Jūsu pārlūkprogrammā pašlaik ir atspējots Javascript. Dažas šīs vietnes funkcijas nedarbosies, ja JavaScript būs atspējots.
Reģistrējieties ar savu konkrēto informāciju un konkrētajām interesējošajām zālēm, un mēs salīdzināsim jūsu sniegto informāciju ar rakstiem mūsu plašajā datubāzē un nekavējoties nosūtīsim jums PDF kopiju pa e-pastu.
Ban-Lan-Gen granulas mazina dekstrāna nātrija sulfāta izraisītu hronisku recidivējošu kolītu pelēm, modulējot zarnu mikrobiotu un atjaunojot zarnu SCFA atvasinātā GLP-1 ražošanu
Dzjao Pens,1.–3.,*Li Sji,4.,*Džeņs Lins,3.,5. Duaņs Lifangs,1. Gao Džensjaņs,2.,5. Diehu,1. Li Dzje,6. Li Sjaofens,6. Šeņs Sjančuņs,5. Sjao Haitao21. Pekinas Universitātes Šeņdžeņas slimnīcas Farmācijas departaments, Šeņdžeņa, Ķīnas Tautas Republika; 2. Šeņdžeņas Universitātes Veselības zinātnes centra Farmācijas skola, Šeņdžeņa, Ķīnas Tautas Republika; 3. Guidžou Medicīnas universitātes Inženiertehnoloģiju pētniecības centrs Etniskās medicīnas un tradicionālās ķīniešu medicīnas attīstības un pielietošanas jomā, Izglītības ministrija, Guidžou provinces farmācijas galvenā laboratorija, Guidžou Medicīnas universitāte, Guijana, Ķīnas Tautas Republika; 4. Gastroenteroloģijas katedra, Pekinas Universitātes Šeņdžeņas slimnīca, Šeņdžeņa, Ķīnas Tautas Republika; 5. Farmācijas skola, Guidžou Medicīnas universitāte, Valsts zāļu augu funkciju un pielietošanas galvenā laboratorija, Guijana; 6. Pekinas Universitātes Šeņdžeņas slimnīcas laboratorijas medicīnas nodaļa, Šeņdžeņa, Ķīna [email protected] Šeņ Sjaņčuns, Farmācijas skola, Guidžou Medicīnas universitāte, Guidžou, Ķīnas Tautas Republika, 550004, e-pasts [email protected] Mērķis: Uz GLP-1 balstīta terapija ir jauna ārstēšanas iespēja iekaisīgu zarnu slimību ārstēšanai. Ban-Lan-Gen (BLG) granulas ir zināma pretvīrusu TCM formula, kam piemīt potenciāla pretiekaisuma aktivitāte dažādu iekaisuma stāvokļu ārstēšanā. Tomēr tās pretiekaisuma iedarbība uz kolītu un tās darbības mehānisms joprojām nav skaidrs. METODES: Lai noteiktu dekstrāna nātrija sulfāta (DSS) izraisītu hronisku recidivējošu kolītu pelēm. Lai novērtētu BLG aizsargājošo iedarbību, tika veikti slimības aktivitātes indeksi, bojājuma histoloģiskie marķieri un proinflammatorisko citokīnu līmeņi. BLG ietekmi uz zarnu mikrobiotu un zarnām raksturoja seruma GLP-1 līmenis un resnās zarnas Gcg, GPR41 un GRP43 ekspresija, zarnu mikrobiotas sastāvs, fekāliju īsšūnu taukskābju līmeņi un GLP-1 izdalīšanās no primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām. No īskās ķēdes taukskābju (SCFA) atvasinātā GLP-1 ražošana. Rezultāti: BLG terapija ievērojami samazināja ķermeņa masas zudumu, DAI, resnās zarnas saīsināšanos, resnās zarnas audu bojājumus un proinflammatorisko citokīnu TNF-α, IL-1β un IL-6 līmeni resnās zarnas audos. Turklāt BLG terapija var ievērojami atjaunot resnās zarnas Gcg, GPR41 un GRP43 ekspresiju un GLP-1 līmeni serumā kolīta pelēm, palielinot SCFA producējošo baktēriju, piemēram, Akkermansia un Prevotellaceae_UCG-001, daudzumu un samazinot tādu baktēriju kā Eubacterium_xylanophilum_group, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas un Oscillibacter, daudzumu. Turklāt BLG terapija var ievērojami palielināt SCFA līmeni kolīta peļu fekālijās. Vienlaikus in vitro eksperimenti arī parādīja, ka ar BLG apstrādātu peļu fekāliju ekstrakts var ievērojami stimulēt primārās mazās peļu resnās zarnas epitēlija šūnas, kas izdala GLP-1. Secinājumi: Šie atklājumi liecina, ka BLG piemīt antikolīta iedarbība. BLG ir potenciāls attīstīt kā terapiju, vismaz daļēji modulējot zarnu mikrobiotu un atjaunojot zarnu no īsās ķēdes taukskābes (ĪĶT) iegūtā GLP-1 ražošanu. Daudzsološas zāles hroniska recidivējoša kolīta ārstēšanai. Atslēgvārdi: kolīts, Ban-Lan-Gen granulas, zarnu mikrobiota, īsās ķēdes taukskābes, GLP-1.
