze (2-NBDG) un mitohondriju aktivitāti [MitoTracker Deep Red (MT DR)] (7, 19, 20) ir blakus esoši tipiski marķieri, kas atšķir imūnās šūnas un audzēja šūnu populācijas (S2 tabula un S1A attēls). Šī analīze parādīja, ka, salīdzinot ar T šūnām, ascītam un audzēja šūnām ir augstāks glikozes uzņemšanas līmenis, bet mazākas atšķirības mitohondriju aktivitātē. Audzēja šūnu vidējā glikozes uzņemšana [CD45-EpCAM (EpCAM)+] ir trīs līdz četras reizes lielāka nekā T šūnām, un CD4+ T šūnu vidējā glikozes uzņemšana ir 1,2 reizes lielāka nekā CD8+ T šūnām, kas norāda, ka audzēja infiltrējošajiem limfocītiem (TIL) ir atšķirīgas vielmaiņas prasības pat vienā un tajā pašā TME (1A attēls). Turpretī mitohondriju aktivitāte audzēja šūnās ir līdzīga CD4+ T šūnu aktivitātei, un abu šūnu tipu mitohondriju aktivitāte ir augstāka nekā CD8+ T šūnu aktivitāte (1.B attēls). Kopumā šie rezultāti atklāj vielmaiņas līmeni. Audzēja šūnu vielmaiņas aktivitāte ir augstāka nekā CD4+ T šūnu aktivitāte, un CD4+ T šūnu vielmaiņas aktivitāte ir augstāka nekā CD8+ T šūnu aktivitāte. Neskatoties uz šo ietekmi uz dažādiem šūnu tipiem, nav konsekventas atšķirības CD4+ un CD8+ T šūnu vielmaiņas stāvoklī vai to relatīvajās proporcijās ascītā salīdzinājumā ar audzējiem (1.C attēls). Turpretī CD45 šūnu frakcijā EpCAM+ šūnu īpatsvars audzējā palielinājās salīdzinājumā ar ascītu (1.D attēls). Mēs arī novērojām skaidru vielmaiņas atšķirību starp EpCAM+ un EpCAM- šūnu komponentiem. EpCAM+ (audzēja) šūnām ir augstāka glikozes uzņemšana un mitohondriju aktivitāte nekā EpCAM- šūnām, kas ir daudz augstāka nekā fibroblastu vielmaiņas aktivitāte audzēja šūnās TME (1., E un F attēls).
(A un B) Glikozes uzņemšanas vidējā fluorescences intensitāte (MFI) (2-NBDG) (A) un CD4+ T šūnu mitohondriju aktivitāte (MitoTracker tumši sarkans) (B) Reprezentatīvi grafiki (pa kreisi) un tabulārie dati (pa labi), CD8+ T šūnas un EpCAM+CD45-audzēja šūnas no ascīta un audzēja. (C) CD4+ un CD8+ šūnu (CD3+ T šūnu) attiecība ascītā un audzējā. (D) EpCAM+ audzēja šūnu īpatsvars ascītā un audzējā (CD45−). (E un F) EpCAM+CD45-audzēja un EpCAM-CD45-matricas glikozes uzņemšana (2-NBDG) (E) un mitohondriju aktivitāte (MitoTracker tumši sarkans) (F) reprezentatīvi grafiki (pa kreisi) un tabulārie dati (pa labi) Ascīts un audzēja šūnas. (G) CD25, CD137 un PD1 ekspresijas reprezentatīvi grafiki, izmantojot plūsmas citometriju. (H un I) CD25, CD137 un PD1 ekspresija CD4+ T šūnās (H) un CD8+ T šūnās (I). (J un K) Naivās, centrālās atmiņas (Tcm), efektora (Teff) un efektora atmiņas (Tem) fenotipi, pamatojoties uz CCR7 un CD45RO ekspresiju. CD4+ T šūnu (J) un CD8+ T šūnu (K) reprezentatīvi attēli (pa kreisi) un tabulārie dati (pa labi) ascītā un audzējos. P vērtības noteiktas ar pāru t-testu (*P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001). Līnija attēlo saskaņotus pacientus (n = 6). FMO, fluorescence mīnus viens; MFI, vidējā fluorescences intensitāte.
Turpmāka analīze atklāja citas būtiskas atšķirības starp ļoti atšķirīgo T šūnu fenotipisko statusu. Aktivētā (1. attēls, G līdz I) un efektora atmiņa (1. attēls, J un K) audzējos ir daudz biežāk sastopama nekā ascīts (CD3+ T šūnu īpatsvars). Līdzīgi, analizējot fenotipu pēc aktivācijas marķieru (CD25 un CD137) un noplicināšanas marķieru [programmētā šūnu nāves proteīna 1 (PD1)] ekspresijas, tika parādīts, ka, lai gan šo populāciju vielmaiņas īpašības ir atšķirīgas (S1. attēls, B līdz E), tomēr starp naivām, efektora vai atmiņas apakškopām netika novērotas būtiskas vielmaiņas atšķirības (S1. attēls, F līdz I). Šie rezultāti tika apstiprināti, izmantojot mašīnmācīšanās metodes, lai automātiski piešķirtu šūnu fenotipus (21), kas vēl vairāk atklāja lielu skaitu kaulu smadzeņu šūnu (CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+) pacienta ascītā (S2. attēls). Starp visiem identificētajiem šūnu tipiem šī mieloīdo šūnu populācija uzrādīja visaugstāko glikozes uzņemšanu un mitohondriju aktivitāti (S2. attēls, B līdz G). Šie rezultāti izceļ spēcīgās vielmaiņas atšķirības starp vairākiem šūnu tipiem, kas atrodami ascītā un audzējos HGSC pacientiem.
Galvenais izaicinājums TIL metabonomisko īpašību izpratnē ir nepieciešamība izolēt no audzējiem pietiekamas tīrības, kvalitātes un daudzuma T šūnu paraugus. Jaunākie pētījumi liecina, ka šķirošanas un lodīšu bagātināšanas metodes, kuru pamatā ir plūsmas citometrija, var izraisīt izmaiņas šūnu metabolītu profilos (22–24). Lai pārvarētu šo problēmu, mēs optimizējām lodīšu bagātināšanas metodi, lai izolētu un izolētu TIL no ķirurģiski rezektēta cilvēka olnīcu vēža pirms analīzes ar LC-MS/MS (skatīt Materiāli un metodes; 2A. attēls). Lai novērtētu šī protokola kopējo ietekmi uz metabolītu izmaiņām, mēs salīdzinājām veselu donoru aktivizēto T šūnu metabolītu profilus pēc iepriekš minētā lodīšu atdalīšanas posma ar šūnām, kas netika atdalītas ar lodītēm, bet palika uz ledus. Šī kvalitātes kontroles analīze atklāja, ka starp šiem diviem nosacījumiem pastāv augsta korelācija (r = 0,77), un 86 metabolītu grupas tehniskajai atkārtojamībai ir augsta atkārtojamība (2B. attēls). Tādēļ šīs metodes var veikt precīzu metabolītu analīzi šūnās, kurās notiek šūnu tipa bagātināšana, tādējādi nodrošinot pirmo augstas izšķirtspējas platformu specifisku metabolītu identificēšanai HGSC, tādējādi ļaujot cilvēkiem iegūt dziļāku izpratni par šūnu specifiskumu seksuālās metabolisma programmā.
(A) Magnētisko lodīšu bagātināšanas shematiska diagramma. Pirms analīzes ar LC-MS/MS, šūnas tiks pakļautas trim secīgām magnētisko lodīšu bagātināšanas kārtām vai paliks uz ledus. (B) Bagātināšanas veida ietekme uz metabolītu daudzumu. Trīs mērījumu vidējais rādītājs katram bagātināšanas veidam ± SE. Pelēkā līnija attēlo attiecību 1:1. Ass marķējumā parādīta atkārtotu mērījumu klases iekšējā korelācija (ICC). NAD, nikotīnamīda adenīna dinukleotīds. (C) Pacientu metabolītu analīzes darbplūsmas shematiska diagramma. No pacientiem tiek savākti ascīti vai audzēji un kriokonservēti. Neliela daļa no katra parauga tika analizēta ar plūsmas citometriju, bet atlikušie paraugi tika pakļauti trim bagātināšanas kārtām CD4+, CD8+ un CD45- šūnām. Šīs šūnu frakcijas tika analizētas, izmantojot LC-MS/MS. (D) Standartizētu metabolītu daudzuma siltuma karte. Dendrogramma attēlo Vorda klasterizāciju Eiklīda attālumiem starp paraugiem. (E) Parauga metabolītu kartes galveno komponentu analīze (PCA), kurā parādīti trīs katra parauga atkārtojumi, paraugi no viena un tā paša pacienta ir savienoti ar līniju. (F) Parauga metabolītu profila PCA, kas kondicionēts uz pacienta (t. i., izmantojot daļēju redundanci); parauga veidu ierobežo izliektais apvalks. PC1, galvenā komponente 1; PC2, galvenā komponente 2.
