Olbaltumvielu šķirošana sekrēcijas ceļā ir būtiska šūnu nodalījuma un homeostāzes uzturēšanai. Papildus čaulas mediētajai šķirošanai, lipīdu loma kinezīnu šķirošanā sekrēcijas transporta procesā ir ilgstošs pamatjautājums, uz kuru vēl nav atbildēts. Šeit mēs veicam vienlaicīgu 3D daudzkrāsu augstas izšķirtspējas reāllaika attēlveidošanu, lai in vivo pierādītu, ka jaunizveidoti glikozilfosfatidilinozitola imobilizēti proteīni ar ļoti garām keramīda lipīdu daļām ir grupēti un klasificēti specializētās endoplazmas tīkla izejas vietās, kas atšķiras no transmembrānu proteīnu izmantotās. Turklāt mēs parādām, ka keramīda ķēdes garums endoplazmatiskā tīkla membrānā ir kritiski svarīgs šai šķirošanas selektivitātei. Mūsu pētījums sniedz pirmos tiešos in vivo pierādījumus olbaltumvielu kravu klasificēšanai, pamatojoties uz lipīdu ķēdes garumu, selektīvās eksporta vietās sekrēcijas ceļā.
Eikariotu šūnās endoplazmatiskajā retikulumā (ER) sintezētie proteīni transportēšanas laikā pa sekrēcijas ceļu tiek sašķiroti, lai nogādātu tos atbilstošā šūnu galamērķī (1). Papildus šķirošanai ar apvalka starpniecību ilgi tika spekulēts, ka noteikti lipīdi var kalpot arī kā selektīvi izejas punkti, sagrupējot tos specifiskos membrānas domēnos, kas specifiski proteīniem (2–5). Tomēr joprojām trūkst tiešu in vivo pierādījumu, kas pierādītu šo iespējamo uz lipīdiem balstīto mehānismu. Lai atrisinātu šo pamatproblēmu, mēs raugā pētījām, kā glikozilfosfatidilinozitola (GPI) noenkurotie proteīni (GPI-AP) tiek atšķirīgi eksportēti no ER. GPI-AP ir dažādi ar lipīdiem saistīti šūnu virsmas proteīni (6, 7). GPI-AP ir sekrēts proteīns, kas piestiprināts pie plazmas membrānas ārējām lapiņām caur glikolipīda daļu (GPI enkurs). Tie pieņem GPI enkurus kā konservatīvas pēctranslācijas modifikācijas ER lūmenā (8). Pēc piestiprināšanās GPI-AP caur Goldži aparātu (5, 9) no ER nonāk plazmas membrānā. GPI enkuru klātbūtne izraisa GPI-AP atsevišķu transportēšanu no transmembrānas sekrēcijas proteīniem (tostarp citiem plazmas membrānas proteīniem) pa sekrēcijas ceļu (5, 9, 10). Rauga šūnās GPI-AP tiek atdalīti no citiem sekrēcijas proteīniem endoplazmatiskajā retikulumā un pēc tam iepakoti unikālos pūslīšos, ko aptīt apvalka proteīnu komplekss II (COPII) (6, 7). Šī klasifikācijas procesa noteicošie faktori ER eksporta procesā nav skaidri, taču tiek pieņemts, ka šim mehānismam var būt nepieciešami lipīdi, īpaši GPI enkura lipīdu daļas strukturālā pārveidošana (5, 8). Raugā GPI lipīdu pārveidošana sākas tūlīt pēc GPI piestiprināšanās, un daudzos gadījumos tā izraisa ceramīda saistīšanos ar 26 oglekļa atomu garās ķēdes piesātināto taukskābi (C26:0) (11, 12). C26 ceramīds ir galvenais ceramīds, ko līdz šim ražo rauga šūnas. Tas tiek sintezēts ER, un lielākā daļa no tā tiek eksportēta uz Goldži aparātu caur COPII pūslīšiem (13). GPI-AP eksports uz ER īpaši prasa nepārtrauktu ceramīda sintēzi (14, 15), un savukārt ceramīda pārvēršana par inozitola fosfāta ceramīdu (IPC) Goldži aparātā ir atkarīga no GPI enkura sintēzes (16). Biofizikālie pētījumi ar mākslīgām membrānām ir parādījuši, ka ļoti garas acilķēdes ceramīdi var saplūst, veidojot sakārtotus domēnus ar unikālām fizikālām īpašībām (17, 18). Šie dati noved pie hipotēzes, ka C26 ceramīds un GPI-AP ar C26 ceramīdu izmanto savas fizikālās īpašības, lai saplūstu sakārtotos reģionos vai reģionos relatīvi haotiskajā ER membrānas lipīdu vidē. Tā galvenokārt sastāv no īsiem un nepiesātinātiem glicerolipīdiem (C16:1 un C18:1) (19, 20). Šie reģioni tiks selektīvi fokusēti uz specifiskām ER izejas vietām (ERES), kur ceramīdu un uz ceramīdiem balstīto GPI-AP var kopīgi transportēt uz Goldži aparātu vienā un tajā pašā īpašajā COPII pūslī (5).
Šajā pētījumā mēs tieši pārbaudījām šo uz lipīdiem balstīto mehānismu, izmantojot augstas izšķirtspējas konfokālo reāllaika attēlveidošanas mikroskopiju (SCLIM), kas ir vismodernākā mikroskopijas metode, kas var vienlaikus novērot fluorescenti iezīmētas olbaltumvielas. Trīskrāsu un trīsdimensiju (3D) attēliem ir ārkārtīgi augsta izšķirtspēja un ātrums dzīvās šūnās (21, 22).
Vispirms mēs izmantojām SCLIM tehnoloģiju, lai sīkāk definētu, kā normāls GPI-AP ar C26 keramīda grupu tika atsijāts no transmembrānas sekrēcijas proteīniem pēc aiziešanas no ER S. cerevisiae. Lai pārbaudītu ER klasifikāciju, mēs izmantojām ģenētisko sistēmu, kas var tieši vizualizēt jaunizveidoto kravu, kas nonāk ERES in vivo (7, 23). Kā kravu mēs izvēlējāmies uz C26 keramīda bāzes veidoto GPI-AP Gas1, kas iezīmēts ar zaļu fluorescējošu proteīnu (GFP), un transmembrānas sekrēcijas proteīnu Mid2, kas iezīmēts ar tuvā infrasarkanā starojuma fluorescējošu proteīnu (iRFP), kas abi ir vērsti uz plazmas membrānu (24–26). Temperatūrai jutīgajā sec31-1 mutantā šīs divas kravas tiek ekspresētas zem galaktozes inducējama promotera un konstitutīva ERES marķiera. Ekstremālā temperatūrā (37°C), tā kā sec31-1 mutācija ietekmē COPII apvalka komponenta Sec31 funkciju kavēt COPII dīgšanu un ER eksportu, jaunizveidotā krava uzkrājas ER (23). Pēc atdzesēšanas līdz zemai temperatūrai (24°C) sec31-1 mutantu šūnas atguvās no sekrēcijas zonas, un uzkrātā jaunā sintētiskā krava sāka tikt eksportēta no ER. CLIM vizualizācija parādīja, ka lielākā daļa no jaunintezētajiem Gas1-GFP un Mid2-iRFP joprojām uzkrājās sec31-1 mutantu šūnu ER pēc inkubācijas 37°C temperatūrā un pēc tam tika atbrīvoti 24°C temperatūrā 5 minūtes (1. attēls). Tā kā Mid2-iRFP ir izkliedēts pa visu ER membrānu un Gas1-GFP ir koncentrēts un uzkrāts pārtrauktajā ER membrānas zonā, to sadalījums ir pilnīgi atšķirīgs (1. attēls, A līdz C un 1. papildvideo). Turklāt, kā parādīts 1.D attēlā, Gas1-GFP klasterī nav Mid2-iRFP. Šie rezultāti liecina, ka GPI-AP un transmembrānas proteīni jau agrīnā stadijā tika atdalīti dažādos ER membrānas reģionos. Gas1-GFP klasteris atrodas blakus specifiskam ERES, kas marķēts ar mCherry COPII apvalka proteīnu Sec13 (1. attēls, E un F, un S1 filma) (23).
