Iepriekš mēs ziņojām, ka pacientiem ar aknu fibrozi zarnās iegūtā triptofāna metabolīta indola-3-propionskābes (IPA) līmenis serumā ir zemāks. Šajā pētījumā mēs pētījām transkriptomu un DNS metilomu aptaukojušos aknās saistībā ar IPA līmeni serumā, kā arī IPA lomu aknu stellātu šūnu (HSC) fenotipiskās inaktivācijas izraisīšanā in vitro.
Pētījumā piedalījās 116 pacienti ar aptaukošanos bez 2. tipa cukura diabēta (T2DM) (vecums 46,8 ± 9,3 gadi; ĶMI: 42,7 ± 5,0 kg/m²), kuriem Kuopio Bariatrijas ķirurģijas centrā (KOBS) tika veikta bariātriskā operācija. Asinsrites IPA līmenis tika mērīts ar šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometrijas (LC-MS) palīdzību, aknu transkriptoma analīze tika veikta ar kopējās RNS sekvencēšanu, un DNS metilēšanas analīze tika veikta, izmantojot Infinium HumanMethylation450 BeadChip. In vitro eksperimentos tika izmantotas cilvēka aknu stellātu šūnas (LX-2).
Seruma IPA līmenis korelēja ar gēnu, kas iesaistīti apoptozes, mitofāģijas un ilgmūžības ceļos aknās, ekspresiju. AKT serīna/treonīna kināzes 1 (AKT1) gēns bija visizplatītākais un dominējošais mijiedarbojošais gēns aknu transkripta un DNS metilēšanas profilos. IPA terapija izraisīja apoptozi, samazināja mitohondriju elpošanu un mainīja šūnu morfoloģiju un mitohondriju dinamiku, modulējot gēnu, kas zināmi kā LX-2 šūnu fibrozes, apoptozes un izdzīvošanas regulētāji, ekspresiju.
Kopumā šie dati apstiprina, ka IPA piemīt potenciāla terapeitiska iedarbība un tā var izraisīt apoptozi un novirzīt HSC fenotipu uz neaktīvu stāvokli, tādējādi paplašinot aknu fibrozes inhibēšanas iespēju, traucējot HSC aktivāciju un mitohondriju metabolismu.
Aptaukošanās un vielmaiņas sindroma izplatība ir saistīta ar pieaugošu vielmaiņas izraisītas taukainas aknu slimības (MASLD) sastopamību; slimība skar 25% līdz 30% no kopējās populācijas [1]. Galvenās MASLD etioloģijas sekas ir aknu fibroze, dinamisks process, kam raksturīga nepārtraukta šķiedru ekstracelulārās matrices (ECM) uzkrāšanās [2]. Galvenās šūnas, kas iesaistītas aknu fibrozē, ir aknu stellātu šūnas (HSC), kurām ir četri zināmi fenotipi: miera stāvoklī esošas, aktivētas, inaktivētas un novecojošas [3, 4]. HSC var tikt aktivizētas un transdiferencētas no miera stāvokļa proliferatīvās fibroblastu līdzīgās šūnās ar augstu enerģijas patēriņu, palielinot α-gludo muskuļu aktīna (α-SMA) un I tipa kolagēna (Col-I) ekspresiju [5, 6]. Aknu fibrozes atgriezeniskās reakcijas laikā aktivētās HSC tiek izvadītas apoptozes vai inaktivācijas ceļā. Šie procesi ietver fibrogēno gēnu regulācijas samazināšanos un izdzīvošanu veicinošo gēnu (piemēram, NF-κB un PI3K/Akt signālceļu) modulāciju [7, 8], kā arī izmaiņas mitohondriju dinamikā un funkcijā [9].
