Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Atšķirībā no mugurkaulniekiem, tiek plaši uzskatīts, ka kukaiņiem trūkst tēviņiem raksturīgu dzimumsteroīdu hormonu. Anopheles gambiae ekdizona steroīds 20-hidroksiekdizons (20E), šķiet, ir attīstījies, lai kontrolētu olu attīstību, kad to sintezē mātītes2, un izraisītu pārošanās refraktāro periodu, kad to seksuāli pārnes tēviņi3. Tā kā olu attīstība un pārošanās ir būtiskas reproduktīvās īpašības, izpratne par to, kā Anopheles odu mātītes integrē šos hormonālos signālus, varētu atvieglot jaunu malārijas kontroles programmu izstrādi. Šeit mēs atklājam, ka šīs reproduktīvās funkcijas regulē atšķirīgi dzimumsteroīdi, izmantojot sarežģītu ekdisteroīdus aktivizējošu/inaktivējošu enzīmu tīklu. Mēs identificējām tēviņiem specifisku oksidētu ekdizonu, 3-dehidro-20E (3D20E), kas aizsargā vecākus, izslēdzot mātīšu seksuālo uztveramību pēc seksuālas pārneses un aktivācijas ar defosforilēšanu. Jāatzīmē, ka 3D20E pārnešana arī inducēja reproduktīvo gēnu ekspresiju, kas uztur olu attīstību Plasmodium infekcijas laikā, nodrošinot inficēto mātīšu veselību. No mātītēm iegūtais 20E neizraisa seksuālu reakciju, bet ļauj pārojošies indivīdiem dēj olas pēc tam, kad 20E inhibējošās kināzes ir inhibētas. Šī tēviņiem specifiskā kukaiņu steroīdu hormona identificēšana un tā loma mātīšu seksuālās uztveres, auglības un mijiedarbības ar Plasmodium regulēšanā liecina par potenciālu samazināt malāriju pārnēsājošo odu reproduktīvos panākumus.
Malārijas gadījumu un nāves gadījumu skaits atkal pieaug4 plaši izplatītās Anopheles odu, vienīgo cilvēku malārijas parazītu pārnēsātāju, insekticīdu rezistences dēļ. Šo odu vairošanās bioloģija ir īpaši pievilcīgs mērķis jaunām malārijas kontroles intervencēm, jo ​​mātītes pārojas tikai vienu reizi5; padarot šo vienreizējo pārošanās gadījumu sterilu, būtu liels potenciāls samazināt odu populācijas dabā.
Sievietes kļūst seksuāli nespējīgas pēc tam, kad no vīriešiem saņem augsta titra steroīdu hormonus. Pētījumi liecina, ka turpmākas pārošanās grūtības izraisa 20-hidroksiekdizons (20E), steroīds hormons, kas labāk pazīstams kā spalvu mešanas cikla regulators kāpuru stadijā. Tēviņu spēja sintezēt un pārnest 20E ir attīstījusies īpaši Anopheles sugās, kas pieder pie Cellia7 apakšģints, kas ir izplatīta Āfrikā un ietver visbīstamākos malārijas pārnēsātājus, tostarp Anopheles gambiae. Tas ir īpaši jāatzīmē, jo šo sugu mātītes arī pēc katras asins ēdienreizes ražo 20E, un 20E vada oogenēzes ciklu (sk. 8. atsauci). Tomēr maz ir zināms par to, kā mātītes integrē signālus no diviem dažādiem ekdizona avotiem (tēviņu pārnešana un asins barošanas indukcija), neapdraudot savu spēju pāroties. Faktiski, ja mātīšu ražotais 20E izraisa seksuālu neiecietību, tas novedīs pie neauglības neapstrādātiem īpatņiem, kas ir ļoti izplatīta uzvedība šiem odiem5.
Iespējamais izskaidrojums ir tāds, ka A. gambiae tēviņi pārnes modificētu tēviņiem specifisku ekdizonu, kas aktivizē signālu kaskādi mātītes reproduktīvajā traktā, kā rezultātā rodas pārošanās nestabilitāte. Tomēr, lai gan mugurkaulniekiem ir vairāki steroīdu hormoni, piemēram, estrogēns un androgēns (pārskatīts 9. atsaucē), mūsuprāt, kukaiņos nav identificēti androgēnu ietekmējoši steroīdi.
Mēs nolēmām noteikt steroīdu hormonu repertuāru seksuāli nobriedušas A. gambiae tēviņa palīgdziedzerī (MAG), meklējot iespējamus modificējošus steroīdus. Izmantojot augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju apvienojumā ar tandēma masas spektrometriju (HPLC-MS/MS), nevis iepriekš izmantoto mazāk specifisko metodi, mēs šajos audos atklājām ekdizonu (E) un 20E, apstiprinot iepriekšējo rezultātu. Tomēr paraugā dominēja oksidēti fosforilēti steroīdi, kas atbilst formulai 3-dehidro-20E-22-fosfāts (3D20E22P)12 (1. attēls). Citas formas ietver 3-dehidro-20E (3D20E) un 20E-22-fosfātu (20E22P). 3D20E22P HPLC-MS/MS signāla intensitāte bija par divām lieluma kārtām augstāka nekā tā defosforilētajai formai 3D20E un par trim lieluma kārtām augstāka nekā E un 20E (1. attēls). Lai gan citās ķermeņa daļās un apakšējā reproduktīvajā traktā (LRT; paplašināti dati, 1. attēls) 1.a). Mēs analizējām arī ekdisteroīdus nesen apaugļojušos (<1 dienu veciem) tēviņiem un mātītēm un MAG atklājām tikai 3D20E un 3D20E22P; E, 20E un 20E22P bija sastopami abos dzimumos (paplašinātie dati, 1.b att.). Šie dati liecina, ka A. gambiae pieauguši tēviņi savos MAG producē augstu modificējošo hormonu titru, ko mātītes nesintezē.
MAG un mātīšu LRT (ieskaitot priekškambarus, sēklas pūslīšus un parovāriju) tika atdalīti no 4 dienas veciem (4 dienas veciem) neapstrādātiem tēviņiem un neapstrādātām un pārotām mātītēm (0,5, 3 un 12 hpm). Ekdizons šajos audos tika analizēts ar HPLC-MS/MS (vidējais ± standartnovirze; nepāra t-tests, divpusējs, koriģēts kļūdainu atklāšanas biežums (FDR); NS, nav statistiski nozīmīgs; *P < 0,05, **P < 0,01. 3D20E: 3 stundas pret 0,5 stundām, P = 0,035; 12 stundas pret 3 stundām, P = 0,0015; 12 stundas pret 0,5 stundām, P = 0,030. 3D20E22P: 3 stundas pret 0,5 stundām, P = 0,25; 12 stundas pret 3 stundām, P = 0,0032; 12 stundas pret 0,5 stundām, P = 0,015). Dati ir iegūti no trim bioloģiskiem atkārtojumiem. Katra interesējošā ekdizona pīķa laukums tika aprēķināts un normalizēts ar odu skaitu. Ekdizons ir attēlots ar šādām krāsām: E, zaļa; 20E, oranža; 20E22P, violeta; 3D20E, zila; 3D20E22P, rozā. Ieliktnis palielina mērogu uz y ass, lai parādītu zemākus ekdizona līmeņus.