sec31-1 šūnas ekspresē galaktozes inducētus sekrētus, garas acilķēdes (C26) keramīdu GPI-AP Gas1-GFP (GPI-AP, zaļš) un transmembrānas proteīnu Mid2-iRFP (TMP, zils), un šī konstruktīvā ERES marķēšana Sec13-mCherry (ERES, fuksīna krāsā) tika inkubēta 37°C temperatūrā 30 minūtes, pārvietota uz 24°C un 5 minūtes vēlāk attēlota ar SCLIM. (A līdz C) parāda reprezentatīvu apvienotu vai atsevišķu plaknes 2D attēlu (A), 10 z-sekciju 2D projekcijas attēlu (B) vai kravas un ERES marķieru 3D šūnas puslodes attēlu (C). Mēroga josla 1μm (A un B). Mēroga vienība ir 0,551μm (C). Gas1-GFP tika konstatēts atsevišķos ER reģionos vai klasteros, savukārt Mid2-iRFP tika konstatēts un izplatīts visā ER membrānā (C). (D) Grafikā parādīta Gas1-GFP un Mid2-iRFP relatīvā fluorescences intensitāte Gas1-GFP klasterī gar balto bultiņas līniju (pa kreisi). AU, patvaļīga vienība. (E un F) apzīmē 3D attēlu, kas apvieno preces un ERES atzīmi. Gas1-GFP klasteri tika konstatēti netālu no konkrētā ERES. Mēroga vienība ir 0,551 μm. (F) Baltā nepārtrauktā bultiņa iezīmē ar ERES saistīto Gas1-GFP klasteri. Vidējais un labais panelis parāda apvienoto palielināto 3D attēlu un izvēlētā Gas1-GFP klastera pagrieztu skatu.
Ciešā telpiskā saistība starp Gas1-GFP klasteri un specifisku ERES norāda, ka Gas1-GFP var iekļūt selektīvā ERES, kas atšķiras no Mid2-iRFP izmantotās selektivitātes, lai izietu no ER. Lai risinātu šo iespēju, mēs kvantitatīvi noteicām ERES attiecību tikai vienai vai divām precēm (2. attēls, A līdz C). Mēs atklājām, ka lielākā daļa ERES (70%) satur tikai viena veida kravu. 2.C attēla apakšējā attēlā redzami divi tipiski ERES piemēri, kuros ir tikai Gas1-GFP (1. attēls) vai tikai Mid2-iRFP (2. attēls). Turpretī aptuveni 20% ERES satur divas kravas, kas pārklājas vienā apgabalā. Tika konstatēts, ka daži ERES (10%) saturēja divu veidu kravas, bet tie bija izolēti skaidri atšķirīgās zonās. Tādēļ šī statistiskā analīze parāda, ka pēc ER eksportēšanas GPI-AP Gas1-GFP un transmembrānas krava Mid2-iRFP tiek sadalītas dažādās ERES (2.D attēls). Šī šķirošanas efektivitāte ļoti atbilst iepriekšējai bioķīmiskajai analīzei (6) un morfoloģiskajai noteikšanai (7). Mēs varam arī novērot karantīnās kravas uzvedību, nonākot ERES (2.E attēls un 2. papildvideo). 2.E attēlā redzams, ka tikai neliela Gas1-GFP (3. panelis) vai Mid2-iRFP (4. panelis) daļa nonāk ERES no vienas puses un ir norobežota atsevišķā zonā. 2.E attēla 5. panelī redzams, ka Gas1-GFP un Mid2-iRFP dažreiz ir atrodami vienā un tajā pašā ERES, bet tie nonāk no dažādām pusēm un ir koncentrēti atsevišķos reģionos, kas var pārstāvēt dažādas COPII vezikulas. Mēs arī apstiprinājām, ka novērotā C26 ceramīdu bāzes GPI-AP Gas1 atdalīšana un klasifikācija kā selektīvai ERES ir specifiska, jo cita transmembrānas sekrēcijas krava, ar GFP iezīmētais plazmas membrānas proteīns Axl2 (27), uzrāda līdzīgu uzvedību kā Mid2-iRFP. (1. papildvideo un 3. papildvideo). Jaunsintezētais Axl2-GFP tiek izplatīts caur ER membrānu tāpat kā Mid2-iRFP (S1., A un B attēls) un ir kolokalizēts ar Mid2-iRFP lielākajā daļā ERES (S1., B līdz D attēls). 1. attēla 1. un 2. panelī. S1C ir parādīti divi tipiski ERES piemēri, kur divas transmembrānas kravas pārklājas. Šādos gadījumos abas preces nonāk ERES kopā (S1.E attēls, 3. panelis un S3 video).
sec31-1 šūnas, kas ekspresē galaktozes inducējamus sekrētus, Gas1-GFP (GPI-AP, zaļa) un Mid2-iRFP (TMP, zila), un konstitutīvu ERES marķējumu Sec13-mCherry (ERES, fuksīna krāsā), tika ievietotas 37 °C temperatūrā. Pēc 30 minūšu inkubācijas °C temperatūrā pārvietojiet uz 24 °C, lai atbrīvotu sekrēcijas bloku, un pēc 20 minūtēm izveidojiet attēlu ar SCLIM. (A līdz C) Reprezentatīvi 2D projekcijas attēli (A; mēroga josla, 1 μm) vai 3D šūnu puslodes attēli (B un C; mēroga vienība, 0,456 μm) no kravas un 10 z-griezumiem, kas apzīmēti ar ERES. Apakšējā panelī (B) un panelī (C) ir parādīti apstrādāti attēli, lai parādītu tikai ERES esošās preces (fuksīna krāsā) [Gas1-GFP (pelēka) un Mid2-iRFP (gaiši zila)]. (C) Atvērta bultiņa: ERES pārvadā tikai vienu kravas vienību (no 1 līdz 4). Pelēka bultiņa: ERES satur segregētu kravu (5). Balta nepārtraukta bultiņa: ERES satur kopā novietotu kravu. Zemāk: Atlasītā atsevišķā ERES satur tikai Gas1-GFP (1) vai Mid2-iRFP (2). Mēroga josla, 100 nm. (D) (C) aprakstītā fotomikrogrāfa kvantitatīvā noteikšana. Vidējais ERES procentuālais daudzums, kas satur tikai vienu kravu (Gas1-GFP vai Mid2-iRFP), segregētu kravu un pārklājošos kravu. Trīs neatkarīgos eksperimentos n = 432 54 šūnās. Kļūdu josla = SD. Divpusējs nepāra t tests. *** P = 0,0002. (E) Atlasītās karantīnas kravas ERES 3D attēls, kas atzīmēts ar (C). Gas1-GFP (zaļa) (3) vai Mid2-iRFP (zila) (4) nonāk ERES (fuksīna krāsā) no vienas puses un ir ierobežota nelielā apgabalā ERES ietvaros. Dažreiz abu veidu kravas nonāk vienā ERES (5) no vienas puses un ir ierobežotas izolētā apgabalā ERES ietvaros. Mēroga josla, 100 nm.