Pēc tam mēs izmantojām šo bagātināšanas metodi, lai analizētu 99 metabolītus sešu HGSC pacientu primārā ascīta un audzēju CD4+, CD8+ un CD45 šūnu frakcijās (2.C attēls, S3A attēls un S3. un S4 tabula). Interesējošā populācija veido 2% līdz 70% no sākotnējā lielā dzīvo šūnu parauga, un šūnu īpatsvars pacientiem ievērojami atšķiras. Pēc lodīšu atdalīšanas interesējošā bagātinātā frakcija (CD4+, CD8+ vai CD45-) vidēji veido vairāk nekā 85% no visām dzīvajām šūnām paraugā. Šī bagātināšanas metode ļauj mums analizēt šūnu populācijas no cilvēka audzēja audu metabolisma, ko nav iespējams izdarīt no lieliem paraugiem. Izmantojot šo protokolu, mēs noteicām, ka l-kinurenīns un adenozīns, šie divi labi raksturotie imūnsupresīvie metabolīti, bija paaugstināts audzēja T šūnās vai audzēja šūnās (S3., B un C attēls). Tādēļ šie rezultāti parāda mūsu šūnu atdalīšanas un masas spektrometrijas tehnoloģijas precizitāti un spēju atrast bioloģiski nozīmīgus metabolītus pacientu audos.
Mūsu analīze atklāja arī spēcīgu šūnu tipu vielmaiņas atšķirību gan viena pacienta, gan citu pacientu vidū (2.D attēls un S4.A attēls). Jo īpaši, salīdzinot ar citiem pacientiem, pacientam Nr. 70 bija atšķirīgas vielmaiņas īpašības (2.E attēls un S4.B attēls), kas norāda uz iespējamu ievērojamu vielmaiņas heterogenitāti starp pacientiem. Jāatzīmē, ka, salīdzinot ar citiem pacientiem (no 1,2 līdz 2 litriem; S1 tabula), pacientam Nr. 70 (80 ml) savāktais kopējais ascīta daudzums bija mazāks. Starppacientu heterogenitātes kontrole galveno komponentu analīzes laikā (piemēram, izmantojot daļējas redundances analīzi) uzrāda konsekventas izmaiņas starp šūnu tipiem, un šūnu tipi un/vai mikrovide ir skaidri apkopoti atbilstoši metabolītu profilam (2.F attēls). Atsevišķu metabolītu analīze uzsvēra šīs sekas un atklāja būtiskas atšķirības starp šūnu tipiem un mikrovidi. Jāatzīmē, ka visizteiktākā novērotā atšķirība ir MNA, kas parasti ir bagātināta ar CD45- šūnām un CD4+ un CD8+ šūnām, kas infiltrējas audzējā (3.A attēls). CD4+ šūnām šī ietekme ir visizteiktākā, un arī CD8+ šūnās MNA, šķiet, ir spēcīgi ietekmēta vides ietekmē. Tomēr tas nav svarīgi, jo tikai trim no sešiem pacientiem var novērtēt audzēja CD8+ rādītājus. Papildus MNA dažāda veida šūnās ascītā un audzējos arī citi metabolīti, kas TIL ir vāji raksturoti, ir atšķirīgi bagāti (S3. un S4. attēls). Tādēļ šie dati atklāj daudzsološu imunomodulējošu metabolītu kopumu turpmākiem pētījumiem.
(A) Normalizēts MNA saturs CD4+, CD8+ un CD45- šūnās no ascīta un audzēja. Kārba diagrammā parādīta mediāna (līnija), starpkvartiļu diapazons (kadra eņģe) un datu diapazons, līdz 1,5 reizēm lielāks par starpkvartiļu diapazonu (kadra ūsas). Kā aprakstīts pacientu materiālos un metodēs, izmantojiet pacienta limma vērtību, lai noteiktu P vērtību (*P<0,05 un **P<0,01). (B) MNA metabolisma shematiska diagramma (60). Metabolīti: S-adenozil-1-metionīns; SAH, S-adenozīna-1-homocisteīns; NA, nikotīnamīds; MNA, 1-metilnikotīnamīds; 2-PY, 1-metil-2-piridon-5-karboksamīds; 4-PY, 1-metil-4-piridon-5-karboksamīds; NR, nikotīnamīda riboze; NMN, nikotīnamīda mononukleotīds. Enzīmi (zaļi): NNMT, nikotīnamīda N-metiltransferāze; SIRT, sirtuīni; NAMPT, nikotīnamīda fosforiboziltransferāze; AOX1, aldehīda oksidāze 1; NRK, nikotīnamīda ribozīda kināze; NMNAT, nikotīnamīda mononukleotīda adenilāta transferāze; Pnp1, purīna nukleozīda fosforilāze. (C) Ascīta (pelēks) un audzēja (sarkans; n = 3 pacienti) scRNS sekvences t-SNE. (D) NNMT ekspresija dažādās šūnu populācijās, kas identificētas, izmantojot scRNS sekvenci. (E) NNMT un AOX1 ekspresija SK-OV-3, cilvēka embrionālās nieres (HEK) 293T, T šūnās un ar MNA apstrādātās T šūnās. Parādīta salocītā ekspresija attiecībā pret SK-OV-3. Parādīts ekspresijas modelis ar SEM (n = 6 veseli donori). Ct vērtības, kas lielākas par 35, tiek uzskatītas par nenosakāmām (UD). (F) SLC22A1 un SLC22A2 ekspresija SK-OV-3, HEK293T, T šūnās un T šūnās, kas apstrādātas ar 8mM MNA. Parādīta salocītā ekspresija attiecībā pret SK-OV-3. Parādīts ekspresijas modelis ar SEM (n = 6 veseli donori). Ct vērtības, kas lielākas par 35, tiek uzskatītas par nenosakāmām (UD). (G) Šūnu MNA saturs aktivētās veselās donoru T šūnās pēc 72 stundu inkubācijas ar MNA. Parādīts ekspresijas modelis ar SEM (n = 4 veseli donori).
MNA tiek iegūta, pārnesot metilgrupu no S-adenozil-1-metionīna (SAM) uz nikotīnamīdu (NA) ar nikotīnamīda N-metiltransferāzes (NNMT; 3.B attēls) palīdzību. NNMT ir pārmērīgi ekspresēts dažādos cilvēka vēža veidos un ir saistīts ar proliferāciju, invāziju un metastāzēm (25–27). Lai labāk izprastu MNA avotu T šūnās TME gadījumā, mēs izmantojām scRNA-seq, lai raksturotu NNMT ekspresiju dažādos šūnu tipos trīs HGSC pacientu ascītā un audzējos (S5. tabula). Aptuveni 6500 šūnu analīze parādīja, ka ascītā un audzēja vidē NNMT ekspresija aprobežojās ar paredzamajām fibroblastu un audzēja šūnu populācijām (3., C un D attēls). Ir vērts atzīmēt, ka nav acīmredzamas NNMT ekspresijas nevienā populācijā, kas ekspresē PTPRC (CD45+) (3.D attēls un S5.A attēls), kas norāda, ka metabolītu spektrā noteiktā MNA ir ievadīta T šūnās. Aldehīda oksidāzes 1 (AOX1) ekspresija pārvērš MNA par 1-metil-2-piridon-5-karboksamīdu (2-PYR) vai 1-metil-4-piridon-5-karboksamīdu (4-PYR); 3.B attēls) arī aprobežojas ar fibroblastu populāciju, kas ekspresē COL1A1 (S5.A attēls), kas kopā norāda, ka T šūnām trūkst tradicionālās MNA metabolisma spējas. Šo ar MNA saistīto gēnu ekspresijas modelis tika pārbaudīts, izmantojot otru neatkarīgu šūnu datu kopu no HGSC pacientu ascīta (S5.B attēls; n = 6) (16). Turklāt veselīgu donoru T šūnu, kas apstrādātas ar MNA, kvantitatīvā polimerāzes ķēdes reakcijas (qPCR) analīze parādīja, ka, salīdzinot ar kontroles SK-OV-3 olnīcu audzēja šūnām, NNMT vai AOX1 gandrīz netika ekspresēts (3.E attēls). Šie negaidītie rezultāti liecina, ka TME gadījumā MNA var tikt izdalīta no fibroblastiem vai audzējiem blakus esošajās T šūnās.