Lai izpētītu, vai 3D20E22P un 3D20E tiek pārnesti pārošanās laikā, mēs dažādos laikos pēc pārošanās preparējām mātīšu LRT. Lai gan jaunavām ekdizons netika atrasts, mēs novērojām ievērojamu 3D20E22P daudzumu LRT tūlīt pēc pārošanās (0,5 stundas pēc pārošanās, hpm), kas laika gaitā samazinājās, savukārt 3D20E līmenis ievērojami palielinājās (1. att.). Izmantojot ķīmiski sintezētu 3D20E kā standartu, mēs noteicām, ka šī steroīdā hormona līmenis pārošanās LRT bija vismaz 100 reizes augstāks nekā 20E (paplašinātā datu tabula 1). Tādējādi 3D20E22P ir galvenais tēviņu ekdizons, kas tiek pārnests uz mātīšu LRT pārošanās laikā, un tā defosforilētā forma, 3D20E, kļūst ļoti bagātīga neilgi pēc pārošanās. Tas liecina par pēdējam ekdizonam svarīgu lomu mātīšu pēcpārošanās bioloģijā.
Pēc jauna RNS sekvencēšanas (RNS-seq) datu kopas (2.a att.) ģenerēšanas, izmantojot pielāgotu bioinformātikas cauruļvadu, mēs meklējām ekdizona kināzi (EcK), ekdizona oksidāzi (EO) un ekdizonu, kas kodē 20E-modificētu fosfatāzes gēnu. EPP tiek ekspresēts reproduktīvajos audos. Mēs identificējām vienu EPP gēna kandidātu un divus potenciālos EcK gēnus (EcK1 un EcK2), bet nevarējām atrast labu EO gēna kandidātu. Jāatzīmē, ka atsevišķi EPP gēni tika ekspresēti augstā līmenī (98,9. procentīlē) Gambijas MAG, bet ne sieviešu LRT (2.b att.), pretēji mūsu cerībām, jo ​​šajos sieviešu audos notika 3D20E22P defosforilēšana. Tāpēc mēs uzskatām, ka vīriešu EPP var tikt pārnests pārošanās laikā. Patiešām, mēs izmantojām in vivo stabilu izotopu marķēšanu, lai maskētu sieviešu proteīnu pēc pārošanās, enzīmu, ko MS identificē sieviešu atriumā (2.c att. un 1. papildtabula). EPP klātbūtne MAG un Pārošanās (bet ne neapstrādātas) sieviešu dzimuma LRT tika apstiprināta arī, izmantojot specifiskas antivielas (2.d att.).
a, Pielāgots bioinformātikas kanāls, lai meklētu katra dzimuma reproduktīvajos audos gēnus, kas kodē EcK, EO un EPP. Skaitļi blakus bultiņām norāda tēviņu un mātīšu kandidātu skaitu katrā posmā. Šajā analīzē tika identificēts viens EPP gēns (EPP) un viens EcK gēns (EcK1), kas tiek ekspresēti tēviņos, un viens EcK gēns (EcK2), kas tiek ekspresēts abos dzimumos, bet nerada kandidāta EO gēnu. b, Karstuma karte, kurā salīdzināta kandidāta gēnu ekspresija neapstrādātu (V) un pārošanās (M) Anopheles gambiae un Anopheles albicans audos. Spca, apaugļošanās; MAG, palīgdziedzeri tēviņiem; citas ķermeņa daļas, tostarp krūtis, spārnus, kājas, tauku ķermeņus un iekšējos orgānus abiem dzimumiem, kā arī olnīcas mātītēm. EcK2 ir ļoti izteikti ekspresēts gan Gambijas MAG, gan priekškambaros, savukārt EPP ir atrodams tikai MAG.c, tēviņu ejakulāta grupas translokācijas proteomiskā analīze mātīšu priekškambaros 3, 12 un 24 hpm laikā, parādot 67 visbiežāk sastopamos proteīnus. Mātītes tika audzētas ar diētu, kas saturēja 15N, lai iezīmētu (un maskētu) visus proteīnus. Nemarķēti tēviņi tika pāroti ar iezīmētām mātītēm, un mātīšu LRT tika sadalītas 3, 12 un 24 hpm laikā proteomikas analīzei (pilnu ejakulācijas proteīnu sarakstu skatīt 1. papildtabulā). Ievietojumā EPP, Eck1 un EcK2 tika atklāti neapstrādātu tēviņu MAG, veicot šo audu proteomikas analīzi.d, EPP tika atklāts ar Western blot pārotu mātīšu MAG un LRT, bet ne neapstrādātām mātītēm vai tēviņiem vai pārējā mātītes ķermeņa daļā. Membrānas tika vienlaicīgi zondēts ar antiaktīnu (ielādes kontrole) un anti-EPP antivielām. Visi vīrieši ir jaunavi. Skatīt 1. papildattēlu, lai iepazītos ar gēla avota datiem. Western blot analīze tika veikta divas reizes ar līdzīgiem rezultātiem.
EPP ekdisteroīdās fosfofosfatāzes aktivitāte tika pārbaudīta pēc inkubācijas ar HPLC-MS/MS ar 3D20E22P, kas izolēts no MAG (paplašinātie dati, 2.a att.). Turklāt, kad mēs apklusinājām EPP ar RNS mediētu interferenci (RNAi), mēs konstatējām spēcīgu fosfatāzes aktivitātes samazināšanos šo tēviņu reproduktīvajos audos (3.a att.), un mātītēm, kas pārojās ar EPP apklusinātiem tēviņiem, bija ievērojami zemāka defosforilētā 3D20E proporcija (3.b att.), neskatoties uz daļēju gēnu apklusināšanu (paplašinātie dati, 2.b,c att.). Turpretī mēs nenovērojām būtiskas izmaiņas 20E22P/20E attiecībā tajos pašos odos, kas varētu liecināt, ka enzīms ir specifisks 3D20E22P (3.b att.).
a, Samazināta fosfatāzes aktivitāte MAG, ko izraisa EPP apklusināšana, izmantojot divpavedienu EPP RNS (dsEPP) vai divpavedienu GFP RNS (dsGFP) kontroles. Katrā atkārtojumā tika izmantoti divdesmit MAG kopumi (P = 0,0046, pāru t-tests, divpusējs), ko attēlo atsevišķi punkti. b, Mātītēm, kas pārojušās ar EPP apklusinātiem tēviņiem, bija ievērojami mazāka defosforilētā 3D20E proporcija pie 3 hpm (P = 0,0043, nepāru t-tests, divpusējs), savukārt 20E līmenis nemainījās (P = 0,063, nepāru t-tests). t-tests, divpusējs). Dati ir attēloti kā vidējais ± standartnovirze no trim kopām, katrā pa 13, 16 un 19 mātītēm.c, Mātītēm, kas pārojušās ar EPP apklusinātiem tēviņiem, bija ievērojami augstāks atkārtotas pārošanās līmenis (P = 0,0002, Fišera precīzais tests, divpusējs). Mātītes vispirms tika piespiestas pāroties, lai nodrošinātu savu pārošanās statusu; Divas dienas vēlāk tās tika sazinātas ar citiem tēviņiem, kuriem bija transgēna sperma, lai novērtētu atkārtotas pārošanās ātrumu, izmantojot transgēna kvantitatīvu PCR noteikšanu.d, Ar asinīm barotām mātītēm, kas pārojušās ar EPP apklusinātiem tēviņiem, bija ievērojami samazināta auglība (P < 0,0001; Manna-Vitnija tests, divpusējs) un nedaudz samazināts olu skaits (P = 0,088, Manna-Vitnija tests, divpusējs), savukārt nārsta ātrums netika ietekmēts (P = 0,94, Fišera precīzais tests, divpusējs). Visos paneļos n apzīmē bioloģiski neatkarīgu odu paraugu skaitu.NS, nav statistiski nozīmīgs.*P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001.