Čūlainais kolīts (ČK) ir ilgstoša resnās un taisnās zarnas iekaisuma slimība, kam raksturīga atkārtota caureja, sāpes vēderā, svara zudums un gļotaini strutaina asiņaina vēdera izeja.1 Pēdējā laikā ČK izplatība pieaug valstīs ar iepriekš zemu saslimstību, tostarp Ķīnā, pieaugot Rietumu dzīvesveida popularitātei.2 Šis pieaugums rada nopietnas problēmas sabiedrības veselībai un nopietni ietekmē pacientu darbspējas un dzīves kvalitāti. Jāatzīmē, ka ČK patogeneze joprojām ir lielā mērā neskaidra, taču ir vispārpieņemts, ka ģenētika, vides faktori, zarnu mikrobiota un imūnsistēma veicina ČK attīstību.3 Pat tagad ČK nav izārstējama, un ārstēšanas mērķis ir klīniski kontrolēt klīniskos simptomus, izraisīt un uzturēt remisiju, veicināt gļotādas dzīšanu un samazināt recidīvu. Klasiskās ārstēšanas metodes ietver aminosalicilātus, kortikosteroīdus, imūnsupresantus un bioloģiskos līdzekļus. Tomēr šīs zāles nevar sasniegt vēlamo efektu to dažādo blakusparādību dēļ.4 Nesen daudzi gadījumu pētījumi ir parādījuši, ka tradicionālā ķīniešu medicīna (TĶM) ir pierādījusi lielu potenciālu ČK mazināšanā ar zemu toksicitāti, kas liecina, ka attīstība Jaunās TCM terapijas ir daudzsološa čūlainā čūla (UC) ārstēšanas stratēģija.5-7
Banlangen granulas (BLG) ir tradicionāls ķīniešu medicīnas preparāts, kas tiek gatavots no Banlangen saknes ūdens ekstrakta.8 Papildus pretvīrusu iedarbībai BLG piemīt potenciāla pretiekaisuma aktivitāte dažādu iekaisuma stāvokļu ārstēšanā.9,10 Turklāt no Radix isatidis ūdens ekstraktiem ir izolēti un identificēti glikozinolāti (R,S-goitrīns, progoitrīns, epiprorubīns un glikozīds) un nukleozīdi (hipoksantīns, adenozīns, uridīns un guanozīns) un indigo alkaloīdi, piemēram, indigo un indirubīns.11,12 Iepriekšējos pētījumos ir labi dokumentēts, ka savienojumi adenozīns, uridīns un indirubīns uzrāda spēcīgu antikolīta iedarbību dažādos kolīta dzīvnieku modeļos.13-17 Tomēr nav veikti uz pierādījumiem balstīti pētījumi, lai novērtētu BLG efektivitāti kolīta gadījumā. Šajā pētījumā mēs pētījām BLG aizsargājošo iedarbību pret dekstrāna nātrija sulfāta (DSS) izraisītu hronisku recidivējošu kolītu C57BL/6 pelēm un atklājām, ka BLG iekšķīga lietošana ievērojami Novājināta DSS izraisīta hroniska recidivējoša resnā zarna pelēm Iekaisums, tā regulēšanas mehānismi ir saistīti ar zarnu mikrobiotas modulāciju un zarnās iegūtās glikagonam līdzīgā peptīda-1 (GLP-1) ražošanas atjaunošanu.
BLG granulas (bez cukura, NMPA apstiprinātas Z11020357; Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd., Pekina, Ķīna; partijas numurs: 20110966) tika iegādātas aptiekās. DSS (molekulmasa: 36 000–50 000 daltonu) tika iegādāts no MP Biologicals (Santa Ana, ASV). Sulfasalazīns (SASP) (≥ 98% tīrība), hematoksilīns un eozīns tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Sentluisa, Misūri, ASV). Peles TNF-α, IL-1β un IL-6 luminex Elisa testu komplekti tika iegādāti no R&D systems (Mineapolisa, Minesota, ASV). Etiķskābe, propionskābe un sviestskābe tika iegādātas no Aladdin Industries (Šanhaja, Ķīna). 2-etilsviestskābe tika iegādāta no Merck KGaA (Darmštate, Vācija).
6–8 nedēļas vecas C57BL/6 tēviņu peles (ķermeņa masa 18–22 g) tika iegādātas no uzņēmuma Beijing Wetahe Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (Pekina, Ķīna) un turētas 22 ± 2 °C temperatūrā ar 12 stundu gaismas/tumsas ciklu. Pelēm vienu nedēļu tika dota standarta grauzēju barība ar brīvu piekļuvi dzeramajam ūdenim, lai tās pierastu pie jaunās vides. Pēc tam peles tika nejauši sadalītas četrās grupās: kontroles grupa, DSS modeļa grupa, SASP apstrādātā grupa (200 mg/kg, iekšķīgi) un BLG apstrādātā grupa (1 g/kg, iekšķīgi). Kā parādīts 1.A attēlā, saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu pelēm eksperimentāls hronisks recidivējošs kolīts tika inducēts ar trim 1,8% DSS cikliem 5 dienas, kam sekoja destilēts ūdens 7 dienas, saskaņā ar mūsu iepriekšējo pētījumu.18 Peles SASP un BLG apstrādātajās grupās tika ārstētas attiecīgi ar SASP un BLG katru dienu, sākot no 0. dienas. Saskaņā ar sākotnējiem eksperimentiem BLG deva tika noteikta 1 g/kg. Tikmēr SASP deva saskaņā ar literatūru tika noteikta 200 mg/kg apmērā.4 Kontroles un DSS modeļa grupas visa eksperimenta laikā saņēma vienādu ūdens tilpumu.
1. attēls. BLG mazina DSS izraisītu hronisku recidivējošu kolītu pelēm. (A) Hroniska recidivējoša kolīta un ārstēšanas eksperimentālais dizains, (B) ķermeņa masas izmaiņas, (C) slimības aktivitātes indeksa (DAI) rādītājs, (D) resnās zarnas garums, (E) resnās zarnas reprezentatīvs attēls, (F) H&E iekrāsojums resnajā zarnā (palielinājums, ×100) un (G) histoloģiskais rādītājs. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM (n = 6). ##p < 0,01 vai ###p < 0,001 salīdzinājumā ar kontroles (Con) grupu; *p < 0,05 vai **p < 0,01 vai ***p < 0,001 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Ķermeņa svars, izkārnījumu konsistence un taisnās zarnas asiņošana tika reģistrēti katru dienu. Slimības aktivitātes indekss (DAI) tika noteikts, apvienojot ķermeņa svara, izkārnījumu konsistences un taisnās zarnas asiņošanas rādītājus, kā aprakstīts iepriekš.19 Eksperimenta beigās visas peles tika eitanizētas, un asinis, izkārnījumi un resnā zarna tika savākti turpmākiem eksperimentiem.