Lai gan kandidātu vidū ir organisko katjonu transportētāju 1. līdz 3. saime (OCT1, OCT2 un OCT3), ko kodē šķīstošo nesēju 22. (SLC22) saime (SLC22A1, SLC22A2 un SLC22A3), potenciālie MNA transportētāji joprojām nav definēti (28). Veselīgu donoru T šūnu mRNS QPCR uzrādīja zemu SLC22A1 ekspresijas līmeni, bet nenosakāmu SLC22A2 līmeni, kas apstiprināja, ka tas iepriekš ir ziņots literatūrā (3.F attēls) (29). Turpretī SK-OV-3 olnīcu audzēja šūnu līnija ekspresēja augstu abu transportētāju līmeni (3.F attēls).
Lai pārbaudītu T šūnu spēju absorbēt svešu MNA, veselas donoru T šūnas tika kultivētas 72 stundas dažādu MNA koncentrāciju klātbūtnē. Bez eksogēnas MNA MNA šūnu saturu nevar noteikt (3.G attēls). Tomēr aktivētās T šūnas, kas tika apstrādātas ar eksogēnu MNA, uzrādīja no devas atkarīgu MNA satura pieaugumu šūnās līdz pat 6 mM MNA (3.G attēls). Šis rezultāts norāda, ka, neskatoties uz zemo transportētāja ekspresijas līmeni un galvenā enzīma, kas ir atbildīgs par intracelulāro MNA metabolismu, trūkumu, TIL joprojām var uzņemt MNA.
Metabolītu spektrs pacientu T šūnās un in vitro MNA absorbcijas eksperimenti palielina iespēju, ka ar vēzi saistītie fibroblasti (CAF) izdala MNA un audzēja šūnas var regulēt TIL fenotipu un funkciju. Lai noteiktu MNA ietekmi uz T šūnām, veselas donoru T šūnas tika aktivizētas in vitro MNA klātbūtnē vai bez tās, un tika novērtēta to proliferācija un citokīnu producēšana. Pēc 7 dienu ilgas MNA pievienošanas visaugstākajā devā populācijas dubultošanās skaitlis bija mēreni samazinājies, savukārt enerģija saglabājās pie visām devām (4.A attēls). Turklāt eksogēnas MNA apstrāde palielināja CD4+ un CD8+ T šūnu, kas ekspresē audzēja nekrozes faktoru-α (TNFα; 4.B attēls), īpatsvaru. Turpretī IFN-γ intracelulārā producēšana bija ievērojami samazināta CD4+ T šūnās, bet ne CD8+ T šūnās, un interleikīna 2 (IL-2; 4., C un D attēls) līmeņa izmaiņas nebija. Tādēļ šo ar MNA apstrādāto T šūnu kultūru supernatantu enzīmu saistītais imūnsorbcijas tests (ELISA) uzrādīja ievērojamu TNFα pieaugumu, IFN-γ samazināšanos un IL-2 izmaiņu neesamību (4. attēls, E līdz G). IFN-γ samazināšanās norāda, ka MNA var būt loma T šūnu pretvēža aktivitātes inhibēšanā. Lai simulētu MNA ietekmi uz T šūnu mediēto citotoksicitāti, veselu donoru perifēro asiņu mononukleārās šūnas (PBMC) ražo himēriskās antigēna receptora T (FRα-CAR-T) šūnas, kas mērķētas uz folātu receptoru α, un CAR-T (GFP), ko regulē zaļais fluorescējošais proteīns (GFP) -CAR-T) šūnas. CAR-T šūnas tika kultivētas 24 stundas MNA klātbūtnē un pēc tam kopkultivētas ar cilvēka SK-OV-3 olnīcu audzēja šūnām, kas ekspresē folātu receptoru α ar efektora un mērķa attiecību 10:1. MNA apstrāde izraisīja ievērojamu FRα-CAR-T šūnu nogalināšanas aktivitātes samazināšanos, kas bija līdzīga FRα-CAR-T šūnām, kuras tika apstrādātas ar adenozīnu (4.H attēls).
(A) Kopējais dzīvotspējīgo šūnu skaits un populācijas dubultošanās (PD) tieši no kultūras 7. dienā. Stabiņu diagramma attēlo sešu veselu donoru vidējo vērtību + SEM. Attēlo datus no vismaz n = 3 neatkarīgiem eksperimentiem. (B līdz D) CD3/CD28 un IL-2 tika izmantoti, lai aktivizētu T šūnas to attiecīgajās MNA koncentrācijās 7 dienas. Pirms analīzes šūnas 4 stundas tika stimulētas ar PMA/jonomicīnu ar GolgiStop. TNFα (B) ekspresija T šūnās. TNFα ekspresijas dzīvās šūnās piemēra attēls (pa kreisi) un tabulas dati (pa labi). IFN-γ (C) un IL-2 (D) ekspresija T šūnās. Citokīnu ekspresija tika mērīta ar plūsmas citometriju. Stabiņu diagramma attēlo vidējo vērtību (n = 6 veseli donori) + SEM. Lai noteiktu P vērtību, izmantojiet vienvirziena dispersijas analīzi un atkārtotus mērījumus (*P<0,05 un **P<0,01). Attēlo datus no vismaz n = 3 neatkarīgiem eksperimentiem. (E līdz G) CD3/CD28 un IL-2 tika izmantoti, lai aktivizētu T šūnas to attiecīgajās MNA koncentrācijās 7 dienas. Vidēja viela tika savākta pirms un pēc 4 stundu PMA/jonomicīna stimulācijas. TNFα (E), IFN-γ (F) un IL-2 (G) koncentrācijas tika mērītas ar ELISA metodi. Stabiņu diagramma attēlo vidējo vērtību (n = 5 veseli donori) + SEM. P vērtība noteikta, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi un atkārtotus mērījumus (*P<0,05). Punktētā līnija norāda noteikšanas robežu. (H) Šūnu līzes tests. FRα-CAR-T vai GFP-CAR-T šūnas tika koriģētas ar adenozīnu (250 μM) vai MNA (10 mM) 24 stundas vai atstātas neapstrādātas (kontrole). Tika mērīts SK-OV-3 šūnu iznīcināšanas procents. P vērtība noteikta ar Velča t testu (*P<0,5 un **P<0,01).
Lai iegūtu mehānisku izpratni par MNA atkarīgo TNFα ekspresijas regulāciju, tika novērtētas ar MNA apstrādāto T šūnu TNFα mRNS izmaiņas (5.A attēls). Veselām donoru T šūnām, kas tika apstrādātas ar MNA, TNFα transkripcijas līmenis divkāršojās, norādot, ka MNA ir atkarīga no TNFα transkripcijas regulācijas. Lai izpētītu šo iespējamo regulējošo mehānismu, tika novērtēti divi zināmi transkripcijas faktori, kas regulē TNFα, proti, aktivētais T šūnu kodolfaktors (NFAT) un specifiskais proteīns 1 (Sp1), reaģējot uz MNA saistīšanos ar proksimālo TNFα promotoru (30). TNFα promoterā ir 6 identificētas NFAT saistīšanās vietas un 2 Sp1 saistīšanās vietas, kas pārklājas vienā vietā [-55 bāzes pāri (bp) no 5'-cap] (30). Hromatīna imunoprecipitācija (ChIP) parādīja, ka, apstrādājot ar MNA, Sp1 saistīšanās ar TNFα promotoru palielinājās trīs reizes. Arī NFAT iekļaušana palielinājās un tuvojās nozīmīgumam (5.B attēls). Šie dati liecina, ka MNA regulē TNFα ekspresiju caur Sp1 transkripciju un mazākā mērā NFAT ekspresiju.