Pēc tam mēs pārbaudījām hipotēzi, ka ER membrānā esošā garās acilķēdes keramīds (C26) veicina Gas1 specifisku klasterizāciju un šķirošanu selektīvos ERES. Šim nolūkam mēs izmantojām modificētu rauga celmu GhLag1, kurā divas endogēnās keramīda sintāzes Lag1 un Lac1 tika aizstātas ar GhLag1 (kokvilnas Lag1 homologs), kā rezultātā radās rauga celms ar šūnu membrānas keramīda celmu, kas ir īsāks nekā savvaļas tipa celms (3.A attēls) (28). Masas spektrometrijas (MS) analīze parādīja, ka savvaļas tipa celmos 95% no kopējā keramīda ir ļoti garas (C26) ķēdes keramīds, savukārt GhLag1 celmā 85% no kopējā keramīda ir ļoti garas (C18 un C16) ķēdes keramīds. Tikai 2% no keramīda ir ļoti garas (C26) ķēdes keramīds. Lai gan C18 un C16 keramīdi ir galvenie keramīdi, kas līdz šim atklāti GhLag1 membrānā, MS analīze arī apstiprināja, ka GhLag1 celmā ekspresētā Gas1-GFP GPI enkurs satur C26 keramīdu, kas ir salīdzināms ar savvaļas tipa lipīdiem. Kvalitāte ir tāda pati (3.A att.) (26). Tas nozīmē, ka keramīda remodelēšanas enzīms Cwh43 ir ļoti selektīvs pret C26 keramīdu, kā parādīts 26. attēlā, tas priekšroku dod GPI enkura iestrādāšanai no neliela daudzuma C26 keramīda GhLag1 celmā. S2 (29). Tomēr GhLag1 šūnu membrāna pamatā satur tikai C18-C16 keramīdu, savukārt Gas1-GFP joprojām satur C26 keramīdu. Šis fakts padara šo celmu par ideālu instrumentu, lai īpaši atrisinātu membrānas keramīda acilķēdes garuma problēmu ER. Hipotētiskā klases un šķirošanas loma. Pēc tam mēs vispirms pētījām C26 Gas1-GFP spēju uzkrāties klasteros GhLag1 ar temperatūras jutīgu sec31-1 mutanta alēli, izmantojot parasto fluorescences mikroskopiju, kur ER membrānas keramīdā pastāv tikai garā (C18-C16) ķēde (3. att.). Mēs novērojām, ka sec31-1 lielākā daļa Gas1-GFP bija koncentrēta klasteros, savukārt Gas1-GFP sec31-1 GhLag1 ar garu (C18-C16) garu keramīda ER membrānu galvenokārt nebija klasterizēts un bija izkliedēts visā ER membrānā. Precīzāk sakot, tā kā uz C26 keramīda balstīta klasterizācija ir cieši saistīta ar specifisku ERES (1. attēls), mēs tālāk pētījām, vai šajā procesā var būt iesaistīta arī ER eksporta olbaltumvielu mehānisma funkcija. GPI-AP ER eksportam izmanto īpašu COPII sistēmu, ko aktīvi regulē Ted1 strukturālā GPI enkura glikāna daļas pārveidošana (30, 31). Pēc tam rekombinanto GPI-glikānu atpazīst transmembrānas kravas receptora p24 komplekss, kas savukārt selektīvi piesaista Lst1, kas ir specifiska galvenās COPII kravas saistošās apakšvienības Sec24 izoforma, veidojot GPI-AP bagātu COPII vezikulu veidošanos (31–33). Tāpēc mēs konstruējām dubultmutantu, kas apvienoja šo atsevišķo proteīnu (p24 kompleksa komponenta Emp24, GPI-glikāna pārveidošanas enzīma Ted1 un specifiskās COPII apakšvienības Lst1) delēciju ar sec31-1 mutanta celmu un pētījām, vai ir iespējams veidot Gas1 klastera GFP (3. attēls). Mēs novērojām, ka sec31-1emp24Δ un sec31-1ted1Δ celmos Gas1-GFP galvenokārt ir neklāsterizēts un izkliedēts pa visu ER membrānu, kā iepriekš novērots sec31-1 GhLag1 celmā, savukārt sec31-1lst1Δ celmā Gas1-GFP, tāpat kā sec31-1. Šie rezultāti norāda, ka papildus C26 ceramīda klātbūtnei ER membrānā, Gas1-GFP klasterizācijai ir jāsaistīties arī ar p24 kompleksu, un tai nav nepieciešama specifiska Lst1 piesaiste. Pēc tam mēs pētījām iespēju, ka ceramīda ķēdes garums ER membrānā var regulēt Gas1-GFP saistīšanos ar p24. Tomēr mēs atklājām, ka C18-C16 ceramīda klātbūtne membrānā neietekmē p24 kompleksa rekonstruētos GPI-glikānus (S3. un S4., A un B attēls) vai saistīšanos ar GPI-AP un GPI-AP eksportēšanas spēju. COPII apakštipa Lst1 piesaiste (S4C attēls). Tāpēc C26 ceramīda atkarīgajai klasterizācijai nav nepieciešama olbaltumvielu mijiedarbība ar dažādiem ER eksporta olbaltumvielu mehānismiem, bet tā atbalsta alternatīvu šķirošanas mehānismu, ko virza lipīdu garums. Pēc tam mēs analizējām, vai ceramīda acilķēdes garums ER membrānā ir svarīgs Gas1-GFP efektīvai klasificēšanai kā selektīvam ERES. Tā kā GhLag1 celmā esošais Gas1 ar īsas ķēdes keramīdu atstāj ER un nonāk plazmas membrānā (S5. attēls), mēs uzskatām, ka, ja šķirošanu nosaka keramīda acilķēdes garums, GhLag1 celmā esošo Gas1 var novirzīt un šķērsot. ERES preces ar to pašu membrānu.
(A) GhLag1 šūnu membrāna galvenokārt satur īsākus C18-C16 keramīdus, savukārt Gas1-GFP GPI enkuram joprojām ir tāds pats C26 IPC kā savvaļas tipa šūnām. Augšpusē: keramīda acilķēdes garuma analīze savvaļas tipa (Wt) un GhLag1p celmu šūnu membrānā, izmantojot masas spektrometriju (MS). Dati atspoguļo kopējā keramīda procentuālo daudzumu. Trīs neatkarīgu eksperimentu vidējais rādītājs. Kļūdu josla = SD. Divpusējs nepāra t tests. **** P <0,0001. Apakšējais panelis: MS analīze IPC acilķēdes garumam, kas atrodas Gas1-GFP (GPI-IPC) GPI enkurā, kas ekspresēts savvaļas tipa un GhLag1p celmos. Dati atspoguļo kopējā IPC signāla procentuālo daudzumu. Piecu neatkarīgu eksperimentu vidējais rādītājs. Kļūdu josla = SD. Divpusējs nepāra t tests. ns, nav svarīgi. P = 0,9134. (B) Galaktozes inducētu Gas1-GFP ekspresējošo sec31-1, sec31-1 GhLag1, sec31-1emp24Δ, sec31-1ted1Δ un sec31-1lst1Δ šūnu fluorescences mikroattēli tika inkubēti 37°C temperatūrā 30 minūtes un pēc 24°C nodoti standarta fluorescences mikroskopijai. Baltā bultiņa: ER Gas1-GFP klasteris. Atvērtā bultiņa: Neklasterots Gas1-GFP ir izkliedēts pa visu ER membrānu, parādot ER raksturīgo kodola gredzena iekrāsojumu. Mēroga josla, 5μm. (C) (B) punktā aprakstītā fotomikroattēla kvantitatīvā noteikšana. Vidējais šūnu procentuālais daudzums ar punktētu Gas1-GFP struktūru. Trīs neatkarīgos eksperimentos n≥300 šūnas. Kļūdu josla = SD. Divpusējs nepāra t tests. **** P <0,0001.