Resnās zarnas audi tika fiksēti formalīnā un iestrādāti parafīnā. Tika izveidotas 5 mikronu sekcijas, iekrāsotas ar hematoksilīna eozīnu (H&E), pēc tam veikta akla analīze un novērtētas, kā aprakstīts iepriekš.19
Kopējā resnās zarnas audu RNS tika ekstrahēta ar Trizol reaģentu (Invitrogen, Carlsbad, CA), kam sekoja kDNS ekstrakcija ar reversās transkriptāzes palīdzību (TaKaRa, Kusatsu, Shiga, Japāna). Kvantitatīvā PCR tika veikta, izmantojot reālā laika PCR sistēmu ar SYBR Green Master (Roche, Basel, Šveice). Mērķa gēnu transkripti tika normalizēti attiecībā pret β-aktīnu, un dati tika analizēti, izmantojot 2-ΔΔCT metodi. Gēnu praimeru secības ir parādītas 1. tabulā.
Primārās peles resnās zarnas epitēlija šūnu izolēšana un kultivēšana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš.20 Īsumā, 6–8 nedēļas vecu peļu resnās zarnas vispirms tika izgrieztas pēc nonāvēšanas ar kakla dislokāciju, pēc tam gareniski atvērtas, apstrādātas ar Hanksa līdzsvarotu sāls šķīdumu (HBSS, bez kalcija un magnija) un sagrieztas 0,5–1 mm mazos gabaliņos. Pēc tam audi tika sagremoti ar 0,4 mg/ml kolagenāzes XI (Sigma, Pūla, Apvienotā Karaliste) brīvā DMEM vidē un centrifugēti ar 300 xg 5 minūtes istabas temperatūrā. Granulu atkārtoti suspendējiet DMEM vidē (papildināta ar 10% fetāla liellopa seruma, 100 vienības/ml penicilīna un 100 µg/ml streptomicīna) 37 °C temperatūrā un izlaidiet caur neilona sietu (poru izmērs ~250 µm). Resnās zarnas epitēlija šūnu alikvotas tika ievietotas stikla dibena traukos un inkubētas ar etiķskābi, propionskābi, sviestskābi un peles fekāliju ekstraktiem 2 stundas 37 °C temperatūrā, 5% CO2.
Resnās zarnas audi tika homogenizēti ar PBS, un citokīnu IL-6, TNF-α un IL-1β līmeņi resnās zarnas audos tika noteikti, izmantojot Luminex ELISA testu komplektus (R&D systems, Minneapolis, MN, ASV). Līdzīgi, GLP-1 līmeņi primāro peļu resnās zarnas epitēlija šūnu serumā un barotnē tika noteikti ar ELISA komplektu (Bioswamp, Uhaņa, Ķīna) saskaņā ar ražotāja norādījumiem.
Kopējā DNS no fekālijām tika ekstrahēta, izmantojot DNS ekstrakcijas komplektu (Tiangen, Ķīna). DNS kvalitāte un daudzums tika mērīti attiecīgi attiecībās 260 nm/280 nm un 260 nm/230 nm. Pēc tam, izmantojot katru ekstrahēto DNS kā veidni, specifiski primeri 338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) un 806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT) tika izmantoti, lai amplificētu 16S rRNS gēna V3-V4 reģionus dažādos reģionos. PCR produkti tika attīrīti, izmantojot QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Vācija), kvantitatīvi noteikti ar reāllaika PCR, un sekvencēti, izmantojot IlluminaMiseq PE300 sekvencēšanas platformu (Illumina Inc., CA, ASV). Bioinformātikas analīzei datu apstrāde tika veikta, ievērojot iepriekš ziņotos protokolus.21,22 Īsāk sakot, izmantojiet Cutadapt (V1.9.1), lai filtrētu neapstrādātus ekspresfailus. OTU tika grupēti, izmantojot UPARSE (7.0.1001 versija). ar līdzības robežu 97%, un UCHIME tika izmantots himērisko secību noņemšanai. Kopienas sastāva analīze un klasifikācija tika veikta, izmantojot RDP klasifikatoru (http://rdp.cme.msu.edu/), pamatojoties uz SILVA ribosomu RNS gēnu datubāzi.
Īsās ķēdes taukskābju (etiķskābes, propionskābes un sviestskābes) līmenis tika mērīts, kā iepriekš aprakstījuši Tao et al., ar dažām modifikācijām.23 Īsumā, 100 mg fekāliju vispirms suspendēja 0,4 ml dejonizēta ūdens, kam sekoja 0,1 ml 50% sērskābes un 0,5 ml 2-etilsviestskābes (iekšējais standarts), pēc tam homogenizēja un karsēja 4°C temperatūrā. Centrifugēt ar ātrumu 12 000 apgr./min 15 minūtes pie C. Supernatantu ekstrahēja ar 0,5 ml ētera un ievadīja gāzu hromatogrāfā analīzei. Gāzu hromatogrāfijas (GC) analīzei paraugus analizēja, izmantojot GC-2010 Plus gāzu hromatogrāfu (Shimadzu, Inc.), kas aprīkots ar liesmas jonizācijas detektoru (FID). Atdalīšana tika panākta, izmantojot ZKAT-624 kolonnu, 30 m × 0,53 mm × 0,3 μm (Lanzhou Zhongke Antai Analytical Technology Co., Ltd., Ķīna). Dati tika iegūti, izmantojot GC šķīduma programmatūru (Shimadzu, Inc.). Sadalījuma attiecība bija 10:1, nesējgāze bija slāpeklis, un plūsmas ātrums bija 6 ml/min. Iesmidzināšanas tilpums bija 1 μL. Inžektora un detektora temperatūra bija 300 °C. Cepeškrāsns temperatūra tika uzturēta 140 °C 13,5 minūtes, pēc tam palielināta līdz 250 °C ar ātrumu 120 °C/min; Temperatūra tika uzturēta 5 minūtes.