(A) Salīdzinot ar T šūnām, kas kultivētas bez MNA, TNFα ekspresijas izmaiņas reizes T šūnās, kas apstrādātas ar MNA. Parādīts ekspresijas modelis ar SEM (n = 5 veseli donori). Attēlo datus no vismaz n = 3 neatkarīgiem eksperimentiem. (B) T šūnu TNFα promotors, kas apstrādātas ar vai bez 8 mM MNA pēc NFAT un Sp1, tika apvienots ar (Ctrl) un PMA/jonomicīna stimulāciju 4 stundas. Imūnglobulīns G (IgG) un H3 tika izmantoti kā negatīvas un pozitīvas kontroles imunoprecipitācijai. ChIP kvantitatīvā noteikšana parādīja, ka Sp1 un NFAT saistīšanās ar TNFα promotoru MNA apstrādātās šūnās palielinājās vairākas reizes, salīdzinot ar kontroli. Attēlo datus no vismaz n = 3 neatkarīgiem eksperimentiem. P vērtība noteikta ar vairākiem t-testiem (*** P <0,01). (C) Salīdzinot ar HGSC ascītu, T šūnas (necitotoksiskas) uzrādīja palielinātu TNF ekspresiju audzējā. Krāsas attēlo dažādus pacientus. Attēlotās šūnas ir nejauši atlasītas līdz 300 un tām ir veikta vibrācija, lai ierobežotu pārzīmēšanu (** Padj = 0,0076). (D) Piedāvātais MNA modelis olnīcu vēža ārstēšanai. MNA tiek ražota audzēja šūnās un fibroblastos TME, un to uzņem T šūnas. MNA palielina Sp1 saistīšanos ar TNFα promotoru, izraisot palielinātu TNFα transkripciju un TNFα citokīnu veidošanos. MNA izraisa arī IFN-γ samazināšanos. T šūnu funkcijas inhibīcija samazina nogalināšanas spēju un paātrina audzēja augšanu.
Saskaņā ar ziņojumiem, TNFα piemīt gan priekšējā, gan aizmugurējā pusē atkarīga pretvēža un pretvēža iedarbība, taču tam ir labi zināma loma olnīcu vēža augšanas un metastāžu veicināšanā (31–33). Saskaņā ar ziņojumiem, TNFα koncentrācija ascītā un audzēja audos pacientiem ar olnīcu vēzi ir augstāka nekā labdabīgos audos (34–36). Runājot par mehānismu, TNFα var regulēt leikocītu aktivāciju, funkciju un proliferāciju, kā arī mainīt vēža šūnu fenotipu (37, 38). Saskaņā ar šiem atklājumiem diferenciālās gēnu ekspresijas analīze parādīja, ka TNF bija ievērojami paaugstināts T šūnās audzēja audos, salīdzinot ar ascītu (5.C attēls). TNF ekspresijas pieaugums bija redzams tikai T šūnu populācijās ar necitotoksisku fenotipu (S5.A attēls). Rezumējot, šie dati apstiprina viedokli, ka MNA ir divējāda imūnsupresīva un audzēju veicinoša iedarbība HGSC gadījumā.
Fluorescējošā marķēšana, kuras pamatā ir plūsmas citometrija, ir kļuvusi par galveno metodi TIL metabolisma pētīšanai. Šie pētījumi ir parādījuši, ka, salīdzinot ar perifēro asiņu limfocītiem vai T šūnām no sekundāriem limfoīdiem orgāniem, peļu un cilvēku TIL ir lielāka tendence uzņemt glikozi (4, 39) un pakāpeniska mitohondriju funkcijas zudums (19, 40). Lai gan šajā pētījumā esam novērojuši līdzīgus rezultātus, galvenais sasniegums ir salīdzināt audzēja šūnu un TIL metabolismu no tiem pašiem rezekcētiem audzēja audiem. Saskaņā ar dažiem no šiem iepriekšējiem ziņojumiem, audzēja (CD45-EpCAM+) šūnām no ascīta un audzējiem ir lielāka glikozes uzņemšana nekā CD8+ un CD4+ T šūnām, kas apstiprina, ka audzēja šūnu augsto glikozes uzņemšanu var salīdzināt ar T šūnām. T šūnu konkurences koncepcija. TME. Tomēr audzēja šūnu mitohondriju aktivitāte ir augstāka nekā CD8+ T šūnām, bet mitohondriju aktivitāte ir līdzīga CD4+ T šūnām. Šie rezultāti apstiprina jauno domu, ka oksidatīvais metabolisms ir svarīgs audzēja šūnām (41, 42). Tie arī liecina, ka CD8+ T šūnas var būt jutīgākas pret oksidatīvo disfunkciju nekā CD4+ T šūnas vai ka CD4+ T šūnas var izmantot citus oglekļa avotus, nevis glikozi, lai uzturētu mitohondriju aktivitāti (43, 44). Jāatzīmē, ka ascītā mēs nenovērojām atšķirības glikozes uzņemšanā vai mitohondriju aktivitātē starp CD4+ T efektoršūnām, T efektora atmiņas šūnām un T centrālās atmiņas šūnām. Līdzīgi CD8+ T šūnu diferenciācijas stāvoklim audzējos nav nekāda sakara ar glikozes uzņemšanas izmaiņām, izceļot būtisko atšķirību starp in vitro kultivētām T šūnām un cilvēka TIL in vivo (22). Šos novērojumus apstiprināja arī objektīvas automātiskas šūnu populācijas sadales izmantošana, kas vēl vairāk atklāja, ka CD45+/CD3-/CD4+/CD45RO+ šūnas ar augstāku glikozes uzņemšanu un mitohondriju aktivitāti nekā audzēja šūnas ir izplatītas, bet tām ir vielmaiņas ziņā aktīva šūnu populācija. Šī populācija var atspoguļot mieloīdo supresoru šūnu vai plazmocitoīdo dendritisko šūnu iespējamo apakšpopulāciju, kas identificēta scRNA-seq analīzē. Lai gan abi šie gadījumi ir novēroti cilvēka olnīcu audzējos [45], joprojām ir nepieciešams turpmāks darbs, lai aprakstītu šo mieloīdo apakšpopulāciju.
Lai gan plūsmas citometrijas metodes var noskaidrot vispārējās glikozes un oksidatīvā metabolisma atšķirības starp šūnu tipiem, precīzi metabolīti, ko TME rada glikoze vai citi oglekļa avoti mitohondriju metabolismam, vēl nav noteikti. Lai piešķirtu metabolītu klātbūtni vai neesamību noteiktai TIL apakškopai, ir jāattīra šūnu populācija no izgrieztajiem audiem. Tādēļ mūsu šūnu bagātināšanas metode apvienojumā ar masas spektrometriju var sniegt ieskatu metabolītos, kas ir atšķirīgi bagātināti T šūnās un audzēja šūnu populācijās atbilstošos pacientu paraugos. Lai gan šai metodei ir priekšrocības salīdzinājumā ar fluorescences aktivizētu šūnu šķirošanu, noteiktas metabolītu bibliotēkas var tikt ietekmētas to raksturīgās stabilitātes un/vai straujās apgrozības ātruma dēļ (22). Tomēr mūsu metode spēja identificēt divus atpazīstamus imūnsupresīvus metabolītus - adenozīnu un kinurenīnu, jo tie ievērojami atšķiras starp paraugu veidiem.