Lai tieši atrisinātu šo problēmu, mēs veicām Gas1-GFP un Mid2-iRFP SCLIM vizualizāciju GhLag1 šūnās ar sec31-1 temperatūras jutīgo mutanta alēli (4. attēls un S4 video). Pēc tam, kad ER tika saglabāts 37°C temperatūrā un pēc tam atbrīvots 24°C temperatūrā, lielākā daļa no jaunizveidotā Gas1-GFP nebija sagrupēta un izkliedēta pa visu ER membrānu, kā to novēroja ar parastajiem mikroskopiem (4. attēls, A un B). Turklāt liela daļa ERES (67%) ietver divu veidu kravas, kas tajā atrodas kopā (4.D attēls). 4.C attēla 1. un 2. panelī parādīti divi tipiski ERES piemēri ar pārklājošos Gas1-GFP un Mid2-GFP. Turklāt abas preces tika piesaistītas vienam un tam pašam ERES (4.E attēls, 3. panelis un S4 video). Tādēļ mūsu rezultāti liecina, ka keramīda acilķēdes garums ER membrānā ir svarīgs ER olbaltumvielu agregācijas un klasifikācijas noteicošais faktors.
Sec31-1 GhLag1 šūnas, kas ekspresē galaktozes inducētus sekrētus, Gas1-GFP (GPI-AP, zaļa) un Mid2-iRFP (TMP, zila) un konstitutīvi ar ERES iezīmētu Sec13-mCherry (ERES, fuksīna krāsā). Inkubēt 37°C temperatūrā. Turpināt 30 minūtes, pazemināt līdz 24°C, lai atbrīvotu sekrētus, un pēc 20 minūtēm attēlot ar SCLIM. (A līdz C) Reprezentatīvi 2D projekcijas attēli (A; mēroga josla, 1μm) vai 3D šūnu puslodes attēli (B un C; mēroga vienība, 0,45μm) no 10 z sekcijām, kas apzīmētas ar kravu un ERES. Apakšējā panelī (B) un panelī (C) ir parādīti apstrādāti attēli, lai parādītu tikai preces, kas atrodas ERES (fuksīna krāsā) [Gas1-GFP (pelēka) un Mid2-iRFP (gaiši zila)]. (C) Balta aizpildīta bultiņa: ERES, preces pārklājas. Atvērta bultiņa: ERES satur tikai vienu vienību. Apakšējais panelis: atlasītajam ERES ir pārklājošās preces (1 un 2), kas atzīmētas (C). Mēroga josla, 100 nm. (D) (C) aprakstītā fotomikrogrāfa kvantitatīvā noteikšana. sec31-1 un sec31-1 GhLag1 vienībās ir iekļauta tikai viena krava (Gas1-GFP vai Mid2-iRFP), un vidējais ERES procentuālais daudzums izolētai kravai un pārklājošai kravai. Trīs neatkarīgos eksperimentos n = 432 54 šūnās (sec31-1) un n = 430 47 šūnās (sec31-1 GhLag1). Kļūdu josla = SD. Divpusējs nepāra t tests. *** P = 0,0002 (sec31-1) un ** P = 0,0031 (sec31-1 GhLag1). (E) atlasītā ERES 3D attēls ar pārklājošo kravu (3), kas atzīmēta (C). Gas1-GFP (zaļš) un Mid2-iRFP (zils) tuvojas ERES (fuksīna krāsā) no vienas puses un paliek tajā pašā ERES ierobežotajā zonā. Mēroga josla, 100 nm.
Šis pētījums sniedz tiešus in vivo pierādījumus tam, ka lipīdu bāzes olbaltumvielu kravas tiek klasificētas selektīvās eksporta vietās sekrēcijas ceļā, un atklāj acilķēdes garuma nozīmi klasifikācijas selektivitātei. Izmantojot jaudīgu un modernu mikroskopijas metodi, ko sauc par SCLIM, mēs demonstrējām jaunizveidoto Gas1-GFP (galveno plazmas membrānas GPI-AP ar ļoti garu acilķēdes (C26) keramīda lipīdu daļu) raugā). Atsevišķos ER klasterizētie reģioni ir saistīti ar specifiskiem ERES, savukārt transmembrānas sekretētie proteīni ir izkliedēti visā ER membrānā (1. attēls). Turklāt šie divu veidu produkti selektīvi nonāk dažādos ERES (2. attēls). Šūnu keramīda acilķēdes garums membrānā tiek samazināts no C26 līdz C18-C16, Gas1-GFP klasteris tiek pārtraukts atsevišķā ER reģionā, un Gas1-GFP tiek novirzīts, lai atstātu ER kopā ar transmembrānas proteīnu caur to pašu ERES (3. attēls un 3.4. attēls).
Lai gan GPI-AP izmanto specializētu olbaltumvielu mehānismu, lai izietu no ER, mēs atklājām, ka C26 keramīdu atkarīgā atdalīšana nav atkarīga no diferenciālās olbaltumvielu mijiedarbības, kas varētu izraisīt ERES specializāciju (S4. un S5. attēls). Tā vietā mūsu atklājumi apstiprina alternatīvu klasifikācijas mehānismu, ko virza uz lipīdiem balstīta olbaltumvielu klasterizācija un sekojoša citu kravu izslēgšana. Mūsu novērojumi liecina, ka Gas1-GFP reģionam vai klasterim, kas saistīts ar konkrētu ERES, trūkst transmembrānas sekretētā proteīna Mid2-iRFP, kas norāda, ka C26 keramīdu atkarīgais GPI-AP klasteris atvieglos to iekļūšanu attiecīgajā ERES un vienlaikus izslēgs transmembrānas sekrēcijas šajā konkrētajā ERES (1. un 2. attēls). Turpretī C18-C16 keramīdu klātbūtne ER membrānā neizraisa GPI-AP reģionu vai klasteru veidošanos, tāpēc tie neizslēdz vai neaizstāj transmembrānas sekretētās olbaltumvielas tajā pašā ERES (3. un 4. attēls). Tāpēc mēs ierosinām, ka C26 keramīds veicina atdalīšanu un klasifikāciju, atvieglojot ar specifisku ERES saistītu olbaltumvielu klasterizāciju.