Dati ir attēloti kā vidējais rādītājs ± vidējā rādītāja standartkļūda (SEM). Datu nozīmīgums tika novērtēts, izmantojot vienvirziena ANOVA, kam sekoja Dankana vairāku diapazonu tests. Visiem aprēķiniem tika izmantota GraphPad Prism 5.0 programmatūra (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, ASV), un p < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.
Ir labi zināms, ka ČK ir hroniska recidivējoša kolīta slimība ar stiprām sāpēm vēderā, caureju un asiņošanu. Tāpēc, lai novērtētu BLG pretkolīta efektivitāti, tika izveidots DSS izraisīts hronisks recidivējošs kolīts pelēm (1.A attēls). Salīdzinot ar kontroles grupu, pelēm DSS modeļa grupā bija ievērojami samazināta ķermeņa masa un augstāks DAI, un šīs izmaiņas bija ievērojami atgriezeniskas pēc 24 dienu ilgas BLG ārstēšanas (1.B un C attēls). Resnās zarnas saīsināšanās ir svarīga ČK pazīme. Kā parādīts 1.D un E attēlā, pelēm, kuras saņēma DSS, resnās zarnas garums bija ievērojami saīsināts, bet BLG ārstēšana to atviegloja. Pēc tam tika veikta histopatoloģiskā analīze, lai novērtētu resnās zarnas iekaisumu. H&E krāsotie attēli un patoloģiskie rādītāji parādīja, ka DSS ievadīšana ievērojami izjauca resnās zarnas arhitektūru un izraisīja kriptu destrukciju, savukārt BLG ārstēšana ievērojami samazināja kriptu destrukciju un patoloģiskos rādītājus (1.F un G attēls). Jāatzīmē, ka BLG aizsargājošā iedarbība 1 g/kg devā bija salīdzināma ar SASP iedarbību 200 mg/kg. Kopumā šie atklājumi liecina, ka BLG efektīvi mazina DSS izraisīta hroniska recidivējoša kolīta smagumu pelēm.
TNF-α, IL-1β un IL-6 ir svarīgi resnās zarnas iekaisuma marķieri. Kā parādīts 2.A attēlā, DSS izraisīja ievērojamu TNF-α, IL-1β un IL-6 gēnu ekspresijas pieaugumu resnajā zarnā, salīdzinot ar kontroles grupu. BLG ievadīšana var ievērojami mainīt šīs DSS mediētās izmaiņas. Pēc tam mēs izmantojām ELISA, lai noteiktu iekaisuma citokīnu TNF-α, IL-1β un IL-6 līmeni resnās zarnas audos. Rezultāti arī parādīja, ka pelēm, kuras ārstēja ar DSS, TNF-α, IL-1β un IL-6 līmenis resnajā zarnā bija ievērojami paaugstināts, savukārt BLG terapija mazināja šo pieaugumu (2.B attēls).
2. attēls. BLG inhibē gēnu ekspresiju un iekaisumu veicinošo citokīnu TNF-α, IL-1β un IL-6 veidošanos ar DSS apstrādātu peļu resnajā zarnā. (A) TNF-α, IL-1β un IL-6 gēnu ekspresija resnajā zarnā; (B) TNF-α, IL-1β un IL-6 resnās zarnas proteīnu līmeņi. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM (n = 4–6). #p < 0,05 vai ##p < 0,01 vai ###p < 0,001 salīdzinājumā ar kontroles (Con) grupu; *p < 0,05 vai **p < 0,01 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Zarnu disbiozei ir kritiska nozīme čūlainā kolīta (UC) patogenezē.24 Lai izpētītu, vai BLG modulē ar DSS apstrādātu peļu zarnu mikrobiotu, tika veikta 16S rRNS sekvencēšana, lai analizētu zarnu satura baktēriju kopienu. Venna diagramma parāda, ka visām trim grupām ir 385 kopīgas OTU. Tajā pašā laikā katrai grupai bija unikālas OTU (3.A att.). Turklāt 3.B un C attēlā parādītais Chao1 indekss un Šenona indekss parādīja, ka ar BLG apstrādātām pelēm zarnu mikrobiotas kopienas daudzveidība bija samazināta, jo Šenona indekss bija ievērojami samazināts ar BLG apstrādātajā grupā. Galveno komponentu analīze (PCA) un galveno koordinātu analīze (PCoA) tika izmantotas, lai noteiktu klasterizācijas modeļus starp trim grupām, un parādīja, ka ar DSS apstrādāto peļu kopienas struktūra pēc BLG apstrādes bija skaidri atdalīta (3.D un E attēls). Šie dati liecina, ka BLG apstrāde būtiski ietekmēja peļu ar DSS izraisītu kolītu kopienas struktūru.