Pēc tam mēs novērtējām, vai ekdizona defosforilēšana ir svarīga pārošanās rezistences izraisīšanai mātītēm. Jāatzīmē, ka mātītes, kas pārojās ar tēviņiem, kuriem bija samazināts EPP līmenis, atkārtoti pārojās daudz biežāk (44,9%) nekā kontroles grupas mātītes (10,4%), ja tika pakļautas papildu (transgēniem) tēviņiem (3.c attēls). Mēs arī novērojām ievērojamu auglības samazināšanos (3.d attēls, pa kreisi) un nelielu šo mātīšu izdēto olu skaita samazināšanos (3.d attēls, pa vidu), savukārt mātīšu izdēto olu procentuālā daļa (vēl viena reakcija, ko mātītēm izraisa pārošanās) netika ietekmēta (3.d attēls, pa labi). Ņemot vērā novēroto EPP specifiskumu 3D20E22P, šie rezultāti liecina, ka 3D20E aktivācijai ar EPP, kas pārnests pārošanās laikā, var būt svarīga loma mātīšu uzņēmības pret turpmāku pārošanos izslēgšanā, kas iepriekš tika attiecināta uz 20E seksuālu pārnesi. Tāpēc šis tēviņiem specifiskais hormons arī spēcīgi ietekmē mātīšu auglību.
Pēc tam mēs salīdzinājām 20E un 3D20E aktivitāti injekcijas eksperimentos ar seksuāli nobriedušām jaunavām, izmantojot ķīmiski sintezētu 3D20E (4.a–c. att.) un komerciāli pieejamo 20E. Mēs novērojām, ka 3D20E bija ievērojami efektīvāks par 20E, izslēdzot mātīšu jutību pret pārošanos abās koncentrācijās (4.d att.). Jāatzīmē, ka puse no 3D20E fizioloģiskā līmeņa LRT (1066 pg pēc injekcijas salīdzinājumā ar 2022 pg pēc pārošanās) izraisīja rezistentu mātīšu īpatsvaru, kas bija 20 reizes lielāks nekā 20E fizioloģiskais līmenis (361 pg pēc injekcijas) 24 stundas pēc injekcijas augstākajā koncentrācijā (18 pg pēc pārošanās); Paplašināta datu tabula 1). Šis rezultāts atbilst uzskatam, ka 20E dzimumpārnešana neizraisa pārošanās refraktārus periodus, un vēl vairāk norāda uz 3D20E kā galveno faktoru vecāku un bērnu attiecību nodrošināšanā. 3D20E bija arī ievērojami aktīvāks par 20E olu dēšanas testos neapstrādātām mātītēm (4.e att.), kas liecina, ka normālais olu dēšanas ātrums, ko novērojām pēc daļējas EPP apklusināšanas, bija saistīts ar atlikušo 3D20E aktivitāti, ko joprojām radīja pārošanās izraisītie mātīšu faktori.
(a,b) 3D20E, ķīmiski sintezēts no 20E (a) ar ļoti augstu konversiju/efektivitāti (dati attēloti kā vidējais ± standartnovirze no trim neatkarīgām sintēzes reakcijām) (b).c, Masas spektrs (apakšējā puse) precīzi atbilst ekdizonam, kas atrodams pārojošās mātīšu LRT (augšējā puse).d, Salīdzinot ar 20E (0,63 µg, P = 0,02; 0,21 µg, P < 0,0001; Fišera precīzais tests, divpusējs) un 10% etanolu (0,63 µg, P < 0,0001; 0,21 µg, P < 0,0001; Fišera precīzais tests, divpusējs), savukārt 20E bija ievērojami augstāks nekā kontroles grupā tikai lielākās devās (0,63 µg, P = 0,0002; 0,21 µg, P = 0,54; Fišera precīzais tests, divpusējs).e, 3D20E injekcija izraisīja ievērojami augstāki nārsta rādītāji neapstrādātām mātītēm nekā 10% etanola kontroles grupā (0,21 µg, P < 0,0001; 0,13 µg, P = 0,0003; Fišera precīzais tests, divpusējs), savukārt 20E salīdzinājumā ar kontroles grupu tikai lielākās devās (0,21 µg, P = 0,022; 0,13 µg, P = 0,0823; Fišera precīzais tests, divpusējs). 3D20E izraisīja ievērojami augstākus nārsta rādītājus nekā 20E lielākās devās (0,21 µg, P = 0,0019; 0,13 µg, P = 0,075; Fišera precīzais tests, divpusējs). Visos paneļos n apzīmē bioloģiski neatkarīgu odu paraugu skaitu. NS, nav statistiski nozīmīgs. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,001. Dati ir no trim atkārtojumi.
Iepriekšējos pētījumos mēs noskaidrojām, ka steroīdo hormonu seksuāla pārnešana izraisa MISO (pārošanās izraisīts oogenēzes stimulators 11) ekspresiju. MISO ir sievišķais reproduktīvais gēns, kas aizsargā A. gambiae mātītes no P. falciparum infekcijas. Veselības izmaksas, ko rada 13. gēns, nāvējošākais cilvēku malārijas parazīts. Ņemot vērā MISO nozīmi Anopheles reproduktīvajai spējai malārijas endēmiskajos apgabalos, mēs nolēmām noteikt, kurš hormons — 3D20E vai 20E — izraisa šī gēna ekspresiju. Mēs atklājām, ka, lai gan 20E injekcija specifiski vai spēcīgāk inducēja dažus kodola hormonu receptorus (HR), piemēram, HR3 un HR4, un tipiskus lejupējos steroīdu mērķus, piemēram, yolkogēnos gēnus Vg14, 15, 16, MISO spēcīgāk inducēja 3D20E (paplašinātie dati, 3. att.). Tādējādi šī androgēnā steroīdo hormona seksuāla pārnešana, šķiet, izraisa mehānismus, kas aizsargā mātītes no parazītu infekcijas radītajām izmaksām. Turklāt 3D20E atšķirīgi ietekmē abas E receptoru EcR, inducējot EcR-A un nomācot EcR-B, un spēcīgāk iedarbinot citus pārošanos izraisošus gēnus, tostarp HPX15, kas ietekmē mātīšu auglību. Tas varētu izskaidrot ievērojamo neauglību, kas novērota mātītēm, kuras pārojas ar EPP apklusinātiem tēviņiem (paplašinātie dati, 3. att.). Šie dati liecina par lejupēju ceļu esamību, kurus galvenokārt aktivizē divi ekdizona hormoni, kas var būt dzimumspecifiskas funkcijas pamatā.