Kā panākt šo C26 keramīda atkarīgo klasterizāciju noteiktā ER zonā? Membrānas keramīda tendence atdalīties laterāli var izraisīt GPI-AP un C26 keramīda mazu un acumirklī sakārtotu lipīdu veidošanos ER membrānas neregulārākajā lipīdu vidē, kas satur īsākus un nepiesātinātus glicerolipīdus. Kvalitatīvi klasteri (17, 18). Šie mazie pagaidu klasteri pēc saistīšanās ar p24 kompleksu var tikt tālāk sapludināti lielākos, stabilākos klasteros (34). Saskaņā ar to mēs parādījām, ka C26 Gas1-GFP ir jāmijiedarbojas ar p24 kompleksu, lai veidotu lielākus redzamus klasterus (3. attēls). p24 komplekss ir heterozigots oligomērs, kas sastāv no četriem dažādiem p24 transmembrānas proteīniem raugā (35), kas nodrošina daudzvērtīgu saistīšanos, kas var izraisīt mazu GPI-AP klasteru savstarpēju saikni, tādējādi radot lielāku stabilu klasteru (34). Mijiedarbība starp GPI-AP proteīnu ektodomēniem var arī veicināt to agregāciju, kā parādīts to Goldži transportēšanas laikā zīdītāju polarizētās epitēlija šūnās (36). Tomēr, ja ER membrānā ir C18-C16 keramīds, kad p24 komplekss saistās ar Gas1-GFP, lieli atsevišķi klasteri neveidosies. Pamatmehānisms var būt atkarīgs no garās acilķēdes keramīda specifiskajām fizikālajām un ķīmiskajām īpašībām. Mākslīgo membrānu biofizikālie pētījumi liecina, ka, lai gan gan garās (C24), gan īsās (C18-C16) acilķēdes keramīdi var izraisīt fāžu atdalīšanos, tikai garās acilķēdes keramīdi (C24) var veicināt augstu izliekumu un plēves locīšanos, lai pārveidotu plēvi. Savstarpējas atsauces ceļā (17, 37, 38). Ir pierādīts, ka TMED2, cilvēka Emp24 homologa, transmembrānas spirāle selektīvi mijiedarbojas ar C18 keramīda bāzes sfingomielīnu citoplazmatiskajās lobulās (39). Izmantojot molekulārās dinamikas (MD) simulācijas, mēs atklājām, ka gan C18, gan C26 keramīdi uzkrājas ap Emp24 transmembrānas spirāles citoplazmatiskajām lobulām, un tiem ir līdzīgas preferences (S6. attēls). Jāatzīmē, ka tas norāda, ka Emp24 transmembrānas spirāle var izraisīt asimetrisku lipīdu sadalījumu membrānā. Šis ir nesen iegūts rezultāts, kas balstīts uz zīdītāju šūnām. Līdzīgas MD simulācijas arī parāda ētera lipīdu klātbūtni (40). Tāpēc mēs pieņemam, ka C26 keramīds ER26 divās daiviņās ir lokāli bagātināts. Kad GPI-AP lūmena daiviņās tieši saistās ar daudzvērtīgo p24 un C26 keramīda uzkrāšanās ap p24 citoplazmas daiviņās, tas var veicināt pavadošo olbaltumvielu agregāciju un membrānas izliekumu, kas rodas caur pirkstiem (41), izraisot GPI-AP atdalīšanos atsevišķos reģionos blakus ERES, kas arī veicina ER membrānas ļoti izliektos reģionus (42). Iepriekšējie ziņojumi apstiprināja ierosināto mehānismu (43, 44). Oligolektīnu, patogēnu vai antivielu daudzvērtīgā saistīšanās ar ceramīdu bāzes glikosfingolipīdiem (GSL) uz plazmas membrānas izraisa lielu GSL agregāciju, veicina fāžu atdalīšanos un izraisa membrānas deformāciju un internalizāciju (44). Iwabuchi u.c. (43) Tika konstatēts, ka garu (C24), bet ne īsu (C16) acilķēžu klātbūtnē ar GSL laktozilceramīdu saistītais daudzvērtīgais ligands inducēja lielu klasteru veidošanos un membrānas invagināciju, un citoplazmas Lyn mediētā signāla transdukcija uz lapiņām ir savstarpēji savienota ar acilķēdēm savienotajos neitrofilos.
Zīdītāju polarizētās epitēlija šūnās anti-Golgi tīkla (TGN) koncentrācija apikālās plazmas membrānas līmenī kontrolē GPI-AP atdalīšanu un šķirošanu (10, 45). Šo agregāciju veicina GPI-AP oligomerizācija (36), taču tā var būt atkarīga arī no keramīda ķēdes garuma, ko atrodam raugā. Lai gan zīdītāju GPI-AP ir uz ētera lipīdiem balstīts enkurs, un tā ķīmiskā struktūra ļoti atšķiras no ļoti garās acilķēdes keramīda, nesenā pētījumā tika atklāts, ka abiem lipīdiem ir evolucionāri līdzīgas fizikālās un ķīmiskās īpašības un funkcija (40). Tādēļ ētera lipīdu daļa zīdītāju šūnās var būt līdzīga C26 keramīdam raugā, un tās loma ir saistīties ar garās ķēdes keramīdu membrānā, lai veicinātu GPI-AP agregāciju un šķirošanu. Lai gan šī iespēja vēl ir tieši jāpārbauda, ​​iepriekšējie atklājumi apstiprina, ka garās acilķēdes keramīda transportēšanu uz Goldži ķermeni neveic citoplazmas pārneses proteīni, bet gan ir atkarīga no GPI enkuru sintēzes, tāpat kā raugs. Tādēļ šķiet, ka evolucionārais konservatīvais mehānisms spēj selektīvi transportēt ļoti garas acilķēdes ceramīdu un GPI-AP (13, 16, 20, 46, 47) vienā un tajā pašā transporta pūslī.
Rauga un zīdītāju polarizēto epitēlija šūnu sistēmās GPI-AP agregācija un atdalīšanās no citiem plazmas membrānas proteīniem notiek pirms šūnas virsmas sasniegšanas. Paladino et al. (48) atklāja, ka zīdītāju polarizēto epitēlija šūnu TGN GPI-AP klasterizācija ir nepieciešama ne tikai GPI-AP selektīvai klasificēšanai apikālajā plazmas membrānā, bet arī regulē GPI-AP klasterizācijas organizāciju un to bioloģisko aktivitāti. Šūnas virsma. Raugā šis pētījums parādīja, ka C26 keramīda atkarīgais GPI-AP klasteris uz ER var regulēt klastera organizāciju un GPI-AP funkcionālo aktivitāti plazmas membrānā (24, 49). Saskaņā ar šo modeli GhLag1 šūnas ir alerģiskas pret GPI inhibitoriem vai zālēm, kas ietekmē šūnu sieniņas integritāti (28), un nepieciešamība pēc funkcionāliem Gas1-GFP klasteriem (49), kas projicēti uzgaļa keramīda, rauga šūnu pārošanās laikā, norāda uz G​​​ iespējamām hLag1 šūnu fizioloģiskām sekām. GPI-AP kļūda. Tomēr mūsu turpmāko pētījumu priekšmets būs turpmāka pārbaude, vai šūnu virsmas funkcionālā organizācija ir ieprogrammēta no ER, izmantojot šķirošanas metodi, kuras pamatā ir lipīdu garums.
Šajā darbā izmantotie Saccharomyces cerevisiae celmi ir uzskaitīti S1 tabulā. SCLIM MMY1583 un MMY1635 celmi dzīvu šūnu attēlveidošanai tika konstruēti W303 fonā. Šie celmi, kas ekspresē Sec13-mCherry ar fluorescējoša proteīna tagu, tika konstruēti, izmantojot uz polimerāzes ķēdes reakcijas (PCR) balstītu metodi ar pFA6a plazmīdu kā matricu (23). Celms, kas ekspresē Mid2-iRFP, kas iezīmēts ar fluorescējošu proteīnu GAL1 promotera kontrolē, tika konstruēts šādi. iRFP-KanMx sekvences PCR amplifikācija no pKTiRFP-KAN vektora (E. O'Shea dāvana, Addgene plazmīdas numurs 64687; http://n2t.net/addgene: 64687; pētniecības resursa identifikators (RRID): Addgene_64687) un ievietota endogēnā Mid2 C-galā. Pēc Mid2-iRFP genoma sekvences amplifikācijas un klonēšanas GAL1 promotorā tā tika integrēta integrācijas plazmīdas pRS306 Not I-Sac I vietā. Iegūtā plazmīda pRGS7 tika linearizēta ar Pst I, lai integrētos URA3 lokusā.