Mūsu audzēju un TIL apakštipu metabonomiskā analīze sniedz plašāku ieskatu metabolītu lomā olnīcu TME. Pirmkārt, izmantojot plūsmas citometriju, mēs noteicām, ka mitohondriju aktivitātē nav atšķirības starp audzējiem un CD4+ T šūnām. Tomēr LC-MS/MS analīze atklāja būtiskas izmaiņas metabolītu daudzumā starp šīm populācijām, norādot, ka secinājumi par TIL metabolismu un tā kopējo metabolisma aktivitāti prasa rūpīgu interpretāciju. Otrkārt, MNA ir metabolīts ar vislielāko atšķirību starp CD45 šūnām un T šūnām ascītā, nevis audzējos. Tāpēc nodalīšanai un audzēja atrašanās vietai var būt atšķirīga ietekme uz TIL metabolismu, kas uzsver iespējamo heterogenitāti noteiktā mikrovidē. Treškārt, MNA producējošā enzīma NNMT ekspresija galvenokārt aprobežojas ar CAF, kas ir audzēja šūnas mazākā mērā, bet nosakāms MNA līmenis ir novērots no audzēja atvasinātās T šūnās. NNMT pārekspresijai olnīcu CAF ir zināma vēzi veicinoša iedarbība, daļēji pateicoties CAF metabolisma, audzēja invāzijas un metastāžu veicināšanai (27). Lai gan kopējais TIL līmenis ir mērens, NNMT ekspresija CAF ir cieši saistīta ar vēža genoma atlanta (TCGA) mezenhimālo apakštipu, kas ir saistīts ar sliktu prognozi (27, 46, 47). Visbeidzot, arī enzīma AOX1, kas ir atbildīgs par MNA degradāciju, ekspresija ir ierobežota ar CAF populāciju, kas norāda, ka T šūnām trūkst spējas metabolizēt MNA. Šie rezultāti apstiprina domu, ka, lai gan ir nepieciešams turpmāks darbs, lai pārbaudītu šo atklājumu, augsts MNA līmenis T šūnās var liecināt par imūnsupresīvas CAF mikrovides klātbūtni.
Ņemot vērā MNA transporteru zemo ekspresijas līmeni un galveno MNA metabolismā iesaistīto olbaltumvielu nenosakāmo līmeni, MNA klātbūtne T šūnās ir negaidīta. Ne NNMT, ne AOX1 nevarēja noteikt ar scRNA-seq analīzi un mērķtiecīgu kvantitatīvo sekvenci divās neatkarīgās kohortās. Šie rezultāti liecina, ka MNA netiek sintezēta T šūnās, bet gan absorbēta no apkārtējās TME. In vitro eksperimenti liecina, ka T šūnām ir tendence uzkrāt eksogēnu MNA.
Mūsu in vitro pētījumi ir parādījuši, ka eksogēnā MNA inducē TNFα ekspresiju T šūnās un pastiprina Sp1 saistīšanos ar TNFα promotoru. Lai gan TNFα piemīt gan pretvēža, gan pretvēža funkcijas, olnīcu vēža gadījumā TNFα var veicināt olnīcu vēža augšanu (31–33). TNFα neitralizācija olnīcu audzēja šūnu kultūrā vai TNFα signāla eliminācija peļu modeļos var uzlabot TNFα mediētu iekaisuma citokīnu veidošanos un kavēt audzēja augšanu (32, 35). Tādēļ šajā gadījumā no TME atvasinātā MNA var darboties kā iekaisumu veicinošs metabolīts, izmantojot no TNFα atkarīgu mehānismu caur autokrīnu cilpu, tādējādi veicinot olnīcu vēža rašanos un izplatīšanos (31). Pamatojoties uz šo iespēju, TNFα blokāde tiek pētīta kā potenciāls terapeitisks līdzeklis olnīcu vēža ārstēšanai (37, 48, 49). Turklāt MNA vājina CAR-T šūnu citotoksicitāti pret olnīcu audzēja šūnām, sniedzot papildu pierādījumus par MNA mediētu imūnsupresiju. Kopumā šie rezultāti liecina par modeli, kurā audzēji un CAF šūnas izdala MNA ekstracelulārā TME. Ar (i) TNF izraisītu olnīcu vēža augšanas stimulāciju un (ii) MNA izraisītu T šūnu citotoksiskās aktivitātes inhibīciju tam var būt divējāda ietekme uz audzēju (5.D attēls).
Noslēgumā jāsaka, ka, pielietojot ātras šūnu bagātināšanas, atsevišķu šūnu sekvencēšanas un metabolisma profilēšanas kombināciju, šis pētījums atklāja milzīgas imunometabolomiskās atšķirības starp audzējiem un ascīta šūnām HGSC pacientiem. Šī visaptverošā analīze parādīja, ka pastāv atšķirības glikozes uzņemšanā un mitohondriju aktivitātē starp T šūnām, un identificēja MNA kā nešūnu autonomu imūnregulatoru metabolītu. Šie dati ietekmē to, kā TME ietekmē T šūnu metabolismu cilvēka vēža gadījumos. Lai gan ir ziņots par tiešu konkurenci par barības vielām starp T šūnām un vēža šūnām, metabolīti var darboties arī kā netieši regulatori, lai veicinātu audzēja progresēšanu un, iespējams, nomāktu endogēnās imūnās atbildes. Šo regulējošo metabolītu funkcionālās lomas sīkāks apraksts varētu pavērt alternatīvas stratēģijas pretvēža imūnās atbildes pastiprināšanai.
Pacientu paraugi un klīniskie dati tika iegūti, izmantojot BC vēža audzēja audu krātuvi, ko sertificējis Kanādas Audu krātuvju tīkls. Saskaņā ar BC Vēža pētījumu ētikas komitejas un Britu Kolumbijas Universitātes apstiprināto protokolu (H07-00463), no visiem pacientu paraugiem un klīniskajiem datiem tika iegūta informēta rakstiska piekrišana vai arī tika oficiāli atteikta piekrišana. Paraugi tiek glabāti sertificētā BioBank (BRC-00290). Detalizēta pacientu raksturojums ir parādīts S1 un S5 tabulās. Kriokonservācijai pacienta audzēja paraugu mehāniski sadala ar skalpeli un pēc tam izspiež to caur 100 mikronu filtru, lai iegūtu vienas šūnas suspensiju. Pacienta ascīts tika centrifugēts ar ātrumu 1500 apgr./min 10 minūtes 4°C temperatūrā, lai iegūtu šūnu granulācijas un noņemtu supernatantu. No audzēja un ascīta iegūtās šūnas tika kriokonservētas 50% termiski inaktivētā cilvēka AB serumā (Sigma-Aldrich), 40% RPMI-1640 (Thermo Fisher Scientific) un 10% dimetilsulfoksīdā. Šīs konservētās vienšūnu suspensijas tika atkausētas un izmantotas metabolomikai un metabolītu noteikšanai, kas aprakstīta turpmāk.
Pilnīgā barotne sastāv no 0,22 μm filtrēta 50:50 papildināta RPMI 1640:AimV. RPMI 1640 + 2,05 mM l-glutamīns (Thermo Fisher Scientific), papildināts ar 10% termiski inaktivēta cilvēka AB seruma (Sigma-Aldrich), 12,5 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific), 2 mM l-glutamīna (Thermo Fisher Scientific) Fisher Scientific), 1 x penicilīna streptomicīna (PenStrep) šķīduma (Thermo Fisher Scientific) un 50 μMB-merkaptoetanola. AimV (Invitrogen) ir papildināts ar 20 mM Hepes (Thermo Fisher Scientific) un 2 mM l-glutamīnu (Thermo Fisher Scientific). Plūsmas citometra krāsošanas buferšķīdums sastāvēja no 0,22 μm filtrēta fosfātu buferēta fizioloģiskā šķīduma (PBS; Invitrogen), papildināts ar 3% termiski inaktivēta AB cilvēka seruma (Sigma). Šūnu bagātināšanas buferšķīdums sastāv no 0,22 μm filtrēta PBS un papildināts ar 0,5% ar siltumu inaktivēta cilvēka AB seruma (Sigma-Aldrich).
37°C pilnīgā vidē šūnas 30 minūtes iekrāsoja ar 10 nM MT DR un 100 μM 2-NBDG. Pēc tam šūnas 15 minūtes iekrāsoja ar dzīvotspējas krāsvielu eF506 4°C temperatūrā. Šūnas atkārtoti suspendēja FC blokā (eBioscience) un Brilliant Stain buferšķīdumā (BD Biosciences), atšķaidīja plūsmas citometra krāsošanas buferšķīdumā (saskaņā ar ražotāja norādījumiem) un inkubēja 10 minūtes istabas temperatūrā. Šūnas 20 minūtes iekrāsoja plūsmas citometrijas krāsošanas buferšķīdumā ar antivielu komplektu (S2 tabula). Pirms analīzes šūnas atkārtoti suspendēja plūsmas citometrijas krāsošanas buferšķīdumā (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurācija). Šūnu skaita datu analīzei izmantojiet SpectroFlo un FlowJo V10, bet datu izveidei izmantojiet GraphPad Prism 8. 2-NBDG un MT DR vidējā fluorescences intensitāte (MFI) tika normalizēta logaritmiski, un pēc tam statistiskajai analīzei tika izmantots pāru t tests, lai ņemtu vērā atbilstošus pacientus. No analīzes izņemiet visas populācijas ar mazāk nekā 40 notikumiem; pirms statistiskās analīzes un datu vizualizācijas ievadiet MFI vērtību 1 jebkurām negatīvām vērtībām.