Pēc tam mēs pārbaudījām divu EcK gēnu funkciju, kas tika identificēti mūsu bioinformātikas procesā. EcK1 vai EcK2 apklusināšana izraisīja ievērojamu mirstību tēviņiem (paplašinātie dati, 4.a att.), kas liecina, ka ekdizona fosforilēšana un līdz ar to inaktivācija ir svarīga izdzīvošanai. Tā kā EcK2 tika ekspresēts augstākā līmenī nekā EcK1 un tika noteikts MAG ar proteomikas palīdzību (2.b, c att. un 2. papildtabula), mēs validējām tā ekdisteroīdu kināzes aktivitāti, inkubējot to ar 20E, kas izraisīja 20E22P fosforilēšanu (paplašinātie dati, 2. att.). 4.b). Izmantojot 3D20E kā substrātu, mēs nevarējām noteikt fosforilēto produktu 3D20E22P (paplašinātie dati, 4.c att.), kas liecina, ka 20E, nevis 3D20E, varētu būt EcK2 vēlamais mērķis.
Saskaņā ar mūsu RNS sekvencēšanas analīzi, EcK2 bija arī ļoti ekspresēts neapstrādātu mātīšu apakšējās respiratorās zarnas (LRT) daļā, kur tas tika izslēgts pēc pārošanās (2.b att.). Mēs apstiprinājām šos datus un noteicām, ka asins barošana neietekmēja EcK2 ekspresiju (paplašinātie dati, 5.a att.). Paplašinot mūsu sākotnējos MS eksperimentus, mēs noteicām, ka 20E22P maksimums bija cieši saistīts ar 20E maksimumu (22–26 stundas pēc asins maltītes; paplašinātie dati, 5.b att.). EcK2 apklusināšana neapstrādātām mātītēm izraisīja 20E un 20E22P relatīvās attiecības 3 reizes lielāku 26 stundas pēc asins maltītes (paplašinātie dati, 2.c un 5.c att.), apstiprinot, ka EcK2 arī fosforilē 20E mātītēs. Jāatzīmē, ka jaunavas, kurām bija samazināts EcK2 līmenis, saglabāja pilnīgu seksuālo uztveramību (paplašinātie dati, 5.d,e att.), kas vēl vairāk liecina, ka mātīšu 20E ražošana neizraisa pārošanās refraktāros periodus. Tomēr šīm mātītēm bija ievērojami palielinājies olu dēšanas rādītāji salīdzinājumā ar kontroles grupu, vairāk nekā 30% jaunavu dēja olas (paplašinātie dati, 5.f att.). Ja divpavedienu Eck2 RNS (dsEcK2) injekcijas tika veiktas pēc asins barošanas, nārsts nenotika, un šajā brīdī 20E maksimums asins uzņemšanas dēļ bija samazinājies. Kopumā šie rezultāti apstiprina modeli, ka 20E, kas rodas pēc asins sūkšanas, var izraisīt nārstu, bet tikai tad, ja nārsta bloks (EcK2 un, iespējams, citi faktori) tiek izslēgts pārošanās rezultātā. Ne 20E, ne 3D20E injekcijas neinhibēja EcK2 ekspresiju jaunavām (paplašinātie dati, 5.g att.), kas liecina, ka citi faktori mediē šīs kināzes inhibīciju. Tomēr 20E līmenis pēc asins barošanas nebija pietiekams, lai izraisītu pārošanās diskomfortu, bet to efektīvi izraisīja augsti seksuāli pārnesto 3D20E titri.
Mūsu rezultāti sniedz svarīgu ieskatu mehānismos, kas regulē A. gambiae reproduktīvos panākumus. Ir parādījies modelis, kurā tēviņi ir evolucionējuši, lai sintezētu augstus 3D20E titrus, tēviņiem specifisku modificētu ekdizonu, kas nodrošina vecākus, desensibilizējot mātītes turpmākai pārošanai. Vienlaikus šie malārijas vektori ir arī attīstījuši efektīvu sistēmu, lai aktivizētu 3D20E mātītēs, reaģējot uz tēviņiem specifiskā EPP seksuālu pārnešanu. Mūsuprāt, šis ir pirmais piemērs, kad tēviņu un mātīšu dominēta steroīdu hormonu sistēma kukaiņiem veic unikālu un kritisku funkciju. Tēviņiem specifiska ekdizona funkcija ir postulēta, bet nav pārliecinoši pierādīta. Piemēram, lielā mērā atspēkota hipotēze18 ir tāda, ka šīs funkcijas varētu veikt 20E prekursors E1. Ir labi zināms, ka Drosophila monandriju izraisa mazu dzimumpeptīdu19,20 seksuāla pārnešana, kas mijiedarbojas ar neironiem, kas inervē mātīšu reproduktīvo traktu, izmantojot specifiskus dzimumpeptīdu receptorus21,22. Ir nepieciešams turpmāks darbs, lai noteiktu lejupējās signālu kaskādes, ko kontrolē 3D20E A. gambiae mātītēs un lai noteiktu, vai šīs kaskādes var saglabāties starp odiem un Drosophila.
Ņemot vērā mūsu pētījumā identificēto 3D20E nozīmīgo lomu mātīšu auglībā un uzvedībā, ceļi, kas noved pie 3D20E sintēzes un aktivācijas, paver jaunas iespējas turpmākām odu apkarošanas stratēģijām, piemēram, konkurētspējīgu sterilu tēviņu ģenerēšanai sterilu kukaiņu tehnoloģiju stratēģijās, ko izmanto savvaļas atbrīvošanai vai 3D20E atdarināšanai jaunavu rotaļās. 3D20E tēviņiem raksturīgā funkcija, iespējams, attīstījās, kad A. gambiae un citas Cellia sugas ieguva spēju koagulēt savu spermu pārošanās aizbāžņos, jo tas ļauj efektīvi pārnest lielu skaitu hormonu un hormonus aktivējošu enzīmu. Savukārt 3D20E evolūcija, ieviešot monandriju, nodrošina mehānismu mātītēm (izmantojot augstu MISO ekspresiju), lai veicinātu savu reproduktīvo piemērotību apgabalos ar augstu malārijas izplatību, kas netieši veicina Plasmodium pārnešanu. Ņemot vērā, ka ir pierādīts, ka mātītēm 20E ir būtiska ietekme uz P. falciparum izdzīvošanu un augšanu Anopheles odu mātītēm,24 gan vīrišķo, gan sievišķo steroīdu hormonu ceļi tagad ir galvenie odu un parazītu mijiedarbības aspekti.
A. gambiae G3 celmi tika audzēti standarta kukaiņu apstākļos (26–28 °C, 65–80 % relatīvais mitrums, 12:12 h gaišs/tumšs fotoperiods). Kāpuri tika baroti ar pulverveida zivju barību (TetraMin Tropical Flakes, Koi Pellets un Tetra Pond Sticks attiecībā 7:7:2). Pieaugušie odi tika baroti ad libitum ar 10 % dekstrozes šķīdumu un katru nedēļu ar cilvēka asinīm (pētāmās asins komponentes). Jaunavīgie odi tika iegūti, atdalot dzimumus kūniņas stadijā pēc galu pārbaudes mikroskopijā. Tēviņi, kas nes DsRed transgēnu, ir aprakstīti iepriekš.
Piespiedu pārošanās eksperimenti tika veikti saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem protokoliem. Dabiskai pārošanai 4 dienas vecas neapstrādātas mātītes divas naktis tika turētas attiecībā 1:3 ar seksuāli nobriedušiem neapstrādātiem tēviņiem. Eksperimentos, kuros tēviņiem injicēja dsEPP, kopīga ievietošana sprostos sakrita ar 3.–4. dienu pēc injekcijas, kad fosfatāzes aktivitāte bija maksimāli samazināta (paplašinātie dati, 2.b att.).