Gas1-GFP saplūšanas gēns tiek ekspresēts GAL1 promotera kontrolē centromēra (CEN) plazmīdā, kas ir konstruēta šādi. Gas1-GFP secība tika amplificēta ar PCR no pRS416-GAS1-GFP plazmīdas (24) (L. Popolo dāvana) un klonēta CEN plazmīdas pBEVY-GL LEU2 (C dāvana) Xma I–Xho I vietā. Millers; Addgene plazmīdas numurs 51225; http://n2t.net/addgene: 51225; RRID: Addgene_51225). Iegūtā plazmīda tika nosaukta par pRGS6. Axl2-GFP saplūšanas gēns arī tiek ekspresēts pBEVY-GL LEU2 vektora GAL1 promotera kontrolē, un tā konstrukcija ir šāda. Axl2-GFP secība tika amplificēta no pRS304-p2HSE-Axl2-GFP plazmīdas (23) ar PCR palīdzību un klonēta pBEVY-GL LEU2 vektora Bam HI-Pst I vietā. Iegūtā plazmīda tika nosaukta par pRGS12. Šajā pētījumā izmantoto oligonukleotīdu secība ir norādīta S2 tabulā.
Celms tika papildināts ar 0,2 % adenīna un 2 % glikozes [YP-dekstrozes (YPD)], 2 % rafinozes [YP-rafinozes] bagātu rauga ekstrakta proteīna p (YP) barotni (1 % rauga ekstrakta un 2 % proteīna ept. (YPR)] vai 2 % galaktozes [YP-galaktozes (YPG)] kā oglekļa avotu vai sintētiskā minimālā barotnē (0,15 % rauga slāpekļa bāzes un 0,5 % amonija sulfāta), lai papildinātu atbilstošās aminoskābes un bāzes, kas nepieciešamas uzturvielām, un kas saturēja 2 % glikozes (sintētiskā glikozes minimālā barotne) vai 2 % galaktozes (sintētiskā galaktozes minimālā barotne) kā oglekļa avotu.
Reāllaika attēlveidošanai temperatūras jutīgas sec31-1 mutantu šūnas, kas ekspresē konstrukciju zem GAL1 promotera, tika audzētas YPR vidē 24°C temperatūrā nakti līdz log fāzes vidum. Pēc indukcijas YPG vidē 24°C temperatūrā 1 stundu šūnas tika inkubētas SG vidē 37°C temperatūrā 30 minūtes un pēc tam pārvietotas uz 24°C, lai atbrīvotos no sekrēcijas bloka. Konkanavalīns A tika izmantots, lai fiksētu šūnas uz stikla priekšmetstikliņa un attēlveidotu ar SCLIM. SCLIM ir Olympus IX-71 apgrieztās fluorescences mikroskopa un UPlanSApo 100×1,4 skaitliskās apertūras eļļas lēcas (Olympus), ātrdarbīga un augstas signāla un trokšņa attiecības rotējoša diska konfokālā skenera (Yokogawa Electric), pielāgota spektrometra un pielāgotas dzesēšanas kombinācija. Sistēmas attēla pastiprinātājs (Hamamatsu Photonics) var nodrošināt palielināmo lēcu sistēmu ar galīgo palielinājumu ×266,7 un lādiņsavienotas ierīces kameru, kas reizina elektronus (Hamamatsu Photonics) (21). Attēlu iegūšanu veic pielāgota programmatūra (Yokogawa Electric). 3D attēliem mēs izmantojām pielāgotu pjezoelektrisko izpildmehānismu, lai vertikāli vibrētu objektīva lēcu, un optiskās daļas savācām 100 nm attālumā viena no otras kaudzē. Z-kaudzes attēls tiek pārveidots 3D vokseļu datos, un rotējošā diska konfokālā mikroskopa teorētiskā punktu izkliedes funkcija tiek izmantota dekonvolūcijas apstrādei ar Volocity programmatūru (PerkinElmer). Izmantojot Volocity programmatūru, lai automātiski noteiktu sliekšņus kolokalācijas analīzei, tika mērīts ERES, ieskaitot kravu. Līniju skenēšanas analīze tika veikta, izmantojot MetaMorph programmatūru (Molecular Devices).
Lai noteiktu statistisko nozīmīgumu, izmantojiet GraphPad Prism programmatūru. Divpusējā Stjudenta t-testā un parastajā vienvirziena dispersijas analīzes (ANOVA) testā atšķirības starp grupām tiek uzskatītas par būtiski ietekmējošām P < 0,05 (*).
Gas1-GFP fluorescences mikroskopijai log fāzes šūnas tika audzētas nakti YPD vidē un savāktas ar centrifugēšanu, divas reizes mazgātas ar fosfātu buferētu sāls šķīdumu un inkubētas uz ledus vismaz 15 minūtes, un pēc tam veikta mikroskopiskā izmeklēšana, kā aprakstīts iepriekš (24). Iegūšanai tika izmantots Leica DMi8 mikroskops (HCX PL APO 1003/1.40 oil PH3 CS), kas aprīkots ar objektīvu, L5 (GFP) filtru, Hamamatsu kameru un Application Suite X (LAS X) programmatūru.
Paraugi tika denaturēti ar SDS parauga buferi 65°C temperatūrā 10 minūtes un pēc tam atdalīti ar SDS-poliakrilamīda gela elektroforēzi (PAGE). Imunoblotēšanas analīzei katrā joslā tika ielādēti 10 μl parauga. Primārā antiviela: Izmantota truša poliklonāla antiviela pret Gas1 atšķaidījumā 1:3000, truša poliklonāla antiviela pret Emp24 atšķaidījumā 1:500 un truša poliklonāla antiviela pret GFP (dāvana no H. Riezman) atšķaidījumā 1:3000. Peles monoklonālā antiviela pret Pgk1 tika izmantota atšķaidījumā 1:5000 (dāvana no J. de la Cruz). Sekundārā antiviela: Ar mārrutku peroksidāzi (HRP) konjugēta kazas antiviela pret truša imūnglobulīnu G (IgG), kas izmantota atšķaidījumā 1:3000 (Pierce). Ar HRP konjugēts kazas antiviela pret peles IgG tika izmantots atšķaidījumā 1:3000 (Pierce). Imūnās atbildes zona tika novērota ar SuperSignal West Pico reaģenta (Thermo Fisher Scientific) ķīmiskās luminiscences metodi.
Kā aprakstīts (31), bagātinātajai ER frakcijai tika veikts dabiskās imunoprecipitācijas eksperiments. Īsumā, rauga šūnas divas reizes mazgā ar TNE buferšķīdumu [50 mM tris-HCl (pH 7,5), 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 mM fenilmetilsulfonilfluorīda un proteāzes inhibitora maisījums] pie 600 nm (OD600) ar optisko blīvumu 100. To salauza ar stikla pērlītēm, un pēc tam šūnu atliekas un stikla pērlītes tika noņemtas, centrifugējot. Pēc tam supernatantu centrifugēja ar 17 000 g 15 minūtes 4°C temperatūrā. Nogulsnes tika atkārtoti suspendētas TNE, un tika pievienots digitalis saponīns līdz galīgajai koncentrācijai 1%. Suspensiju inkubēja 1 stundu rotācijas režīmā 4°C temperatūrā, un pēc tam nešķīstošās sastāvdaļas tika noņemtas, centrifugējot ar 13 000 g 4°C temperatūrā 60 minūtes. Lai veiktu Gas1-GFP imunoprecipitāciju, vispirms paraugu iepriekš inkubē ar tukšām agarozes lodītēm (ChromoTek) 4°C temperatūrā 1 stundu un pēc tam inkubē ar GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C temperatūrā 3 stundas. Imunoprecipitētās lodītes piecas reizes mazgā ar TNE, kas satur 0,2% digoksigenīna, eluē ar SDS parauga buferi, atdala SDS-PAGE un analizē ar imūnblotēšanu.