Ir konstatēts, ka zarnās ražotā triptofāna metabolīta indola-3-propionskābes (IPA) līmenis serumā ir samazināts cilvēku vielmaiņas slimību, tostarp MASLD, gadījumā [10–13]. IPA ir saistīts ar uztura šķiedrvielu uzņemšanu, ir pazīstams ar savu antioksidanta un pretiekaisuma iedarbību un in vivo un in vitro mazina uztura izraisīto bezalkoholiskā steatohepatīta (NASH) fenotipu [11–14]. Daži pierādījumi ir iegūti no mūsu iepriekšējā pētījuma, kurā Kuopio bariātriskās ķirurģijas pētījumā (KOBS) tika pierādīts, ka IPA līmenis serumā bija zemāks pacientiem ar aknu fibrozi nekā aptaukošanās pacientiem bez aknu fibrozes. Turklāt mēs parādījām, ka IPA terapija var samazināt gēnu ekspresiju, kas ir klasiski šūnu adhēzijas, šūnu migrācijas un hematopoētisko cilmes šūnu aktivācijas marķieri cilvēka aknu stellātu šūnu (LX-2) modelī, un ir potenciāls hepatoprotektīvs metabolīts [15]. Tomēr joprojām nav skaidrs, kā IPA izraisa aknu fibrozes regresiju, aktivizējot HSC apoptozi un mitohondriju bioenerģētiku.
Šeit mēs parādām, ka seruma IPA ir saistīts ar gēnu ekspresiju, kas bagātināti ar apoptozes, mitofagijas un ilgmūžības ceļiem aptaukojušos, bet ne 2. tipa diabēta (KOBS) indivīdu aknās. Turklāt mēs atklājām, ka IPA var izraisīt aktivētu hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) klīrensu un degradāciju, izmantojot inaktivācijas ceļu. Šie rezultāti atklāj jaunu IPA lomu, padarot to par potenciālu terapeitisku mērķi aknu fibrozes regresijas veicināšanai.
Iepriekšējais pētījums KOBS kohortā parādīja, ka pacientiem ar aknu fibrozi bija zemāks IPA līmenis asinīs, salīdzinot ar pacientiem bez aknu fibrozes [15]. Lai izslēgtu iespējamo 2. tipa diabēta traucējošo ietekmi, par pētījuma populāciju no notiekošā KOBS pētījuma [16] iekļāvām 116 aptaukojušos pacientus bez 2. tipa diabēta (vidējais vecums ± standarta novirze: 46,8 ± 9,3 gadi; ĶMI: 42,7 ± 5,0 kg/m2) (1. tabula). Visi dalībnieki sniedza rakstisku informētu piekrišanu, un pētījuma protokolu apstiprināja Ziemeļsavo apgabala slimnīcas ētikas komiteja saskaņā ar Helsinku deklarāciju (54/2005, 104/2008 un 27/2010).
Aknu biopsijas paraugi tika iegūti bariātriskās operācijas laikā, un pieredzējuši patologi tos histoloģiski novērtēja saskaņā ar iepriekš aprakstītajiem kritērijiem [17, 18]. Novērtēšanas kritēriji ir apkopoti 1. papildtabulā un ir aprakstīti iepriekš [19].
Tukšā dūšā iegūtus seruma paraugus metabolomikas analīzei analizēja, izmantojot nemērķētu šķidruma hromatogrāfijas-masas spektrometrijas (LC-MS) metodi (n = 116). Paraugi tika analizēti, izmantojot UHPLC-qTOF-MS sistēmu (1290 LC, 6540 qTOF-MS, Agilent Technologies, Waldbronn, Karlsruhe, Vācija), kā aprakstīts iepriekš19. Izopropilspirta (IPA) identifikācija tika balstīta uz aiztures laiku un MS/MS spektra salīdzināšanu ar tīriem standartiem. Visās turpmākajās analīzēs tika ņemta vērā IPA signāla intensitāte (pīķa laukums) [20].
Pilnas aknu RNS sekvencēšana tika veikta, izmantojot Illumina HiSeq 2500, un dati tika apstrādāti, kā aprakstīts iepriekš [19, 21, 22]. Mēs veicām mērķtiecīgu diferenciālās ekspresijas analīzi transkriptiem, kas ietekmē mitohondriju funkciju/bioģenēzi, izmantojot 1957 gēnus, kas atlasīti no MitoMiner 4.0 datubāzes [23]. Aknu DNS metilēšanas analīze tika veikta, izmantojot Infinium HumanMethylation450 BeadChip (Illumina, San Diego, CA, ASV), izmantojot to pašu metodoloģiju, kas aprakstīta iepriekš [24, 25].