Odu audi, atlikušie līķi (pārējā ķermeņa daļa) vai viss ķermenis tika sadalīti 100% metanolā un homogenizēti ar lodīšu maisījumu (2 mm stikla lodītes, 2400 apgr./min, 90 sekundes). Audu daudzumi un metanola tilpumi bija šādi: pārējā ķermeņa daļa, 50 1000 µl; MAG, 50–100 80 µl; mātītes LRT, 25–50 80 µl. Nogulsnes tika pakļautas otrai metanola ekstrakcijai ar tādu pašu metanola tilpumu. Šūnu atliekas tika noņemtas ar centrifugēšanu. Metanols no abām ekstrakcijām tika apvienots un žāvēts slāpekļa plūsmā, pēc tam atkārtoti suspendēts šādos 80% metanola ūdens tilpumos: pārējā ķermeņa daļa, 50 µl; MAG un mātītes LRT, 30 µl.
Paraugi tika analizēti ar masas spektrometru (ID-X, Thermo Fisher), kas bija savienots ar LC instrumentu (Vanquish, Thermo Fisher). 5 µl parauga tika injicēti 3 µm, 100 × 4,6 mm kolonnā (Inspire C8, Dikma), kas tika uzturēta 25 °C temperatūrā. LC mobilās fāzes bija A (ūdens, 0,1% skudrskābe) un B (acetonitrils, 0,1% skudrskābe). LC gradients bija šāds: 5% B 1 minūti, pēc tam palielināts līdz 100% B 11 minūšu laikā. Pēc 8 minūtēm 100% temperatūrā kolonnu atkārtoti līdzsvaro 5% B koncentrācijā 4 minūtes. Plūsmas ātrums bija 0,3 ml min-1. Jonizācija MS avotā tiek veikta ar karsētu elektroizsmidzināšanas jonizāciju pozitīvā un negatīvā režīmā.
Masas spektrometrs mēra datus m/z diapazonā no 350 līdz 680 ar 60 000 izšķirtspēju pilnā MS režīmā. MS/MS dati tika iegūti [M + H]+ (visiem mērķiem), [M - H2O + H]+ (visiem mērķiem) un [M - H]- (fosforilētiem mērķiem). MS/MS dati tika izmantoti, lai apstiprinātu mērķu ekdizona īpašības, kuriem nebija pieejams standarts. Lai identificētu nemērķtiecīgus ekdisteroīdus, tika analizēti MS/MS dati visiem HPLC pīķiem ar >15% relatīvo pārpilnību. Kvantitatīvi nosakiet, izmantojot standarta līknes, kas izveidotas no tīriem standartiem (20E, 3D20E), lai aprēķinātu viena konkrēta parauga (visu pārējo mērķu) absolūtos daudzumus vai atšķaidījumus, lai aprēķinātu to ekvivalenci daudzumiem, kas konstatēti vienā vīrietī. 3D20E kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot šādu aduktu summu: [M + TFA]-, [M + COOH]-, [M + Na]+, [M + Cl]-, [M + NO3]-. Dati tika iegūti un kvantificēts, izmantojot Tracefinder (4.1. versija). MS/MS dati tika analizēti, izmantojot Xcalibur (4.4. versija). E, 20E un 3D20E MS spektri tika salīdzināti ar attiecīgajiem standartiem. 3D20E22P tika analizēts, derivatizējot ar Žirāra reaģentu. 20E22P tika analizēts pēc m/z attiecības.
3D20E22P tika attīrīts no MAG. Attīrīšana tika veikta analītiskā mērogā, izmantojot īpaši jaudīgu šķidruma hromatogrāfu (Acquity, Waters) ar kvadrupola masas detektoru (QDa, Acquity, Waters) tādos pašos LC apstākļos kā HPLC-MS/MS analīze. Frakcijas savākšana tika uzsākta, kad 3D20E22P atbilstošais m/z tika noteikts tajā pašā aiztures laikā, kāds iepriekš noteikts. Ekstrahēto savienojumu tīrību pēc tam pārbaudīja ar HPLC-MS/MS, kā aprakstīts iepriekš.
Kopējā RNS tika ekstrahēta no 10–12 reproduktīvajiem audiem vai citām ķermeņa daļām (bez galvas), izmantojot TRI reaģentu (Thermo Fisher), ievērojot ražotāja norādījumus. RNS tika apstrādāta ar TURBO DNāzi (Thermo Fisher). cDNS tika sintezēta, izmantojot Moloney peļu leikēmijas vīrusa reverso transkriptāzi (M-MLV RT; Thermo Fisher), ievērojot ražotāja norādījumus. Praimeri reversās transkripcijas kvantitatīvajai PCR (RT-qPCR; paplašinātā datu tabula 2) tika publicēti iepriekš24 vai izstrādāti, izmantojot Primer-BLAST26, priekšroku dodot produktiem ar izmēru 70–150 bp un aptverot eksonu-eksonu savienojumus vai praimeru pāru praimerus, kas atdala eksonus. cDNS paraugi no trim līdz četriem bioloģiskiem atkārtojumiem tika atšķaidīti četras reizes ūdenī RT-qPCR. Kvantitatīvā noteikšana tika veikta 15 µl atkārtojumu reakcijās, kas saturēja 1× PowerUp SYBR Green Master Mix (Thermo Fisher), praimerus un 5 µl atšķaidītas cDNS. Reakcijas tika veiktas QuantStudio 6 Pro reāllaika PCR sistēmā (Thermo Fisher), un dati tika savākti un analizēts, izmantojot Design and Analysis (2.4.3. versija). Kā parādīts šajā pētījumā, relatīvie daudzumi tika normalizēti attiecībā pret ribosomu gēnu RpL19 (AGAP004422), kura ekspresija būtiski nemainījās, barojot ar asinīm27 vai pārojoties3.
RNS kvalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Agilent Bioanalyzer 2100 Bioanalyzer (Agilent). Illumina pāroto galu bibliotēkas tika sagatavotas un palaistas MIT un Hārvardas Broad institūtā. Sekvencēšanas nolasījumi tika saskaņoti ar A. gambiae genomu (PEST celms, 4.12. versija), izmantojot HISAT2 (2.0.5. versija) ar noklusējuma parametriem. Nolasījumi ar kartēšanas kvalitātes (MAPQ) vērtējumu <30 tika noņemti, izmantojot Samtools (1.3.1. versija). Gēniem piesaistīto nolasījumu skaits tika saskaitīts, izmantojot htseq-count (0.9.1. versija) ar noklusējuma parametriem. Normalizēto nolasījumu skaits tika aprēķināts un diferenciālā gēnu ekspresija tika analizēta, izmantojot DESeq2 pakotni (1.28.1. versija) R (4.0.3. versija).