Kā aprakstīts (31), šķērssaistīšanas noteikšana tika veikta ar bagātināto ER frakciju. Īsumā, bagātinātā ER frakcija tika inkubēta ar 0,5 mM ditiobis(sukcinimidilpropionātu) (Pierce, Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, ASV; 20°C, 20 min). Šķērssaistīšanas reakcija tika pārtraukta, pievienojot glicīnu (galīgā koncentrācija 50 mM, 5 minūtes, 20°C).
Kā iepriekš aprakstīts (50), tika veikta keramīda MS analīze savvaļas tipa un GhLag1 celmos. Īsumā, šūnas tika audzētas līdz eksponenciālai fāzei (3 līdz 4 OD600 vienības/ml) YPD vidē 30°C temperatūrā, un tika savāktas 25×107 šūnas. To metabolismu aptur ar trihloretiķskābi. Izmantojiet ekstrakcijas šķīdinātāju [etanols, ūdens, ēteris, piridīns un 4,2 N amonija hidroksīds (15:15:5:1:0,018 v/v)] un 1,2 nmol iekšējā standarta C17 keramīda (860517, Avanti polāro lipīdu kvalitātes). Izmantojiet monometilamīna reaģentu [metanols, ūdens, n-butanols un metilamīna šķīdums (4:3:1:5 v/v)], lai veiktu ekstrakta vieglu sārmainu hidrolīzi, un pēc tam izmantojiet ar ūdeni piesātinātu n-butanolu, lai to atsāļotu. Visbeidzot, ekstrakts tika atkārtoti suspendēts pozitīvā režīma šķīdinātājā [hloroforms/metanols/ūdens (2:7:1) + 5 mM amonija acetāts] un ievadīts masas spektrometrā. Sfingolipīdu molekulu identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai tika veikta daudzreakciju uzraudzība (MRM). TSQ Vantage terciārā kvadrupola masas spektrometrs (Thermo Fisher Scientific) ir aprīkots ar robotizētu nanoplūsmas jonu avotu Nanomate HD (Advion Biosciences, Ithaca, NY) lipīdu analīzei. Sadursmes enerģija ir optimizēta katrai keramīdu kategorijai. MS dati tika iegūti pozitīvajā režīmā. Katram bioloģiskajam atkārtojumam lipīdu signāls ir trīs neatkarīgu mērījumu mediāna.
Kā aprakstīts (31), šūnas (800×107), kas ekspresē Gas1-GFP, tika pakļautas dabiskai imunoprecipitācijai. Attīrītais Gas1-GFP tika atdalīts ar SDS-PAGE un pārvietots uz polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrānu. Olbaltumviela tika vizualizēta, iekrāsojot PVDF ar amīda melno krāsu. Gas1-GFP josla tika nogriezta no PVDF un mazgāta 5 reizes ar metanolu un vienu reizi ar šķidruma hromatogrāfijas-MS (LC-MS) kvalitātes ūdeni. Inkubējot membrānas strēmeli ar 500 μl 0,3 M NaOAc (pH 4,0), buferšķīdumu un 500 μl svaigi izšķīdināta 1 M nātrija nitrīta maisījuma 37°C temperatūrā 3 stundas, lipīdu frakcija tiek atbrīvota no Gas1-GFP un lizēta. Inozīna fosfāta ceramīda atbrīvošanās starp glikozamīnu un inozitolu (51). Pēc tam membrānas strēmeli četras reizes mazgāja ar LC-MS kvalitātes ūdeni, žāvēja istabas temperatūrā un uzglabāja slāpekļa atmosfērā -80°C temperatūrā līdz analīzei. Kontroles nolūkos katrā eksperimentā tika izmantots PVDF membrānas tukšais paraugs. No Gas1-GFP ekstrahētais lipīds pēc tam tika analizēts ar MS, kā aprakstīts (50). Īsāk sakot, PVDF strēmeles, kas saturēja GPI-lipīdu, tika atkārtoti suspendētas 75 μl negatīvā pelējuma šķīdinātājā [hloroforms/metanols (1:2) + 5 mM amonija acetāts] un tika veikta sfingolipīdu sugu elektrospray jonizācijas (ESI)-MRM/MS analīze (TSQ Vantage). Šajā gadījumā MS dati tika iegūti negatīvo jonu režīmā.
Kā minēts iepriekš, GPI enkura lipīdu daļa tika atdalīta no ar [3H]-inozitolu iezīmētā GPI-AP (16). Lipīdi tika atdalīti ar plānslāņa hromatogrāfiju, izmantojot šķīdinātāju sistēmu (55:45:10 hloroforms-metanols-0,25% KCl), un vizualizēti, izmantojot FLA-7000 (Fujifilm).
Šūnas, kas ekspresē Gas1-GFP (600×107), divas reizes tika mazgātas ar TNE buferi ar TNE buferi, salauztas ar stikla pērlītēm un pēc tam centrifugētas, lai atdalītu šūnu atliekas un stikla pērlītes. Pēc tam supernatantu centrifugēja ar 17 000 g 1 stundu 4°C temperatūrā. Nogulsnes mazgāja TNE un inkubēja ar 1 U PI-PLC (Invitrogen) TNE, kas satur 0,2% digitalis saponīna, 1 stundu 37°C temperatūrā. Pēc apstrādes ar enzīmiem membrāna tika noņemta, centrifugējot ar 17 000 g 4°C temperatūrā 1 stundu. Lai imūnprecipitētu Gas1-GFP, supernatantu inkubēja ar GFP-Trap_A (ChromoTek) 4°C temperatūrā nakti. Attīrīto Gas1-GFP, kas atdalīts ar SDS-PAGE, iekrāsoja ar Kūmasī briljantzilo krāsu. Gas1-GFP iekrāsošanas josla tika nogriezta no pelēkās zonas ap akveduktu, un pēc alkilēšanas ar jodoacetamīdu un reducēšanas ar ditiotreitolu tika veikta gela iekšējā šķelšana ar tripsīnu. Tripsīnpeptīdus un peptīdus ar GPI-glikāniem ekstrahēja un žāvēja. Žāvēto peptīdu izšķīdināja 20 μl ūdens. Daļu (8 μl) ievadīja šķidruma atdalīšanas hromatogrāfā (LC). Peptīdu atdalīšanai īpašos gradienta apstākļos tika izmantota oktadecilsilāna (ODS) kolonna (Develosil 300ODS-HG-5; iekšējais diametrs 150 mm × 1,0 mm; Nomura Chemical, Aiči prefektūra, Japāna). Mobilā fāze ir šķīdinātājs A (0,08% skudrskābe) un šķīdinātājs B (0,15% skudrskābe 80% acetonitrilā). Kolonnas eluēšanai ar šķīdinātāju A 55 minūšu laikā ar plūsmas ātrumu 50 μl min-1 5 minūtes tika izmantota Accela HPLC sistēma (Thermo Fisher Scientific, Bostona, Masačūsetsa), un pēc tam šķīdinātāja B koncentrācija tika palielināta līdz 40%. (ASV). Eluāts tika nepārtraukti ievadīts ESI jonu avotā, un triptiskie peptīdi un peptīdi ar GPI-glikāniem tika analizēti ar LTQ Orbitrap XL (hibrīda lineārā jonu slazda-orbitrāpa masas spektrometrs; Thermo Fisher Scientific). MS iekārtā kapilārā avota spriegums tika iestatīts uz 4,5 kV, un pārneses kapilāra temperatūra tika uzturēta 300°C. Kapilāra spriegums un caurules lēcas spriegums tika iestatīti attiecīgi uz 15 V un 50 V. MS dati tika iegūti pozitīvo jonu režīmā (izšķirtspēja 60 000; masas precizitāte 10 miljonās daļas) masas diapazonā no 300/m/z, masas/lādiņa attiecība (m/z) 3000. MS/MS dati tiek iegūti, izmantojot jonu slazdu LTQ Orbitrap XL ierīcē [pirmie 3 cipari, no kuriem atkarīgi dati, sadursmes izraisīta disociācija (CID)].