Lai papildinātu iepriekš minētā procesa paneļa manuālās vārtēšanas stratēģiju, mēs izmantojām pilnu anotāciju, izmantojot formas ierobežojumu koku (FAUST) (21), lai automātiski piešķirtu šūnas populācijai pēc mirušo šūnu likvidēšanas FlowJo. Mēs manuāli pārvaldām izvadi, lai apvienotu populācijas, kas šķiet nepareizi sadalītas (apvienojot PD1+ ar PD1-audzēja šūnām), un saglabātās populācijas. Katrs paraugs satur vidēji vairāk nekā 2% šūnu, kopā 11 populācijas.
Lai atdalītu PBMC no leikocītu atdalīšanas produktiem (STEMCELL Technologies), tika izmantota Ficoll gradienta blīvuma centrifugēšana. CD8+ T šūnas tika izolētas no PBMC, izmantojot CD8 MicroBeads (Miltenyi), un 2 nedēļas saskaņā ar ražotāja norādījumiem paplašinātas pilnā vidē, izmantojot TransAct (Miltenyi). Šūnas tika atstātas 5 dienas pilnā vidē, kas saturēja IL-7 (10 ng/ml; PeproTech), un pēc tam atkārtoti stimulētas ar TransAct. 7. dienā saskaņā ar ražotāja norādījumiem cilvēka CD45 MicroBeads (Miltenyi) tika izmantotas šūnu bagātināšanai trīs secīgās kārtās. Šūnas tika sadalītas alikvotās daļās plūsmas citometrijas analīzei (kā aprakstīts iepriekš), un viens miljons šūnu tika sadalītas trīs reizes alikvotās daļās LC-MS/MS analīzei. Paraugi tika apstrādāti ar LC-MS/MS, kā aprakstīts tālāk. Trūkstošā metabolīta vērtību mēs novērtējām ar jonu skaitu 1000. Katrs paraugs tiek normalizēts ar kopējo jonu skaitu (TIC), logaritmiski konvertēts un automātiski normalizēts MetaboAnalystR pirms analīzes.
Katra pacienta atsevišķo šūnu suspensija tika atkausēta un filtrēta caur 40 μm filtru pilnīgā vidē (kā aprakstīts iepriekš). Saskaņā ar ražotāja protokolu, paraugu bagātināšanai ar CD8+, CD4+ un CD45- šūnām (uz ledus) tika izmantotas trīs secīgas pozitīvās atlases kārtas ar magnētisko lodīšu atdalīšanu, izmantojot MicroBeads (Miltenyi). Īsāk sakot, šūnas tiek atkārtoti suspendētas šūnu bagātināšanas buferšķīdumā (kā aprakstīts iepriekš) un saskaitītas. Šūnas tika inkubētas ar cilvēka CD8 lodītēm, cilvēka CD4 lodītēm vai cilvēka CD45 lodītēm (Miltenyi) 4°C temperatūrā 15 minūtes un pēc tam mazgātas ar šūnu bagātināšanas buferšķīdumu. Paraugs tiek izvadīts caur LS kolonnu (Miltenyi), un pozitīvās un negatīvās frakcijas tiek savāktas. Lai samazinātu ilgumu un maksimāli palielinātu šūnu atgūšanas posmu, CD8 frakcija tiek izmantota otrajā CD4+ bagātināšanas kārtā, bet CD4 frakcija tiek izmantota turpmākajā CD45 bagātināšanā. Šķīdums tiek turēts uz ledus visa atdalīšanas procesa laikā.
Lai sagatavotu paraugus metabolītu analīzei, šūnas vienu reizi mazgāja ar ledusaukstu sāls šķīdumu, un katram paraugam pievienoja 1 ml 80% metanola, pēc tam kratīja vorteksā un ātri sasaldēja šķidrā slāpeklī. Paraugi tika pakļauti trim sasaldēšanas-atkausēšanas cikliem un centrifugēti ar ātrumu 14 000 apgr./min 15 minūtes 4°C temperatūrā. Virsotni, kas satur metabolītus, iztvaicē, līdz tas ir sauss. Metabolītus atkārtoti izšķīdināja 50 μl 0,03% skudrskābes, kratīja vorteksā, lai sajauktos, un pēc tam centrifugēja, lai atdalītu gružus.
Ekstrahējiet metabolītus, kā aprakstīts iepriekš. Pārnesiet supernatantu uz augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas pudeli metabolomikas pētījumiem. Izmantojiet nejaušas apstrādes protokolu, lai katru paraugu apstrādātu ar līdzīgu šūnu skaitu, lai novērstu partijas efektus. Mēs veicām globālo metabolītu kvalitatīvu novērtējumu, kas iepriekš publicēts AB SCIEX QTRAP 5500 trīskāršā kvadrupola masas spektrometrā (50). Hromatogrāfiskā analīze un pīķa laukuma integrācija tika veikta, izmantojot MultiQuant 2.1 versijas programmatūru (Applied Biosystems SCIEX).
Lai novērtētu trūkstošo metabolīta vērtību, tika izmantots jonu skaits 1000, un katra parauga TIC tika izmantots, lai aprēķinātu katra noteiktā metabolīta normalizēto pīķa laukumu, lai koriģētu izmaiņas, kas ieviesušās instrumentālās analīzes rezultātā paraugu apstrādes laikā. Pēc TIC normalizēšanas logaritmiskai konversijai un automātiskai normu līnijas mērogošanai tiek izmantots MetaboAnalystR(51) (noklusējuma parametrs). Mēs izmantojām PCA ar vegan R pakotni, lai veiktu metabolomu atšķirību izpētes analīzi starp paraugu veidiem, un izmantojām daļējas redundances analīzi pacientu analīzei. Izmantojām Varda metodi, lai izveidotu siltuma kartes dendrogrammu, lai grupētu Eiklīda attālumu starp paraugiem. Mēs izmantojām limmu (52) standartizētam metabolītu daudzumam, lai identificētu atšķirīgi bagātīgus metabolītus visā šūnu tipā un mikrovidē. Lai vienkāršotu skaidrojumu, modeļa precizēšanai izmantojām grupas vidējo parametru un kā katru grupu (n = 6 grupas) ņēmām vērā šūnu tipus mikrovidē; nozīmīguma pārbaudei katram metabolītam veicām trīs atkārtotus mērījumus. Lai izvairītos no kļūdainas replikācijas, pacients tika iekļauts limmas dizainā kā šķērslis. Lai pārbaudītu metabolītu atšķirības starp dažādiem pacientiem, mēs pielāgojām limmas modeli, iekļaujot pacientus fiksētā veidā. Mēs ziņojam par iepriekš noteiktā kontrasta nozīmīgumu starp šūnu tipu un mikrovidi Padj <0,05 (Benjamini-Hohberga korekcija).