3. attēls. BLG maina zarnu mikrobiotas daudzveidību pelēm ar DSS izraisītu kolītu. (A) OTU Venna diagramma, (B) Chao1 indekss, (C) Šenona bagātības indekss, (D) OTU galveno komponentu analīzes (PCA) punktu diagramma, (E) OTU galveno koordinātu analīzes (PCoA) punktu skaits. Attēls. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM (n = 6). **p < 0,01 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Lai novērtētu specifiskas izmaiņas fekāliju mikrobiotā, mēs analizējām zarnu mikrobiotas sastāvu visos taksonomiskajos līmeņos. Kā parādīts 4.A attēlā, galvenās filas visās grupās bija Firmicutes un Bacteroidetes, kam sekoja Verrucomicrobia. Firmicutes relatīvais daudzums un Firmicutes/Bacteroidetes attiecība DSS apstrādāto peļu fekāliju mikrobu kopienās bija ievērojami palielināta, salīdzinot ar kontroles pelēm, un šīs izmaiņas tika ievērojami mainītas pēc BLG apstrādes. Jo īpaši BLG apstrāde ievērojami palielināja Verrucobacterium relatīvo daudzumu peļu ar DSS izraisītu kolītu fekālijās. Mājsaimniecību līmenī fekāliju mikrobu kopienas aizņēma Lachnospiriaceae, Muribaculaceae, Akkermansiaceae, Ruminococcaceae un Prevotellaceae (4.B attēls). Salīdzinot ar DSS grupu, BLG samazināšanās palielināja Akkermansiaceae daudzumu, bet samazināja Lachnospiraceae un Ruminococcaceae daudzumu. Jāatzīmē, ka ģints līmenī fekāliju mikrobiotu aizņēma Lachnospira_NK4A136_grupa, Akkermansia un Prevotellaceae_UCG-001 (4.C att.). Šis atklājums arī parādīja, ka BLG apstrāde efektīvi mainīja mikrobiotas nelīdzsvarotību, reaģējot uz DSS iedarbību, ko raksturo Eubacterium_xylanophilum_grupas, Ruminococcaceae_UCG-014, Intestinimonas un Oscillibacter samazināšanās un Akkermansia un Prevotellaceae_UCG-001 palielināšanās.
4. attēls. BLG maina zarnu mikrobiotas daudzumu DSS izraisīta kolīta pelēm. (A) Zarnu mikrobiotas daudzums tipa līmenī; (B) Zarnu mikrobiotas daudzums dzimtas līmenī; (C) Zarnu mikrobiotas daudzums ģints līmenī. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM (n = 6). #p < 0,05 vai ###p < 0,001 salīdzinājumā ar kontroles (Con) grupu; *p < 0,05 vai **p < 0,01 vai ***p < 0,001 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Ņemot vērā, ka īsās ķēdes taukskābes (ĪĶT) ir galvenie Akkermansia un Prevotellaceae_UCG-001 metabolīti, savukārt acetāts, propionāts un butirāts ir visizplatītākās ĪĶT zarnu lūmenā,25–27 mēs joprojām atrodamies savā pētījumā. Kā parādīts 5. attēlā, fekāliju acetāta, propionāta un butirāta koncentrācija DSS apstrādātajā grupā bija ievērojami samazināta, savukārt BLG apstrāde varēja lielā mērā nomākt šo samazinājumu.
5. attēls. BLG palielina īskās ķēdes taukskābju (ĪĶT) līmeni peļu ar DSS izraisītu kolītu fekālijās. (A) Etiķskābes saturs fekālijās; (B) propionskābes saturs fekālijās; (C) sviestskābes saturs fekālijās. Dati ir norādīti kā vidējais ± SEM (n = 6). #p < 0,05 vai ##p < 0,01 salīdzinājumā ar kontroles (Con) grupu; *p < 0,05 vai **p < 0,01 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Mēs tālāk aprēķinājām Pīrsona korelācijas koeficientu starp ģints līmeņa diferenciālo īskās ķēdes taukskābes (ĪĶT) un fekāliju mikrobiotu. Kā parādīts 6. attēlā, Akkermansia pozitīvi korelēja ar propionskābes (Pīrsona koeficients = 0,4866) un sviestskābes (Pīrsona koeficients = 0,6192) ražošanu. Turpretī gan Enteromonas, gan Oscillobacter negatīvi korelēja ar acetāta ražošanu, ar Pīrsona koeficientiem attiecīgi 0,4709 un 0,5104. Tāpat Ruminococcaceae_UCG-014 negatīvi korelēja ar propionskābes (Pīrsona koeficients = 0,4508) un sviestskābes (Pīrsona koeficients = 0,5842) ražošanu.
6. attēls. Pīrsona korelācijas analīze starp diferenciālajām īskajām taukskābēm (ĪĶT) un resnās zarnas mikrobiem. (A) Enteromonas ar etiķskābi; (B) Smadzeņu satricinājuma bacilis ar etiķskābi; (C) Akkermansia pret propionskābi; (D) Ruminococcus_UCG-014 ar propionskābi; (E) Akkermansia ar sviestskābi; (F) Ruminococcus_UCG-014 ar sviestskābi.
Glikagonam līdzīgais peptīds-1 (GLP-1) ir šūnu tipam specifisks proglikagona (Gcg) posttranslācijas produkts ar pretiekaisuma īpašībām.28 Kā parādīts 7. attēlā, DSS izraisīja ievērojamu Gcg mRNS ekspresijas samazināšanos. Resnās zarnas un BLG terapija varēja ievērojami mainīt DSS izraisīto Gcg samazināšanos, salīdzinot ar kontroles grupu (7.A attēls). Tajā pašā laikā GLP-1 līmenis serumā bija ievērojami samazināts DSS apstrādātajā grupā, un BLG terapija varēja lielā mērā novērst šo samazināšanos (7.B attēls). Tā kā īsās ķēdes taukskābes var stimulēt GLP-1 sekrēciju, aktivizējot G-proteīnu saistīto receptoru 43 (GRP43) un G-proteīnu saistīto receptoru 41 (GRP41), mēs arī pārbaudījām GPR41 un GRP43 kolīta peļu resnajā zarnā un atklājām, ka GRP43 un GPR41 resnās zarnas mRNS ekspresija bija ievērojami samazināta pēc DSS iedarbības, un BLG terapija varēja efektīvi novērst šo samazināšanos (7.C un D attēls).
7. attēls. BLG palielina seruma GLP-1 līmeni un resnās zarnas Gcg, GPR41 un GRP43 mRNS ekspresiju ar DSS apstrādātām pelēm. (A) Gcg mRNS ekspresija resnās zarnas audos; (B) GLP-1 līmenis serumā; (C) GPR41 mRNS ekspresija resnās zarnas audos; (D) GPR43 mRNS ekspresija resnās zarnas audos. Dati ir attēloti kā vidējais ± SEM (n = 5–6). #p < 0,05 vai ##p < 0,01 salīdzinājumā ar kontroles (Con) grupu; *p < 0,05 salīdzinājumā ar DSS grupu.