Ekdizonu modificējošo gēnu kandidāti tika identificēti, vispirms meklējot A. gambiae genomā, izmantojot PSI-BLAST algoritmu (https://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/2.8.1/), izmantojot noklusējuma vērtību parametrus ar šādām vaicājuma olbaltumvielu sekvencēm: no Bombyx mori (piekļuves Nr. NP_001038956.1), Musca domestica (piekļuves Nr. XP_005182020.1, XP_005175332.1 un XP_011294434.1) un Microplitis demolitor (piekļuves Nr. XP_008552646.1 un XP_008552645.1); EcK no B. mori (piekļuves Nr. NP_001036900), Drosophila melanogaster (piekļuves Nr. NP_651202), Apis mellifera (piekļuves Nr. XP_394838) un Acyrthosiphon pisum (piekļuves Nr. XP_001947166); un EPP no B. mori (piekļuves Nr. XP_001947166) NP_001177919.1 un NP_001243996.1) un EO no D. melanogaster (piekļuves Nr. NP_572986.1) (1. solis). Pēc tam filtrējiet rezultātus, pamatojoties uz augstu mRNS ekspresiju (>100 fragmenti/kilobāzes eksoni uz miljonu kartētu lasījumu (FPKM) vai >85 %) reproduktīvajos audos (sieviešu LRT vai MAG) Gambijā (2. solis). Lai uzlabotu specifiskumu, mēs izvēlējāmies kandidāta enzīmus, kas tiek ekspresēti arī A. albimanus reproduktīvajos audos, anopheles sugā, kas pārošanās laikā nesintezē un nepārnes ekdizonu. Kandidāta gēni tika filtrēti, pamatojoties uz zemo ekspresiju (<100 FPKM vai <85. procentile) A. albimanus reproduktīvajos audos (3. solis). Kā pēdējais filtrs (4. solis), kandidāta gēniem ir jāatbilst vismaz vienam no šiem nosacījumiem: (1) ievērojami paaugstināta regulācija pēc pārošanās (P < 0,05) saskaņā ar atšķirīgi ekspresēto gēnu analīzi un (2) nereproduktīvajos audos (< 85 % vai <100 FPKM).
Mēs modificējām iepriekš aprakstītās metodes28,29,30, lai panāktu visa organisma izotopu marķēšanu.Īsumā, savvaļas tipa Saccharomyces cerevisiae II tipa (YSC2, Sigma) tika testēts rauga slāpekļa bāzē (BD Difco, DF0335), kas saturēja (svars/tilpums) 2% glikozes (G7528, Sigma), 1,7% aminoskābju nesaturošas barotnes un amonija sulfāta. 5% 15N amonija sulfāta (NLM-713, >99%, Cambridge Isotope Laboratories) kā vienīgo slāpekļa avotu.Raugs tika iegūts ar centrifugēšanu, un odu kāpuri tika baroti ad libitum līdz iekūņošanai.Pievienoja zivju miltus (0,5 mg uz 300 kāpuriem), lai novērstu ceturtās stadijas mirstību.Pēc tam pārošanās eksperimentos tika izmantotas tikai mātītes ar nemarķētiem tēviņiem, lai analizētu pārošanās laikā pārnesto tēviņu proteomu.
4–6 dienas vecas 15N-marķētas neapstrādātas mātītes tika piespiestas pāroties ar vecumam atbilstošiem nemarķētiem neapstrādātiem tēviņiem. Veiksmīga pārošanās tika pārbaudīta, epifluorescences mikroskopijā atklājot pārošanās aizbāžņus. 3, 12 un 24 hpm 45–55 pārojušos mātīšu priekškambarus sadalīja 50 µl amonija bikarbonāta buferšķīduma (pH 7,8) un homogenizēja ar piestu. Homogenātu centrifugēja, un supernatantu sajauca ar 50 µl 0,1% RapiGest (186001860, Waters) 50 mM amonija bikarbonātā. Katra parauga supernatants un nogulsnes tika ātri sasaldētas uz sausā ledus un nakts laikā nosūtītas uz Makkosa laboratoriju Vašingtonas Universitātē, kur tika pabeigta parauga sagatavošana LC-MS/MS. Nogulsnes atkārtoti suspendēja 50 µl 0,1% RapiGest 50 mM amonija bikarbonātā un apstrādāja ar ultraskaņu ūdens vannā. Nogulšņu un supernatanta olbaltumvielu koncentrāciju mērīja ar BCA. testā paraugi tika reducēti ar 5 mM ditiotreitolu (DTT; Sigma), alkilēti ar 15 mM jodoacetamīdu (Sigma) un inkubēti 37 °C temperatūrā (1:0 50) 1 stundu ar tripsinizāciju: tripsīna:substrāta attiecību). RapiGest tika lizēts, pievienojot 200 mM HCl, kam sekoja inkubācija 37 °C temperatūrā 45 minūtes un centrifugēšana ar 14 000 apgr./min 10 minūtes 4 °C temperatūrā, lai noņemtu gružus. Paraugi tika mazgāti ar divējāda režīma cietfāzes ekstrakciju (Oasis MCX kārtridži, Waters) un atkārtoti suspendēti 0,1% skudrskābē, lai iegūtu galīgo olbaltumvielu koncentrāciju 0,33 µg µl-1. Neiezīmētas MAG proteomas tika līdzīgi analizētas no neapstrādātiem tēviņiem. Katram paraugam tika analizēti divi analītiskie atkārtojumi. Pēc tam 1 µg no katra tika analizēts, izmantojot 25 cm kausēta silīcija dioksīda 75 μm kolonnu ar 4 cm kausētu silīcija dioksīda Kasil1 (PQ) frīta slazds, kas pildīts ar Jupiter C12 apgrieztās fāzes sveķiem (Phenomenex), un 180 minūšu šķidruma hromatogrāfiju. Paraugu digestēšana – MS/MS tika veikta ar Q-Exactive HF masas spektrometru (Thermo Fisher) ar nanoACQUITY UPLC sistēmu (Waters). Katrai analīzei ģenerētie ar datiem saistītie iegūšanas dati tika konvertēti mzML formātā, izmantojot Proteowizard (3.0.20287 versija) un Comet31 (3.2 versija), pret FASTA datubāzi, kas satur olbaltumvielu sekvences no Anopheles gambiae (VectorBase 54. versija), Anopheles coluzzi. Meklēšana tika veikta Mali-NIH (VectorBase 54. versija), Saccharomyces cerevisiae (Uniprot, 2021. gada marts), A. gambiae RNS sekvencē un zināmu cilvēka piesārņotāju trīs kadru translācijās. Peptīdu kartēm atbilstošie FDR tika noteikti, izmantojot Percolator32 (3.05. versija) ar slieksni 0,01, un peptīdi tika apkopoti olbaltumvielu identifikācijās, izmantojot olbaltumvielu parsimoniju Limelight33 (2.2.0 versija). Relatīvais olbaltumvielu daudzums tika novērtēts, izmantojot normalizēto spektrālā daudzuma faktoru (NSAF), kas aprēķināts katram proteīnam katrā izmēģinājuma ciklā, kā aprakstīts iepriekš. NSAF attiecībā pret katru proteīnu tika aprēķināts kā vidējais rādītājs paraugiem no diviem dažādiem bioloģiskiem atkārtojumiem. 15N marķēšana veiksmīgi maskēja sievišķo proteomu, lai gan nelielu daudzumu neiezīmēta proteīna varēja noteikt no marķētajām jaunavām. Vīriešu proteīnu redukcijas noteikšanu (1-5 spektri) sievišķajos neapstrādātajos paraugos reģistrējām tikai tehniskajās izmēģinājuma ciklā, kur neapstrādāti paraugi tika izmēģināti pēc tēviņu/pārošanās paraugiem HPLC "pārneses" rezultātā. Neregulāri proteīni, kas atrodami kā "piesārņotāji" no marķētajām jaunavām, ir uzskaitīti 1. papildtabulā.