MD simulācijas tika veiktas, izmantojot GROMACS (52) programmatūru un MARTINI 2 spēka lauku (53–55). Pēc tam CHARMM GUI membrānas veidotājs (56, 57) tika izmantots, lai konstruētu dubultslāni, kas satur dioleoilfosfatidilholīnu (DOPC) un Cer C18 vai DOPC un Cer C26. Cer C26 topoloģija un koordinātas ir iegūtas no DXCE, noņemot liekās lodītes no sfingozīna astes. Izmantojiet tālāk aprakstīto procesu, lai līdzsvarotu dubultslāni un palaistu to, pēc tam izmantojiet sistēmas pēdējās koordinātas, lai izveidotu sistēmu, kas satur Emp24. Rauga Emp24 transmembrānas domēns (atlikumi no 173 līdz 193) tika konstruēts kā α-spirāle, izmantojot vizuālā MD (VMD) rīka molekulāro struktūru (58). Pēc tam, pēc pārklājošo lipīdu noņemšanas, proteīns tika rupji granulēts un ievietots dubultslānī, izmantojot CHARMM GUI. Galīgā sistēma satur 1202 DOPC un 302 Cer C26 vai 1197 DOPC un 295 Cer C18 un Emp24. Sistēma tiek jonizēta līdz 0,150 M koncentrācijai. Diviem divslāņu sastāviem tika veikti četri neatkarīgi atkārtojumi.
Lipīdu divslānis tiek līdzsvarots, izmantojot CHARMM GUI procesu, kas ietver 405 000 soļu minimizēšanu un pēc tam līdzsvarošanu, kur pozīcijas ierobežojumi tiek pakāpeniski samazināti un novērsti, un laika solis tiek palielināts no 0,005 ps līdz 0,02 ps. Pēc līdzsvarošanas tas rada 6 µs ar laika soli 0,02 ps. Pēc Emp24 ievietošanas izmantojiet to pašu CHARMM GUI procesu, lai minimizētu un līdzsvarotu sistēmu, un pēc tam palaidiet to 8 s ražošanas režīmā.
Visās sistēmās balansēšanas procesā spiedienu kontrolē Berendsena barostats (59), bet ražošanas procesā spiedienu kontrolē Parrinello-Rahmana barostats (60). Visos gadījumos vidējais spiediens ir 1 bārs, un tiek izmantota daļēji izotropiska spiediena savienošanas shēma. Balansēšanas un ražošanas procesā olbaltumvielu, lipīdu un šķīdinātāju daļiņu temperatūras savienošanai tiek izmantots termostats (61) ar ātruma atkārtotu kalibrēšanu. Visas darbības laikā mērķa temperatūra ir 310 K. Nesaistošā mijiedarbība tiek aprēķināta, ģenerējot pāru sarakstu, izmantojot Verlē shēmu ar 0,005 bufera toleranci. Kulona termins tiek aprēķināts, izmantojot reakcijas lauku un robežattālumu 1,1 nm. Vandera-Vālsa termins izmanto robežshēmu ar robežattālumu 1,1 nm, un Verlē robežshēma tiek izmantota potenciālajai novirzei (62).
Izmantojot VMD, robežviļņa garums starp DOPC fosfāta lodītēm vai keramīda AM1 lodītēm un olbaltumvielu ir 0,7 nm, un tiek aprēķināts lipīdu skaits, kas mijiedarbojas ar olbaltumvielu. Saskaņā ar šādu formulu aprēķiniet noplicināšanas-bagātināšanas (DE) koeficientu, kā norādīts (63): DE koeficients = (kopējais lipīdu daudzums olbaltumvielā 0,7) olbaltumvielā 0,7 (Cer daudzums kopējos lipīdos)
Ziņotā vērtība ir iegūta kā vidējā vērtība, un kļūdu joslas ir četras neatkarīgas SE kopijas. DE faktora statistiskā nozīmība ir aprēķināta, izmantojot t testu [(vidējais DE-faktors-1)/SE]. Aprēķiniet P vērtību no vienpusējā sadalījuma.
Sistēmas, kas satur Emp24, 2D laterālā blīvuma kartes aprēķināšanai pēdējo 250 ns laikā tika izmantots GROMACS rīks. Lai iegūtu ceramīda bagātināšanas/samazināšanas karti, Cer blīvuma karte tiek dalīta ar Cer un DOPC kartes summu un pēc tam dalīta ar Cer koncentrāciju ķermenī. Tiek izmantota tā pati krāsu kartes skala.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/50/eaba8237/DC1.
Šis ir brīvas piekļuves raksts, kas izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution-NonCommercial licences noteikumiem, kas atļauj tā izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja vien galīgais pielietojums nav paredzēts komerciālam ieguvumam un ja vien oriģināldarbs ir pareizs. Atsauce.
Piezīme. Lūdzam norādīt savu e-pasta adresi tikai tāpēc, lai persona, kuru iesakāt lapai, zinātu, ka vēlaties, lai tā redzētu e-pastu un ka tas nav surogātpasts. Mēs neiegūsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Sofija Rodrigesa-Galardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alehandro Kortess · Gomess (Alehandro Kortess-Gomezs), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valērija Zoni (Valērija Zoni), Auksiliadora Agilera-Romero, Ana Marija Peresa (S.S. (Miho Vaga), Misako Ārmans (Misako Ārmans), Mijako Rimans (Mijako Rimans), Provs Akira, Stefano Fanijs, Akihiko Nakano, Manuels Munizs
3D augstas izšķirtspējas reāllaika attēlveidošana atklāj ceramīda ķēdes garuma nozīmi olbaltumvielu šķirošanā selektīvās izejas vietās.
Sofija Rodrigesa-Galardo, Kazuo Kurokava, Susana Sabido-Bozo, Alehandro Kortess · Gomess (Alehandro Kortess-Gomezs), Atsuko Ikeda (Atsuko Ikeda), Valērija Zoni (Valērija Zoni), Auksiliadora Agilera-Romero, Ana Marija Peresa (S.S. (Miho Vaga), Misako Ārmans (Misako Ārmans), Mijako Rimans (Mijako Rimans), Provs Akira, Stefano Fanijs, Akihiko Nakano, Manuels Munizs
3D augstas izšķirtspējas reāllaika attēlveidošana atklāj ceramīda ķēdes garuma nozīmi olbaltumvielu šķirošanā selektīvās izejas vietās.
©2020 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija. visas tiesības paturētas. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.