Tā kā BLG terapija varēja palielināt GLP-1 līmeni serumā, resnās zarnas Gcg mRNS ekspresiju un fekāliju SCFA līmeni ar DSS apstrādātām pelēm, mēs tālāk pētījām acetāta, propionāta un butirāta, kā arī kontroles (F-Con), DSS kolīta (F-Con) (DSS) un BLG apstrādātas kolīta (F-BLG) peles ietekmi uz GLP-1 izdalīšanos no primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām. Kā parādīts 8.A attēlā, primārās peļu resnās zarnas epitēlija šūnas, kas apstrādātas attiecīgi ar 2 mM etiķskābi, propionskābi un sviestskābi, ievērojami stimulēja GLP-1 izdalīšanos, kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem.29,30 Tāpat visi F-Con, F-DSS un F-BLG (kas atbilst 0,25 g fekāliju) ievērojami stimulēja GLP-1 izdalīšanos no primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām. Jāatzīmē, ka GLP-1 daudzums, ko izdalīja ar F-DSS apstrādātās primārās peļu resnās zarnas epitēlija šūnas, bija daudz mazāks nekā ar F-Con un F-BLG apstrādātās primārās peļu resnās zarnas epitēlija šūnas.(8. attēls) 8B). Šie dati liecina, ka BLG terapija ievērojami atjaunoja zarnu SCFA atvasinātā GLP-1 ražošanu.
8. attēls. No BLG atvasinātas īsās ķēdes taukskābes (SCFA) stimulē GLP-1 izdalīšanos no primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām. (A) Etiķskābe, propionskābe un sviestskābe stimulēja GLP-1 izdalīšanos no primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām; (B) fekāliju ekstrakti F-Con, F-DSS un F-BLG stimulēja primārās peļu resnās zarnas epitēlija šūnas. Izdalītā GLP-1 daudzums. Resnās zarnas epitēlija šūnu alikvotas tika ievietotas Petri trauciņos ar stikla dibenu un apstrādātas ar 2 mM etiķskābi, propionskābi, sviestskābi un fekāliju ekstraktiem F-Con, F-DSS un F-BLG (atbilst 0,25 g fekālijām). 2 stundas 37°C temperatūrā, 5% CO2 atmosfērā. No primārajām peļu resnās zarnas epitēlija šūnām izdalītā GLP-1 daudzums tika noteikts ar ELISA metodi. Dati ir norādīti kā vidējais ± SEM (n = 3). #p < 0,05 vai ##p < 0,01 pret tukšo vai F-Con; *p < 0,05 salīdzinājumā ar F-DSS.
Saīsinājumi: Ace, etiķskābe; Pro, propionskābe; tomēr, sviestskābe; F-Con, fekāliju ekstrakts no kontroles pelēm; F-DSS, fekāliju ekstrakts no kolīta pelēm; F-BLG, no BLG apstrādātas resnās zarnas. Iekaisuma peļu fekāliju ekstrakti.
Čūlaino kolītu (UC), ko Pasaules Veselības organizācija ir klasificējusi kā rezistentu slimību, kļūst par globālu apdraudējumu; Tomēr efektīvas metodes slimības prognozēšanai, profilaksei un ārstēšanai joprojām ir ierobežotas. Tāpēc ir steidzami jāizpēta un jāizstrādā jaunas drošas un efektīvas čūlainā kolīta (ČK) terapeitiskās stratēģijas. Tradicionālās ķīniešu medicīnas preparāti ir daudzsološa iespēja, jo gadsimtu gaitā ir pierādīts, ka daudzi tradicionālās ķīniešu medicīnas preparāti ir efektīvi ČK ārstēšanā Ķīnas iedzīvotājiem, un tie visi ir bioloģiski organiski un dabīgi materiāli, kas lielākoties ir nekaitīgi cilvēkiem un dzīvniekiem.31,32 Šī pētījuma mērķis bija atrast drošu un efektīvu tradicionālās ķīniešu medicīnas preparātu ČK ārstēšanai un izpētīt tā darbības mehānismu.BLG ir labi pazīstama ķīniešu augu izcelsmes formula, ko lieto gripas ārstēšanai.8,33 Mūsu laboratorijas un citu pētījumu rezultāti ir parādījuši, ka indigo, pārstrādāts tradicionālās ķīniešu medicīnas produkts no tās pašas izejvielas kā BLG, uzrāda ievērojamu efektivitāti ČK ārstēšanā cilvēkiem un dzīvniekiem.4,34 Tomēr BLG antikolīta iedarbība un tā ietekme Mehānisms nav skaidrs. Pašreizējā pētījumā mūsu rezultāti liecina, ka BLG efektīvi mazina DSS izraisīto resnās zarnas iekaisumu, kas ir saistīts ar zarnu mikrobiotas modulāciju un atjaunošanu. no zarnām iegūta GLP-1 ražošana.
Ir labi zināms, ka ČK raksturo recidivējoši periodi ar tipiskām klīniskām pazīmēm, piemēram, svara zudumu, caureju, asiņošanu no taisnās zarnas un plašu resnās zarnas gļotādas bojājumu.35 Tādēļ hronisks recidivējošs kolīts tika ievadīts, ievadot trīs 1,8% DSS ciklus piecas dienas, kam sekoja dzeramā ūdens lietošana septiņas dienas. Kā parādīts 1.B attēlā, svārstīgs svara zudums un DAI rādītāji liecināja par veiksmīgu hroniska recidivējoša kolīta indukciju. Pelēm grupā, kas tika ārstētas ar BLG, no 8. dienas tika novērota augšupejoša atveseļošanās, kas ievērojami atšķīrās no 24. dienas. Tādas pašas izmaiņas tika novērotas arī DAI rādītājā, kas liecina par kolīta klīniskās uzlabošanās uzlabošanos. Runājot par resnās zarnas bojājumiem un iekaisuma stāvokli, pēc BLG terapijas ievērojami uzlabojās arī resnās zarnas garums, resnās zarnas audu bojājumi, kā arī gēnu ekspresija un proinflamatorisko citokīnu TNF-α, IL-1β un IL-6 veidošanās resnās zarnas audos. Kopumā šie rezultāti skaidri parāda, ka BLG ir efektīvs hroniska recidivējoša kolīta ārstēšanā pelēm.