Divi antigēni peptīdi, QTTDRVAPAPDQQQ (PA izotipā) un MESDGTTPSGDSEQ (PA un PB izotipā) Genscript tehnoloģijā. Abi peptīdi tika apvienoti, pēc tam konjugēti ar nesējproteīnu KLH un injicēti Jaunzēlandes trušiem. Pēc ceturtās injekcijas truši tika nokauti, un kopējais IgG tika izolēts ar afinitātes attīrīšanu. Turpmākai Western blot analīzei tika izmantots IgG no EPP specifiskākā truša.
Western blot analīzēm atsevišķi tika pievienots MAG (n = 10, kur n apzīmē bioloģiski neatkarīgo odu paraugu skaitu) un LRT mātīšu paraugi (n = 30) no 4 dienas veciem neapstrādātiem tēviņiem un neapstrādātām vai piespiedu kārtā pārotām mātītēm (<10 pēc pārošanās), olbaltumvielu ekstrakcijas buferšķīdums (50 mM Tris, pH 8,0; 1% NP-40; 0,25% nātrija deoksiholāts; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1× proteāzes inhibitoru kokteilis (Roche)). Paraugi tika homogenizēti tūlīt pēc preparēšanas ar lodīšu griezēju (2 mm stikla lodītes, 2400 apgr./min, 90 sekundes). Nešķīstošās atliekas tika noņemtas, centrifugējot pie 20 000 g 4 °C temperatūrā. Olbaltumvielas tika kvantitatīvi noteiktas ar Bredforda testu (Bio-Rad). Pēc tam 20 µg MAG olbaltumvielu, 40 µg LRT olbaltumvielu un 20 µg atlikušā olbaltumvielu daudzuma tika denaturēti un atdalīti ar 10% Bis-Tris. NuPAGE, izmantojot MOPS buferi. Olbaltumvielas tika pārnestas uz polivinilidēnfluorīda membrānām, izmantojot iBlot2 pārneses sistēmu (Thermo Fisher). Membrānas divas reizes mazgāja 1× PBS-T (0,1% Tween-20 PBS) un pēc tam bloķēja Odyssey bloķēšanas buferī (Li-Cor) 1 stundu 22°C temperatūrā. Membrānas kratīja nakti 4°C temperatūrā ar pielāgotu truša anti-EPP poliklonālo primāro antivielu (1:700 bloķēšanas buferī) un žurkas anti-aktīna monoklonālo primāro antivielu MAC237 (Abeam; 1:4000). Membrānas mazgāja ar PBS-T un pēc tam inkubēja ar sekundārajām antivielām (ēzeļa anti-truša 800CW un kazas anti-žurkas 680LT (Li-Cor), abas 1:20 000) bloķēšanas buferī, kas satur 0,01% SDS un 0,2% Tween-20, 1 stundu 22°C temperatūrā. Membrānas mazgāja ar PBS-T un attēlveidoja ar Odyssey CLx. skeneris. Attēli tika apkopoti un apstrādāti programmā Image Studio (5.2. versija). Specifiska josla, kas atbilst EPP-RA izoformai (82 kDa), netika konstatēta.
EPP (kā izoforma AGAP002463-RB, kas satur histidīna fosfatāzes domēnu, NCBI konservētā domēna meklēšana 34) un EcK2 (AGAP002181) kodējošie reģioni tika klonēti pET-21a(+) plazmīdā (Novagen Millipore Sigma); primeri ir uzskaitīti paplašinātajā datu tabulā 2. Astoņi GS4 linkeri (tandēmā) tika ievietoti pirms pET-21a(+)-EcK2 konstrukcijas C-termināla 6xHis taga. Rekombinantie proteīni tika iegūti, izmantojot NEBExpress bezšūnu E. coli proteīnu sintēzes reakciju (New England BioLabs). Rekombinantie proteīni tika attīrīti, izmantojot NEBExpress Ni centrifūgas kolonnas (New England BioLabs). Dihidrofolāta reduktāzes (DHFR) kontroles proteīns tika iegūts, izmantojot DNS matricu no NEBExpress bezšūnu E. coli proteīnu sintēzes komplekta. Olbaltumvielas tika uzglabātas 50% glicerīnā PBS pie -20 °C līdz 3 mēnešiem.
EPP un audu ekstraktu fosfatāzes aktivitāte tika mērīta, izmantojot 4-nitrofenilfosfātu (pNPP; Sigma-Aldrich). Reakcijas buferis saturēja 25 mM Tris, 50 mM etiķskābi, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA un 1 mM DTT. Audi tika homogenizēti reakcijas buferšķīdumā, un šūnu atliekas tika noņemtas ar centrifugēšanu. Reakciju uzsāka, pievienojot fermentu vai audu ekstraktu reakcijas buferšķīdumam, kas satur 2,5 mg ml-1 pNPP. Reakcijas maisījumu inkubēja istabas temperatūrā tumsā, un no pNPP pārveidotā pNP daudzums tika kvantitatīvi noteikts, mērot absorbciju pie 405 nm dažādos laikos.
In vitro EcK aktivitātes noteikšanai proteīns tika inkubēts ar 0,2 mg 20E vai 3D20E 200 µl buferšķīdumā (pH 7,5), kas satur 10 mM HEPES–NaOH, 0,1% BSA, 2 mM ATP un 10 mM MgCl2, 2 stundas 27 °C temperatūrā. Reakciju apturēja, pievienojot 800 µl metanola, pēc tam atdzesēja -20 °C temperatūrā 1 stundu un pēc tam centrifugēja ar 20 000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā. Pēc tam supernatantu analizēja ar HPLC-MS/MS. Lai termiski inaktivētu kontroles grupā izmantotos proteīnus, proteīni tika inkubēti 50% glicerīnā PBS 20 minūtes 95 °C temperatūrā.
In vitro EPP aktivitātes noteikšanai proteīns tika inkubēts ar 3D20E22P (ekvivalents daudzumam, kas atrodams 18 MAG pāros, attīrīts ar HPLC-MS/MS) 100 µl buferšķīdumā (pH 7,5), kas satur 25 mM Tris, 50 mM etiķskābi, 25 mM Bis-Tris, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA un 1 mM DTT, 3 stundas 27 °C temperatūrā. Reakciju apturēja, pievienojot 400 µl metanola, un atdzesēja -20 °C temperatūrā 1 stundu, pēc tam centrifugēja ar 20 000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā. Supernatantu analizēja ar HPLC-MS/MS.