Cilvēka aknu stellātu šūnas (LX-2) laipni nodrošināja profesors Stefano Romeo, un tās tika kultivētas un uzturētas DMEM/F12 vidē (Biowest, L0093-500, 1% Pen/Strep; Lonza, DE17-602E, 2% FBS; Gibco, 10270-106). Lai izvēlētos IPA darba devu, LX-2 šūnas 24 stundas tika apstrādātas ar dažādām IPA koncentrācijām (10 μM, 100 μM un 1 mM; Sigma, 220027) DMEM/F12 vidē. Turklāt, lai izpētītu IPA spēju inaktivēt HSC, LX-2 šūnas 24 stundas tika kopīgi apstrādātas ar 5 ng/ml TGF-β1 (R&D systems, 240-B-002/CF) un 1 mM IPA seruma nesaturošā vidē. Atbilstošajām transportlīdzekļa kontrolēm TGF-β1 apstrādei tika izmantots 4 nM HCL, kas satur 0, 1% BSA, un IPA apstrādei tika izmantots 0, 05% DMSO, un kombinētajai ārstēšanai abi tika izmantoti kopā.
Apoptozi novērtēja, izmantojot FITC aneksīna V apoptozes noteikšanas komplektu ar 7-AAD (Biolegend, San Diego, CA, ASV, kat.nr. 640922) saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, LX-2 (1 × 105 šūnas/iedobē) tika kultivētas nakti 12 iedobju plāksnēs un pēc tam apstrādātas ar vairākām IPA vai IPA un TGF-β1 devām. Nākamajā dienā peldošās un pielipušās šūnas tika savāktas, tripsinizētas, mazgātas ar PBS, atkārtoti suspendētas aneksīna V saistošajā buferšķīdumā un inkubētas ar FITC-aneksīnu V un 7-AAD 15 minūtes.
Dzīvo šūnu mitohondriji tika iekrāsoti oksidatīvās aktivitātes noteikšanai, izmantojot Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA). MTR testiem LX-2 šūnas tika inkubētas vienādā blīvumā ar IPA un TGF-β1. Pēc 24 stundām dzīvās šūnas tika tripsinizētas, mazgātas ar PBS un pēc tam inkubētas ar 100 μM MTR seruma nesaturošā vidē 37 °C temperatūrā 20 minūtes, kā aprakstīts iepriekš [26]. Dzīvo šūnu morfoloģijas analīzei šūnu lielums un citoplazmas sarežģītība tika analizēta, izmantojot attiecīgi tiešās izkliedes (FSC) un sānu izkliedes (SSC) parametrus.
Visi dati (30 000 notikumu) tika iegūti, izmantojot NovoCyte Quanteon (Agilent), un analizēti, izmantojot NovoExpress® 1.4.1 vai FlowJo V.10 programmatūru.
Skābekļa patēriņa ātrums (OCR) un ekstracelulārā paskābināšanās ātrums (ECAR) tika mērīti reāllaikā, izmantojot Seahorse ekstracelulāro plūsmas analizatoru (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), kas aprīkots ar Seahorse XF šūnu mito stresa testētāju saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Īsumā, 2 × 104 LX-2 šūnas/iedobē tika iesētas XF96 šūnu kultūras plāksnēs. Pēc nakts inkubācijas šūnas tika apstrādātas ar izopropanolu (IPA) un TGF-β1 (1. papildmetode). Datu analīze tika veikta, izmantojot Seahorse XF Wave programmatūru, kas ietver Seahorse XF šūnu enerģijas fenotipa testa ziņojumu ģeneratoru. No tā tika aprēķināts bioenerģētiskās veselības indekss (BHI) [27].
Kopējā RNS tika transkribēta kDNS. Konkrētas metodes skatīt atsaucē [15]. Cilvēka 60S ribosomu skābā proteīna P0 (RPLP0) un ciklofilīna A1 (PPIA) mRNS līmeņi tika izmantoti kā konstitutīvas gēnu kontroles. Tika izmantota QuantStudio 6 pro reāllaika PCR sistēma (Thermo Fisher, Landsmeer, Nīderlande) kopā ar TaqMan™ Fast Advanced Master Mix komplektu (Applied Biosystems) vai Sensifast SYBR Lo-ROX komplektu (Bioline, BIO 94050), un relatīvā gēnu ekspresijas reize tika aprēķināta, izmantojot salīdzinošos Ct vērtības cikliskos parametrus (ΔΔCt) un ∆∆Ct metodi. Sīkāka informācija par praimeriem ir sniegta S2 un S3 papildu tabulās.