Kā BLG īsteno savu farmakoloģisko iedarbību? Daudzi iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka zarnu mikrobiotai ir galvenā loma ČK patoģenēzē, un uz mikrobiomu balstītas un uz mikrobiomu vērstas terapijas ir parādījušās kā ļoti pievilcīga ČK ārstēšanas stratēģija. Šajā pētījumā mēs parādījām, ka BLG terapija izraisīja būtiskas izmaiņas zarnu mikrobiotas sastāvā, kas liecina, ka BLG aizsargājošā iedarbība pret DSS izraisītu kolītu ir saistīta ar zarnu mikrobiotas modulāciju. Šis novērojums atbilst uzskatam, ka zarnu mikrobiotas homeostāzes pārprogrammēšana ir svarīga pieeja, lai izprastu TCM preparātu efektivitāti.36,37 Jāatzīmē, ka Akkermansia ir gramnegatīva un stingri anaeroba baktērija, kas dzīvo zarnu gļotu slānī un noārda mucīnus, ražo propionskābi, stimulē kausveida šūnu diferenciāciju un uztur gļotādas barjeras integritātes funkciju.26 Vairāki klīniskie un dzīvnieku dati liecina, ka Akkermansia ir ļoti saistīta ar veselīgu gļotādu38 un Akkermansia spp. iekšķīga lietošana. var ievērojami uzlabot gļotādas iekaisumu.39 Mūsu pašreizējie dati liecina, ka pēc BLG apstrādes Akkermansia relatīvais daudzums ir ievērojami palielinājies. Turklāt Prevotellaceae_UCG-001 ir SCFA producējoša baktērija.27 Vairāki pētījumi liecina, ka Prevotellaceae_UCG-001 tika atrasts nelielā relatīvajā daudzumā dzīvnieku ar kolītu fekālijās.40,41 Mūsu pašreizējie dati arī liecina, ka BLG apstrāde var ievērojami palielināt Prevotellaceae_UCG-001 relatīvo daudzumu DSS apstrādātu peļu resnajā zarnā. Turpretī Oscillibacter ir mezofila, stingri anaerobā baktērija.42 ziņots, ka Oscillibacter relatīvais daudzums bija ievērojami palielinājies UC pelēm un bija būtiski pozitīvi korelēts ar IL-6 un IL-1β līmeni un patoloģiskajiem rādītājiem.43,44 Jāatzīmē, ka BLG apstrāde ievērojami samazināja Oscillibacter relatīvo daudzumu DSS apstrādātu peļu fekālijās. Jāatzīmē, ka šīs BLG izmainītās baktērijas bija visvairāk SCFA producējošās baktērijas. Daudzi iepriekšējie pētījumi ir pierādījuši SCFA potenciālo labvēlīgo ietekmi. uz resnās zarnas iekaisumu un zarnu epitēlija integritātes aizsardzību.45,46 Mūsu pašreizējie dati arī novēroja, ka ar DSS apstrādātām pelēm fekālijās ievērojami palielinājās SCFA acetāta, propionāta un butirāta koncentrācija. Kopumā šie atklājumi skaidri parāda, ka BLG terapija var efektīvi veicināt DSS izraisītu SCFA producējošo baktēriju daudzumu pelēm ar hronisku recidivējošu kolītu.
GLP-1 ir inkretīns, kas galvenokārt tiek ražots ileumā un resnajā zarnā, un tam ir svarīga loma kuņģa iztukšošanās aizkavēšanā un pēcēdienreizes glikozes līmeņa pazemināšanā asinīs.47 Pierādījumi liecina, ka dipeptidilpeptidāze (DPP)-4, GLP-1 receptoru agonists un GLP-1 nanomedicīna, var efektīvi mazināt zarnu iekaisumu pelēm.48–51 Kā ziņots iepriekšējos pētījumos, augsta īsķēžu taukskābju (ĪĶT) koncentrācija bija saistīta ar GLP-1 līmeni plazmā cilvēkiem un pelēm.52 Mūsu pašreizējie dati liecina, ka pēc BLG terapijas ievērojami palielinājās GLP-1 līmenis serumā un Gcg mRNS ekspresija.Tāpat GLP-1 sekrēcija ievērojami palielinājās resnās zarnas kultūrās pēc stimulācijas ar fekāliju ekstraktiem no BLG ārstētām kolīta pelēm, salīdzinot ar stimulāciju ar fekāliju ekstraktiem no DSS ārstētām kolīta pelēm.Kā īsķēžu taukskābju (ĪĶT) ietekmē GLP-1 izdalīšanos?Gvena Tolhursta u.c. ziņoja, ka SCFA var stimulēt GLP-1 sekrēciju caur GRP43 un GPR41.29 Mūsu pašreizējie dati arī liecina, ka BLG apstrāde ievērojami palielina GRP43 un GPR41 mRNS ekspresiju DSS apstrādātu peļu resnajā zarnā. Šie dati liecina, ka BLG apstrāde var atjaunot SCFA veicināto GLP-1 ražošanu, aktivizējot GRP43 un GPR41.