EPP (362 bp), EcK1 (AGAP004574, 365 bp) un EcK2 (556 bp) PCR fragmenti tika amplificēti no kDNS, kas sagatavota no jaukta dzimuma bezgalvainu odu līķiem. eGFP kontroles PCR fragments (495 bp) tika amplificēts no iepriekš aprakstītā pCR2.1-eGFP; PCR praimeri ir uzskaitīti paplašinātajā datu tabulā 2. PCR fragments tika ievietots starp invertētajiem T7 promotoriem pL4440 plazmīdā. Plazmīdas konstrukcijas tika iegūtas no NEB 5-α kompetentas E. coli (New England Biolabs) un pirms lietošanas pārbaudītas ar DNS sekvencēšanu (skatīt 1. papilddatus par ievietojuma secību). Lai amplificētu ievietojumu no pL4440 bāzes plazmīdas, tika izmantoti praimeri, kas atbilst T7 promotoram (paplašināto datu tabula 2). PCR produkta lielums tika apstiprināts ar agarozes gela elektroforēzi. dsRNS tika transkribēta no PCR veidnēm, izmantojot Megascript T7 transkripcijas komplektu (Thermo Fisher), un attīrīta saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar iepriekš aprakstītajām modifikācijām.
dsRNS injekcijai pieaugušu vīriešu vai sieviešu (Nanoject III, Drummond) krūšu kurvī 1 dienas laikā pēc aizvēršanās injicēja 1380 ng dsRNS (dsGFP, dsEcK1, dsEcK2, dsEPP) koncentrācijā 10 ng nl-1. Gēnu nomākšanas līmeņi tika noteikti vismaz trīs bioloģiskajos atkārtojumos, izmantojot RNS ekstrakciju, kDNS sintēzi un RT-qPCR. Ekdizona injekcijai 4 dienas vecām neapstrādātām vai 6 dienas vecām neapstrādātām ar asinīm barotām mātītēm injicēja 0,13, 0,21 vai 0,63 µg 20E vai 3D20E (Nanoject III, Drummond) koncentrācijās attiecīgi 1,3, 2,1 atkarībā no eksperimenta dizaina vai 6,3 ng nl-1. Injicēja 100 nl 10% (tilp./tilp.) etanola ūdenī; 100 nl 3D20E22P 10% etanolā (kas atbilst 75% no daudzuma, kas atrodams MAG pārī). Odi tika nejauši iedalīti injekciju grupā.
Nārsta testiem 3 dienas vecas mātītes tika barotas ar cilvēka asinīm pēc vēlēšanās. Izņemiet daļēji paēdušos vai nebarotos odus. Atkarībā no apstrādes mātītes vismaz 48 stundas pēc asins maltītes uz četrām naktīm tika ievietotas atsevišķos nārsta traukos. Oliņas tika skaitītas, izmantojot stereoskopu (Stemi 508, Zeiss); pārojušām mātītēm oliņas, no kurām izšķīlās kāpuri, tika uzskatītas par auglīgām.
Pārošanās izmēģinājumiem mātītēm tika dotas vismaz 2 dienas atkarībā no apstrādes, lai attīstītu rezistenci pret pārošanos, un pēc tam tajā pašā būrī tika ievietoti savvaļas tipa vecumam atbilstoši tēviņi. Divas naktis vēlāk mātīšu apaugļotās pūslīši tika sadalīti, un genoma DNS tika atbrīvota, sasaldējot-atkausējot un apstrādājot ar ultraskaņu buferšķīdumā, kas satur 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA un 25 mM NaCl (pH 8,2). Paraugi tika inkubēti ar proteināzi K (0,86 µg µl-1) 15 minūtes 55 °C temperatūrā, pēc tam 10 minūtes 95 °C temperatūrā. Neattīrīti genoma DNS preparāti tika atšķaidīti 10 reizes un pakļauti Y hromosomu sekvenču noteikšanai ar qPCR; primeri ir uzskaitīti paplašinātajā datu tabulā 2. Y hromosomu sekvences neesamība norāda uz pārošanās neesamību.
Atkārtotas pārošanās testiem piespiedu kārtā pārotām mātītēm tika pārbaudīta pārošanās aizbāžņu klātbūtne, lai apstiprinātu pārošanās statusu, un 2 dienas tika atļauts attīstīt izturību pret pārošanos bez tēviņu klātbūtnes, kā aprakstīts iepriekš36. Tēviņi, kas nesēja DsRed transgēno spermu, pēc tam tika ievietoti mātīšu sprostos. Divas naktis vēlāk no mātītēm tika atdalītas apaugļošanās pūslīši, un genoma DNS tika sagatavota, kā aprakstīts iepriekš, un pakļauta DsRed transgēna qPCR noteikšanai; primeri ir uzskaitīti paplašinātajā datu 2. tabulā. DsRed transgēna neesamība norādīja, ka atkārtota pārošanās nenotika.
3D20E tika sintezēts, kā iepriekš aprakstīts 37. Īsumā, 10 mg 20E (Sigma-Aldrich) tika izšķīdināti 10 ml ūdens, pēc tam pievienojot 30 mg platīna melnā (pulverveidā, Sigma-Aldrich). Reakcijas maisījumā, maisot istabas temperatūrā, nepārtraukti burbuļoja maiga O2 plūsma. Pēc 6 stundām reakcijas apturēšanai pievienoja 30 ml metanola. Maisījumu centrifugēja, lai atdalītu katalizatora daļiņas. Supernatantu iztvaicēja līdz sausam vakuumā istabas temperatūrā. Žāvēto reakcijas produktu izšķīdināja 10% etanolā un metanolā injekcijām HPLC-MS/MS analīzei. Konversijas ātrums (no 20E līdz 3D20E) bija aptuveni 97% (4.b att.), un sintezētā 3D20E MS spektrs sakrita ar pārojušos mātīšu spektru (4.c att.).
Apzīmējumos ir sniegta detalizēta informācija par veiktajiem statistiskajiem testiem. Fišera precīzā testa, Mantela-Koksa testa un Stjudenta t-testa veikšanai tika izmantota programmatūra GraphPad (9.0 versija). Kohrana-Mantela-Henszela testi tika veikti, izmantojot pielāgotu R skriptu (pieejams vietnē https://github.com/duopeng/mantelhaen.test). Datu sadalījuma normalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Šapiro-Vilka testu ar nozīmīguma slieksni 0,05. Ja dati neizturēja normalitātes testu, tika veikts Manna-Vitnija tests. Izdzīvošanas dati tika analizēti, izmantojot Mantela-Koksa testu. RNS sekvencēšanas gēnu līmeņa diferenciālās ekspresijas analīzei tika izmantota DESeq2 pakotne (1.28.1 versija). Horizontālā josla grafikā attēlo mediānu. Kā slieksnis visiem testiem tika izmantota nozīmīguma vērtība P = 0,05.
Lai iegūtu plašāku informāciju par pētījuma dizainu, skatiet šim rakstam pievienoto Dabas pētījumu ziņojuma kopsavilkumu.
MS proteomikas dati tika deponēti ProteomeXchange konsorcijā (//proteomecentral.proteomexchange.org), izmantojot PRIDE partneru krātuvi (//www.ebi.ac.uk/pride/) ar datu kopas identifikatoru PXD032157.
RNS-seq datu kopa ir deponēta Gēnu ekspresijas visaptverošajā bibliotēkā (//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) ar sērijas ierakstu GSE198665.
Papildu datu kopas, kas ģenerētas un/vai analizētas pašreizējā pētījuma laikā, var iegūt no atbilstošajiem autoriem pēc saprātīga pieprasījuma. Šajā rakstā ir sniegti avota dati.
De Loof, A. Ekdisteroīdi: Novārtā atstātie kukaiņu dzimumsteroīdi? Vīrietis: Black Box.Insect Science.13, 325–338 (2006).
Redfern, CPF 20-hidroksiekdizons un olnīcu attīstība Anopheles stephens. J. Insect Physiology.28, 97–109 (1982).