Kodola DNS (ncDNS) un mitohondriju DNS (mtDNS) tika ekstrahētas, izmantojot DNeasy asins un audu komplektu (Qiagen), kā aprakstīts iepriekš [28]. mtDNS relatīvais daudzums tika aprēķināts, aprēķinot katra mērķa mtDNS reģiona attiecību pret trīs kodola DNS reģionu (mtDNS/ncDNS) ģeometrisko vidējo vērtību, kā detalizēti aprakstīts 2. papildmetodē. Sīkāka informācija par mtDNS un ncDNS praimeriem ir sniegta S4. papildtabulā.
Dzīvās šūnas tika iekrāsotas ar Mitotracker™ Red CMXRos (MTR) (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA), lai vizualizētu starpšūnu un intracelulāros mitohondriju tīklus. LX-2 šūnas (1 × 104 šūnas/iedobē) tika kultivētas uz stikla slaidiem atbilstošās stikla dibena kultivēšanas plāksnēs (Ibidi GmbH, Martinsried, Vācija). Pēc 24 stundām dzīvās LX-2 šūnas tika inkubētas ar 100 μM MTR 20 minūtes 37 °C temperatūrā, un šūnu kodoli tika iekrāsoti ar DAPI (1 μg/ml, Sigma-Aldrich), kā aprakstīts iepriekš [29]. Mitohondriju tīkli tika vizualizēti, izmantojot Zeiss Axio Observer invertēto mikroskopu (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jena, Vācija), kas aprīkots ar Zeiss LSM 800 konfokālo moduli, 37 °C temperatūrā mitrinātā atmosfērā ar 5% CO2, izmantojot 63×NA 1,3 objektīvu. Mēs ieguvām desmit Z sērijas attēlus katram parauga veidam. Katrā Z sērijā ir 30 sekcijas, katra ar 9,86 μm biezumu. Katram paraugam, izmantojot ZEN 2009 programmatūru (Carl Zeiss Microimaging GmbH, Jēna, Vācija), tika iegūti desmit dažādu redzes lauku attēli, un mitohondriju morfoloģijas analīze tika veikta, izmantojot ImageJ programmatūru (v1.54d) [30, 31] saskaņā ar 3. papildmetodē detalizēti aprakstītajiem parametriem.
Šūnas tika fiksētas ar 2% glutaraldehīdu 0,1 M fosfātu buferšķīdumā, pēc tam fiksētas ar 1% osmija tetroksīda šķīdumu (Sigma Aldrich, MO, ASV), pakāpeniski dehidrētas ar acetonu (Merck, Darmstadt, Vācija) un visbeidzot iestrādātas epoksīdsveķos. Tika sagatavotas īpaši plānas sekcijas un iekrāsotas ar 1% uranilacetātu (Merck, Darmstadt, Vācija) un 1% svina citrātu (Merck, Darmstadt, Vācija). Ultrastrukturālie attēli tika iegūti, izmantojot JEM 2100F EXII transmisijas elektronmikroskopu (JEOL Ltd, Tokija, Japāna) ar paātrinājuma spriegumu 80 kV.
Ar IPA 24 stundas apstrādāto LX-2 šūnu morfoloģija tika analizēta ar fāzu kontrasta mikroskopiju 50x palielinājumā, izmantojot Zeiss apgrieztās gaismas mikroskopu (Zeiss Axio Vert.A1 un AxioCam MRm, Jēna, Vācija).
Klīniskie dati tika izteikti kā vidējais ± standartnovirze vai mediāna (interkvartiļu diapazons: IQR). Lai salīdzinātu atšķirības starp trim pētījuma grupām, tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze (nepārtrauktie mainīgie) vai χ² tests (kategoriskie mainīgie). Viltus pozitīvo rezultātu biežums (FDR) tika izmantots, lai koriģētu vairāku testu ietekmi, un gēni ar FDR < 0,05 tika uzskatīti par statistiski nozīmīgiem. Spīrmena korelācijas analīze tika izmantota, lai korelētu CpG DNS metilēšanu ar IPA signāla intensitāti, un tika ziņots par nominālajām p vērtībām (p < 0,05).