BLG ir ilgstošas ​​lietošanas bezrecepšu (OTC) zāles Ķīnā. Maksimālā panesamā BLG deva Kunmingas pelēm ir 80 g/kg, un nav novērota akūta toksicitāte.53 Pašlaik ieteicamā BLG deva (bez cukura) cilvēkiem ir 9–15 g/dienā (3 reizes dienā). Mūsu pētījums parādīja, ka BLG 1 g/kg devā mazināja DSS izraisītu hronisku recidivējošu kolītu pelēm. Šī deva ir tuvu klīniski lietotajai BLG devai. Mūsu pētījumā arī tika atklāts, ka tā darbības mehānismu vismaz daļēji ietekmē izmaiņas zarnu mikrobiotā, īpaši SCFA producējošās baktērijas, piemēram, Akkermansia un Prevotellaceae_UCG-001, lai atjaunotu no zarnām iegūtu GLP-1 ražošanu. Šie atklājumi liecina, ka BLG ir pelnījis turpmāku apsvēršanu kā potenciālu terapeitisku līdzekli klīniskā kolīta ārstēšanai. Tomēr precīzs mehānisms, ar kuru tas modulē zarnu mikrobiotu, vēl jāapstiprina, izmantojot mikrobiotas deficīta peles un fekāliju baktēriju transplantāciju.
Ace, etiķskābe; but, sviestskābe; BLG, pandāns; DSS, dekstrāna nātrija sulfāts; DAI, slimības aktivitātes indekss; DPP, dipeptidilpeptidāze; FID, liesmas jonizācijas detektors; F-Con, kontrole, peļu fekāliju ekstrakti; F-DSS, DSS kolīta peļu fekāliju ekstrakti; F-BLG, ar BLG ārstētu kolīta peļu fekāliju ekstrakti; GLP-1, glikagonam līdzīgais peptīds-1; Gcg, glikagons; gāzu hromatogrāfija, gāzu hromatogrāfija; GRP43, ar G proteīnu saistīts receptors 43; GRP41, ar G proteīnu saistīts receptors 41; H&E, hematoksilīna eozīns; HBSS, Hanksa līdzsvarotais sāls šķīdums; OTC, OTC; PCA, galveno komponentu analīze; PCoA, galveno koordinātu analīze; Pro, propionskābe; SASP, sulfasalazīns; SCFA, īsās ķēdes taukskābes; ķīniešu medicīna, tradicionālā ķīniešu medicīna; Čūlains kolīts, čūlainais kolīts.
Visus eksperimentālos protokolus apstiprināja Pekinas Universitātes Šeņdžeņas un Honkongas Zinātnes un tehnoloģiju universitātes Medicīnas centra (Šeņdžeņa, Ķīna) Dzīvnieku ētikas komiteja saskaņā ar Institucionālajām vadlīnijām un dzīvnieku noteikumiem (ētikas numurs A2020157).
Visi autori sniedza nozīmīgu ieguldījumu koncepcijas un dizaina izstrādē, datu iegūšanā vai datu analīzē un interpretācijā; piedalījās raksta sagatavošanā vai svarīga intelektuālā satura kritiskā pārskatīšanā; piekrita iesniegt manuskriptu pašreizējam žurnālam; galīgi apstiprināja publicēšanai paredzēto versiju; bija atbildīgi par visiem darba aspektiem.
Šo darbu atbalstīja Ķīnas Nacionālais dabaszinātņu fonds (81560676 un 81660479), Šeņdžeņas Universitātes pirmās klases projekts (86000000210), Šeņdžeņas Zinātnes un tehnoloģiju inovāciju komitejas fonds (JCYJ20210324093810026) un Guandunas provinces Medicīnas zinātnes un tehnoloģiju pētniecības fonds (A2020157 un A2020272), Guidžou Medicīnas universitātes aptieka, ko finansē Key Laboratory (YWZJ2020-01), un Pekinas Universitātes Šeņdžeņas slimnīca (JCYJ2018009).
1. Tang B, Zhu J, Zhang B u.c. Triptolīda terapeitiskais potenciāls kā pretiekaisuma līdzeklis dekstrāna nātrija sulfāta izraisīta eksperimentāla kolīta gadījumā pelēm. pre-immune.2020;11:592084.doi: 10.3389/fimmu.2020.592084
2. Kaplans GG. IBD globālā nasta: no 2015. līdz 2025. gadam. Nat Rev Gastroenterol Hepatol.2015;12:720–727.doi: 10.1038/nrgastro.2015.150
3. Peng J, Zheng TT, Li Xue u.c. Augu izcelsmes alkaloīdi: daudzsološi slimības modifikatori iekaisīgu zarnu slimību gadījumā. Prepharmacology.2019;10:351.doi:10.3389/fphar.2019.00351
4. Sjao Haitengs, Pens Dzje, Veņs B u. c. Indigo Naturalis nomāc resnās zarnas oksidatīvo stresu un Th1/Th17 atbildes reakcijas DSS izraisīta kolīta gadījumā pelēm. Oxid Med Cell Longev.2019;2019:9480945.doi: 10.1155/2019/9480945
5. Čens M., Dings J., Tongs Z. Sophora flavescens (Sophora flavescens) efektivitāte un drošība ķīniešu augu izcelsmes zālēs čūlainā kolīta ārstēšanā: klīniskie pierādījumi un iespējamie mehānismi. Prepharmacology.2020;11:603476.doi:10.3389/fphar.2020.603476
6. Cao Fang, Liu Dzje, Ša Bensjin, Pan HF. Dabiski produkti: eksperimentāli efektīvas zāles iekaisīgu zarnu slimību ārstēšanai. Curr Pharmaceuticals. 2019;25:4893–4913. doi: 10.2174/1381612825666191216154224
7. Džans C., Dzjans M., Lu A. Pārdomas par čūlainā kolīta adjuvantu ārstēšanu ar tradicionālo ķīniešu medicīnu. Clinical Rev Allergy Immunization. 2013;44:274–283. doi: 10.1007/s12016-012-8328-9
8. Li Zhongteng, Li Li, Chen TT u.c. Banlangen granulu efektivitāte un drošība sezonālās gripas ārstēšanā: randomizēta kontrolēta pētījuma protokols.trial.2015;16:126.doi: 10.1186/s13063-015-0645-x