Pēc vigor bagātināšanas, izmantojot Miltenyi mirušo šūnu noņemšanas komplektu (>80% dzīvotspēja), tika veikta atsevišķu šūnu transkriptomas sekvencēšana kopējiem dzīviem saldētiem ascīta un audzēja paraugiem, izmantojot 10x 5′gēnu ekspresijas protokolu. Tika analizēti pieci gadījumi ar atbilstošiem audzējiem un ascītu, lai gan viena audzēja parauga zemā dzīvotspēja neļāva to iekļaut. Lai panāktu vairāku pacientu atlasi, mēs apvienojām katra pacienta paraugus 10x hroma kontrollera joslās un analizējām ascīta un audzēja vietas atsevišķi. Pēc sekvencēšanas [Illumina HiSeq 4000 28×98 bp pāra gals (PE), Kvebekas genoms; vidēji 73 488 un 41 378 lasījumi uz šūnu audzējam un ascītam]], mēs izmantojām CellSNP un Vireo (53) (pamatojoties uz CellSNP, jo GRCh38 nodrošinātajam kopējam cilvēka SNP (VCF) tiek piešķirta donora identitāte. Mēs izmantojam SNPRelate, lai secinātu pacienta genotipa statusa (IBS) tuvāko identitāti (IBS), izslēdzot nepiešķirtās šūnas un šūnas, kas identificētas kā dupleksi, un saskaņojot donorus starp ascīta un audzēja paraugiem (54). Pamatojoties uz šo uzdevumu, mēs saglabājām trīs gadījumus ar bagātīgu šūnu pārstāvniecību audzējā un ascītā lejupējai analīzei. Pēc masas filtrācijas veikšanas scatter (55) un scran (56) BioConductor iepakojumā analīzei tika iegūtas 6975 šūnas (attiecīgi 2792 un 4183 šūnas no audzēja un ascīta). Mēs izmantojam igraph (57) Louvain koplietotā tuvākā kaimiņa tīkla (SNN) klasterizāciju, pamatojoties uz Žakarda attālumu līdz klastera šūnām pēc ekspresijas. Klasteri tika manuāli anotēti iespējamiem šūnu tipiem, pamatojoties uz marķieru gēnu ekspresiju, un vizualizēti ar t-SNE. Citotoksiskās T šūnas tiek definētas pēc CD8A un GZMA ekspresijas, izslēdzot apakšklasterus ar zemu ribosomu proteīnu ekspresiju. Mēs piekļuvām Izara et al. (16) publicētajiem datiem, tostarp to t-SNE iegulšanai, kas var kontrolēt ekspresijas pārklāšanos starp imūnšūnu marķieriem un NNMT ekspresiju.
PBMC tika atdalītas no leikocītu atdalīšanas produktiem (STEMCELL Technologies), izmantojot Ficoll gradienta blīvuma centrifugēšanu. CD3+ šūnas tika izolētas no PBMC, izmantojot CD3 lodītes (Miltenyi). MNA klātbūtnē vai bez tās CD3+ šūnas tika aktivizētas ar pie plates piesaistītu CD3 (5μg/ml), šķīstošo CD28 (3μg/ml) un IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pēdējā pavairošanas dienā dzīvotspēja (fiksējamā dzīvotspējas krāsviela eFluor450, eBioscience) un proliferācija (123count eBeads, Thermo Fisher Scientific) tika novērtēta ar plūsmas citometriju. Efektora funkciju novērtē, stimulējot šūnas ar PMA (20 ng/ml) un jonomicīnu (1 μg/ml) ar GolgiStop 4 stundas, un uzrauga CD8-PerCP (RPA-T8, BioLegend), CD4-AF700 (RPA-T4), BioLegend) un TNFα-fluoresceīna izotiocianātu (FITC) (MAb11, BD). Stimulē kvantitatīvās PĶR un ChIP šūnas ar PMA (20 ng/ml) un jonomicīnu (1 μg/ml) 4 stundas. ELISA supernatants tika savākts pirms un pēc stimulācijas ar PMA (20 ng/ml) un jonomicīnu (1 μg/ml) 4 stundas.
Lai izolētu RNS, izmantojot RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN), ievērojiet ražotāja protokolu. Parauga homogenizēšanai izmantojiet QIAshredder (QIAGEN). Komplementārās DNS (kDNS) sintezēšanai izmantojiet augstas kapacitātes RNS-kDNS komplektu (Thermo Fisher Scientific). Gēnu ekspresijas kvantitatīvai noteikšanai (saskaņā ar ražotāja protokolu) izmantojiet TaqMan Rapid Advanced Master Mix (Thermo Fisher Scientific) ar šādām zondēm: Hs00196287_m1 (NNMT), Hs00154079_m1 (AOX1), Hs00427552_m1 (SLC22A1), Hs02786624_g1 [gliceraldehīda-3-fosfāts bez ūdeņraža (GAPDH)] un Hs01010726_m1 (SLC22A2). Paraugi tika analizēti reāllaika PCR sistēmā StepOnePlus (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) MicroAmp ātrās optiskās 96 iedobju reakcijas plāksnē (Applied Biosystems) ar MicroAmp optisko plēvi. Jebkura Ct vērtība, kas pārsniedz 35, tiek uzskatīta par virs noteikšanas sliekšņa un tiek atzīmēta kā nenosakāma.
Veiciet ChIP, kā aprakstīts iepriekš (58). Īsumā, šūnas tika apstrādātas ar formaldehīdu (galīgā koncentrācija 1,42%) un inkubētas istabas temperatūrā 10 minūtes. Izmantojiet papildinātu uzbriedināšanas buferšķīdumu (25 mM Hepes, 1,5 mM MgCl2, 10 mM KCl un 0,1% NP-40) uz ledus 10 minūtes, pēc tam atkārtoti suspendējiet imunoprecipitācijas buferšķīdumā, kā aprakstīts (58). Pēc tam paraugu apstrādāja ar ultraskaņu, izmantojot šādus ciklus: 10 cikli (20 1 sekundes impulsi) un statisko laiku 40 sekundes. Inkubējiet ChIP klases imūnglobulīnu G (Cell Signaling Technology; 1μl), histonu H3 (Cell Signaling Technology; 3μl), NFAT (Invitrogen; 3μl) un SP1 (Cell Signaling Technology; 3μl) antivielas ar paraugu 4°C temperatūrā, kratot nakti. Inkubējiet proteīna A lodītes (Thermo Fisher Scientific) ar paraugu 4°C temperatūrā, viegli kratot 1 stundu, pēc tam izmantojiet chelex lodītes (Bio-Rad), lai bagātinātu DNS, un izmantojiet proteināzi K (Thermo Fisher) proteīnu šķelšanai. TNFα promotors tika noteikts ar PCR: uz priekšu, GGG TAT CCT TGA TGC TTG TGT; pretēji, GTG CCA ACA ACT GCC TTT ATA TG (207 bp produkts). Attēlus ģenerēja Image Lab (Bio-Rad) un kvantificēja, izmantojot ImageJ programmatūru.
Šūnu kultūras supernatants tika savākts, kā aprakstīts iepriekš. Noteikšana tika veikta saskaņā ar cilvēka TNFα ELISA komplekta (Invitrogen), cilvēka IL-2 ELISA komplekta (Invitrogen) un cilvēka IFN-γ ELISA komplekta (Abcam) ražotāja procedūrām. Saskaņā ar ražotāja protokolu supernatants tika atšķaidīts 1:100, lai noteiktu TNFα un IL-2, un 1:3, lai noteiktu IFN-γ. Absorbcijas mērīšanai pie 450 nm tika izmantots EnVision 2104 Multilabel Reader (PerkinElmer).
PBMC tika atdalītas no leikocītu atdalīšanas produktiem (STEMCELL Technologies), izmantojot Ficoll gradienta blīvuma centrifugēšanu. CD3+ šūnas tika izolētas no PBMC, izmantojot CD3 lodītes (Miltenyi). MNA klātbūtnē vai bez tās CD3+ šūnas 3 dienas tika aktivizētas ar pie plates piesaistītu CD3 (5 μg/ml), šķīstošo CD28 (3 μg/ml) un IL-2 (300 U/ml; Proleukin). Pēc 3 dienām šūnas tika savāktas un mazgātas ar 0,9% fizioloģisko šķīdumu, un nogulsnes tika ātri sasaldētas. Šūnu skaitīšana tika veikta ar plūsmas citometriju (Cytek Aurora; 3L-16V-14B-8R konfigurācija), izmantojot 123count eBeads.