Ceļa analīze tika veikta, izmantojot tīmekļa gēnu kopu analīzes rīku (WebGestalt), 268 transkriptiem (nominālā p < 0,01), 119 ar mitohondrijiem saistītiem transkriptiem (nominālā p < 0,05) un 4350 CpG no 3093 aknu transkriptiem, kas bija saistīti ar cirkulējošā seruma IPA līmeni. Pārklājošo gēnu atrašanai tika izmantots brīvi pieejamais Venny DB (2.1.0 versija) rīks, bet olbaltumvielu-olbaltumvielu mijiedarbības vizualizēšanai tika izmantota StringDB (11.5 versija).
LX-2 eksperimentam paraugu normalitāte tika pārbaudīta, izmantojot D'Agostino-Pīrsona testu. Dati tika iegūti no vismaz trim bioloģiskiem atkārtojumiem un pakļauti vienvirziena ANOVA ar Bonferroni post hoc testu. P-vērtība, kas mazāka par 0,05, tika uzskatīta par statistiski nozīmīgu. Dati ir attēloti kā vidējais ± SD, un katrā attēlā ir norādīts eksperimentu skaits. Visas analīzes un grafiki tika veikti, izmantojot GraphPad Prism 8 statistikas programmatūru operētājsistēmai Windows (GraphPad Software Inc., 8.4.3. versija, Sandjego, ASV).
Vispirms mēs pētījām seruma IPA līmeņa saistību ar aknu, visa ķermeņa un mitohondriju transkriptiem. Kopējā transkriptu profilā spēcīgākais ar seruma IPA līmeni saistītais gēns bija MAPKAPK3 (FDR = 0,0077; mitogēna aktivētās proteīnkināzes aktivētās proteīnkināzes 3); ar mitohondrijiem saistītajā transkriptu profilā spēcīgākais saistītais gēns bija AKT1 (FDR = 0,7621; AKT serīna/treonīna kināze 1) (1. papildu fails un 2. papildu fails).
Pēc tam mēs analizējām globālos transkriptus (n = 268; p < 0,01) un ar mitohondrijiem saistītos transkriptus (n = 119; p < 0,05), galu galā identificējot apoptozi kā nozīmīgāko kanonisko ceļu (p = 0,0089). Mitohondriju transkriptiem, kas saistīti ar seruma IPA līmeni, mēs koncentrējāmies uz apoptozi (FDR = 0,00001), mitofāgiju (FDR = 0,00029) un TNF signālceļiem (FDR = 0,000006) (1.A attēls, 2. tabula un 1.A–B papildu attēli).
Globālo, ar mitohondrijiem saistīto transkriptu un DNS metilēšanas pārklāšanās analīze cilvēka aknās saistībā ar seruma IPA līmeni. A apzīmē 268 globālos transkriptus, 119 ar mitohondrijiem saistītus transkriptus un DNS metilētus transkriptus, kas ir kartēti uz 3092 CpG vietām, kas saistītas ar seruma IPA līmeni (p vērtības < 0,01 globālajiem transkriptiem un metilētai DNS, un p vērtības < 0,05 mitohondriju transkriptiem). Galvenie pārklājošie transkripti ir parādīti vidū (AKT1 un YKT6). B 13 gēnu mijiedarbības karte ar augstāko mijiedarbības punktu skaitu (0,900) ar citiem gēniem tika konstruēta no 56 pārklājošajiem gēniem (melnās līnijas reģions), kas bija būtiski saistīti ar seruma IPA līmeni, izmantojot tiešsaistes rīku StringDB. Zaļš: gēni, kas kartēti uz gēnu ontoloģijas (GO) šūnu komponentu: mitohondriji (GO:0005739). AKT1 ir proteīns ar augstāko punktu skaitu (0,900) mijiedarbībai ar citiem proteīniem, pamatojoties uz datiem (pamatojoties uz teksta ieguvi, eksperimentiem, datubāzēm un koekspresiju). Tīkla mezgli attēlo olbaltumvielas, un malas attēlo savienojumus starp olbaltumvielām.
Tā kā zarnu mikrobiotas metabolīti var regulēt epigenetisko sastāvu, izmantojot DNS metilēšanu [32], mēs pētījām, vai seruma IPA līmenis ir saistīts ar aknu DNS metilēšanu. Mēs atklājām, ka divas galvenās metilēšanas vietas, kas saistītas ar seruma IPA līmeni, atrodas prolīna-serīna bagātā 3. reģiona (C19orf55) un karstuma šoka proteīnu B saimes (mazā) 6. locekļa (HSPB6) tuvumā (3. papildfails). 4350 CpG DNS metilēšana (p < 0,01) bija korelēta ar seruma IPA līmeni un bija bagātināta ar ilgmūžības regulēšanas ceļiem (p = 0,006) (1.A attēls, 2. tabula un 1.C papildattēls).