Ekstrahējiet metabolītus, kā aprakstīts iepriekš. Žāvētais ekstrakts tika atšķaidīts koncentrācijā 4000 šūnu ekvivalenti/μl. Analizējiet paraugu, izmantojot apgrieztās fāzes hromatogrāfiju (1290 Infinity II, Agilent Technologies, Santa Clara, CA) un CORTECS T3 kolonnu (2,1 × 150 mm, daļiņu izmērs 1,6 μm, poru izmērs 120 Å; #186008500, Waters). Polārais masas spektrometrs (6470, Agilent), kurā elektroizsmidzināšanas jonizācija darbojas pozitīvā režīmā. Mobilā fāze A ir 0,1% skudrskābe (H2O), mobilā fāze B ir 90% acetonitrils, 0,1% skudrskābe. LC gradients ir no 0 līdz 2 minūtēm 100% A, no 2 līdz 7,1 minūtēm 99% B un no 7,1 līdz 8 minūtēm 99% B. Pēc tam kolonnu atkārtoti līdzsvaro ar mobilo fāzi A ar plūsmas ātrumu 0,6 ml/min 3 minūtes. Plūsmas ātrums ir 0,4 ml/min, un kolonnas kameru uzkarsē līdz 50°C. Izmantojiet MNA tīro ķīmisko standartu (M320995, Toronto Research Chemical Company, North York, Ontario, Kanāda), lai noteiktu aiztures laiku (RT) un transformāciju (RT = 0,882 minūtes, 1. transformācija = 137→94,1, 2. transformācija = 137→92, 3. konversija = 137→78). Ja visas trīs pārejas notiek pareizajā aiztures laikā, kvantitatīvai noteikšanai izmanto 1. pāreju, lai nodrošinātu specifiskumu. MNA (Toronto Research Chemical Company) standarta līkne tika ģenerēta, veicot sešas standarta šķīduma (1 mg/ml) sērijveida atšķaidīšanas, lai iegūtu standartus attiecīgi ar 0,1, 1,0, 10 un 100 ng/ml un 1,0 un 10 μg/ml šķidruma koncentrāciju. Noteikšanas robeža ir 1 ng/ml, un lineārā reakcija ir no 10 ng/ml līdz 10 μg/ml. Katra divu mikrolitru parauga un standarta injekcija tiek izmantota LC/MS analīzei, un ik pēc astoņām injekcijām tiek veikts jaukts kvalitātes kontroles paraugs, lai nodrošinātu analīzes platformas stabilitāti. Visu ar MNA apstrādāto šūnu paraugu MNA atbildes reakcijas bija testa lineārajā diapazonā. Datu analīze tika veikta, izmantojot MassHunter kvantitatīvās analīzes programmatūru (v9.0, Agilent).
Otrās paaudzes αFR-CAR konstrukcija tika aizgūta no Song et al. (59). Īsumā, konstrukcija satur sekojošo: CD8a vadošo secību, cilvēka αFR specifisko vienas ķēdes mainīgo fragmentu, CD8a eņģes un transmembrānas reģionu, CD27 intracelulāro domēnu un CD3z intracelulāro domēnu. Pilnīgā CAR secība tika sintezēta ar GenScript un pēc tam klonēta otrās paaudzes lentivīrusu ekspresijas vektorā augšpus GFP ekspresijas kasetes, ko izmantoja transdukcijas efektivitātes novērtēšanai.
Lentivīrusu iegūst, transfekējot HEK293T šūnas [Amerikas tipu kultūru kolekcija (ATCC); audzētas Dulbeko modificētā Īgla vidē, kas satur 10% fetālā liellopu seruma (FBS) un 1% PenStrep, un izmantojot CAR-GFP vektoru, un iepakošanas plazmīdās (psPAX2 un pMD2.G, Addgene) tiek izmantots lipofekcijas amīns (Sigma-Aldrich). Vīrusu saturošais supernatants tika savākts 48 un 72 stundas pēc transfekcijas, filtrēts un koncentrēts ar ultracentrifugēšanu. Koncentrēto vīrusa supernatantu uzglabāt -80°C temperatūrā līdz transdukcijai.
PBMC tiek atdalītas no veselu donoru leikocītu atdalīšanas produktiem (STEMCELL Technologies), izmantojot Ficoll gradienta blīvuma centrifugēšanu. Izmantojiet pozitīvas selekcijas CD8 mikropērlītes (Miltenyi), lai izolētu CD8+ šūnas no PBMC. Stimulējiet T šūnas ar TransAct (Miltenyi) un TexMACS vidē [Miltenyi; papildināta ar 3% termiski inaktivēta cilvēka seruma, 1% PenStrep un IL-2 (300 U/ml)]. Divdesmit četras stundas pēc stimulācijas T šūnas tika transducētas ar lentivīrusu (10 μl koncentrēta vīrusa supernatāta uz 106 šūnām). 1 līdz 3 dienas pēc transdukcijas uz Cytek Aurora (uz FSC (uz priekšu izkliedes)/SSC (sānu izkliedes), Singlet, GFP+) novērtējiet šūnu GFP ekspresiju, lai pierādītu vismaz 30% transdukcijas efektivitāti.
CAR-T šūnas tika kultivētas 24 stundas Immunocult vidē (STEMCELL Technologies; papildināts ar 1% PenStrep) šādos apstākļos: neapstrādātas, apstrādātas ar 250 μM adenozīnu vai 10 mM MNA. Pēc pirmapstrādes CAR-T šūnas tika mazgātas ar PBS un apvienotas ar 20 000 SK-OV-3 šūnām [ATCC; McCoy 5A vidē (Sigma-Aldrich), kas papildināta ar 10% FBS un 1% PenStrep, pie 10: Efektora un mērķa attiecība 1 tika amplificēta trīs reizes papildinātā Immunocult vidē. SK-OV-3 šūnas un SK-OV-3 šūnas, kas lizētas ar digitalis saponīnu (0,5 mg/ml; Sigma-Aldrich), tika izmantotas kā negatīvas un pozitīvas kontroles. Pēc 24 stundu kopīgas kultivēšanas supernatants tika savākts un laktātdehidrogenāzes (LDH) līmenis tika mērīts saskaņā ar ražotāja norādījumiem (LDH Glo citotoksicitātes noteikšanas komplekts, Promega). LDH supernatants tika atšķaidīts LDH buferšķīdumā proporcijā 1:50. Nogalināšanas procentuālā daļa tika mērīta, izmantojot šādu formulu: nogalināšanas procentuālā daļa = korekcijas procentuālā daļa / maksimālā nogalināšanas pakāpe x 100%, kur korekcijas procentuālā daļa = tikai T šūnu kopkultūra un maksimālā nogalināšanas pakāpe = pozitīvā kontrole-negatīvā kontrole.
Kā aprakstīts tekstā vai materiālos un metodēs, statistiskajai analīzei izmantojiet GraphPad Prism 8, Microsoft Excel vai R v3.6.0. Ja no viena pacienta tiek savākti vairāki paraugi (piemēram, ascīts un audzējs), mēs izmantojam pāru t testu vai iekļaujam pacientu kā nejaušu efektu lineārā vai vispārinātā modelī atkarībā no piemērotības. Metabolomikas analīzei svarīguma tests tiek veikts trīs reizes.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/4/eabe1174/DC1.
Šis ir brīvas piekļuves raksts, kas izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution-NonCommercial licences noteikumiem, kas atļauj tā izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja vien galīgais pielietojums nav paredzēts komerciālam ieguvumam un ja vien oriģināldarbs ir pareizs. Atsauce.
Piezīme. Lūdzam norādīt savu e-pasta adresi tikai tāpēc, lai persona, kuru iesakāt lapai, zinātu, ka vēlaties, lai tā redzētu e-pastu un ka tas nav surogātpasts. Mēs neiegūsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sāra Makfersone (Sāra Makfersone), Laurena G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Džons Stags (Džons Stags), Breds H. Nelsons (Brad H. Nelson), Breds H. Nelsons (Brad H. Nelson), Rals JB Dealfs, Rals J.B. G. Džounss (Russell G. Jones), Fineass T. Hamiltons (Phineas T.
MNA veicina T šūnu imūnsupresiju un ir potenciāls imunoterapijas mērķis cilvēka vēža ārstēšanai.
Marisa K. Kilgour (Marisa K. Kilgour), Sāra Makfersone (Sāra Makfersone), Laurena G. Zacharias (Lauren G. Zacharias), Abigail Eli Aris G. Watson (H. Watson), Džons Stags (Džons Stags), Breds H. Nelsons (Brad H. Nelson), Breds H. Nelsons (Brad H. Nelson), Rals JB Dealfs, Rals J.B. G. Džounss (Russell G. Jones), Fineass T. Hamiltons (Phineas T.
MNA veicina T šūnu imūnsupresiju un ir potenciāls imunoterapijas mērķis cilvēka vēža ārstēšanai.
©2021 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija. visas tiesības paturētas. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.