Lai izprastu bioloģiskos mehānismus, kas ir pamatā saistībai starp seruma IPA līmeni, globālajiem transkriptiem, ar mitohondrijiem saistītajiem transkriptiem un DNS metilēšanu cilvēka aknās, mēs veicām iepriekšējā ceļa analīzē identificēto gēnu pārklāšanās analīzi (1.A attēls). 56 pārklājošo gēnu (melnās līnijas iekšpusē 1.A attēlā) ceļa bagātināšanas analīzes rezultāti parādīja, ka apoptozes ceļš (p = 0,00029) izcēla divus gēnus, kas ir kopīgi visām trim analīzēm: AKT1 un YKT6 (YKT6 v-SNARE homologs), kā parādīts Venna diagrammā (2. papildattēls un 1.A attēls). Interesanti, ka mēs atklājām, ka AKT1 (cg19831386) un YKT6 (cg24161647) bija pozitīvi korelēti ar seruma IPA līmeni (3. papildfails). Lai identificētu iespējamo olbaltumvielu mijiedarbību starp gēnu produktiem, mēs kā ievades datus izvēlējāmies 13 gēnus ar augstāko kopīgā reģiona rādītāju (0,900) starp 56 pārklājošajiem gēniem un izveidojām mijiedarbības karti. Saskaņā ar ticamības līmeni (marginālo ticamību) AKT1 gēns ar augstāko punktu skaitu (0,900) atradās augšgalā (1.B attēls).
Pamatojoties uz ceļa analīzi, mēs atklājām, ka apoptoze ir galvenais ceļš, tāpēc mēs pētījām, vai IPA apstrāde ietekmētu HSC apoptozi in vitro. Iepriekš mēs pierādījām, ka dažādas IPA devas (10 μM, 100 μM un 1 mM) nebija toksiskas LX-2 šūnām [15]. Šis pētījums parādīja, ka IPA apstrāde 10 μM un 100 μM koncentrācijā palielināja dzīvotspējīgo un nekrotisko šūnu skaitu. Tomēr, salīdzinot ar kontroles grupu, šūnu dzīvotspēja samazinājās pie 1 mM IPA koncentrācijas, savukārt šūnu nekrozes ātrums nemainījās (2A., B. attēls). Pēc tam, lai atrastu optimālo koncentrāciju apoptozes inducēšanai LX-2 šūnās, mēs testējām 10 μM, 100 μM un 1 mM IPA 24 stundas (2A.–E. attēls un 3A.–B. papildattēls). Interesanti, ka IPA 10 μM un 100 μM samazināja apoptozes ātrumu (%), tomēr IPA 1 mM palielināja vēlo apoptozi un apoptozes ātrumu (%) salīdzinājumā ar kontroli, un tāpēc tika izvēlēts turpmākajiem eksperimentiem (2.A–D attēls).
IPA inducē LX-2 šūnu apoptozi. Apoptozes ātruma un šūnu morfoloģijas kvantitatīvai noteikšanai, izmantojot plūsmas citometriju, tika izmantota aneksīna V un 7-AAD dubultās krāsošanas metode. BA šūnas tika inkubētas ar 10 μM, 100 μM un 1 mM IPA 24 stundas vai ar F–H TGF-β1 (5 ng/ml) un 1 mM IPA seruma nesaturošā vidē 24 stundas. A: dzīvas šūnas (aneksīns V -/ 7AAD-); B: nekrotiskas šūnas (aneksīns V -/ 7AAD+); C, F: agrīns (aneksīns V +/ 7AAD-); D, G: vēls (aneksīns V+/7AAD.+); E, H: kopējā agrīno un vēlo apoptotisko šūnu procentuālā daļa apoptozes ātrumā (%). Dati ir izteikti kā vidējais ± SD, n = 3 neatkarīgi eksperimenti. Statistikas salīdzinājumi tika veikti, izmantojot vienvirziena ANOVA ar Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; ****p < 0,0001
Kā jau iepriekš esam parādījuši, 5 ng/ml TGF-β1 var izraisīt HSC aktivāciju, palielinot klasisko marķieru gēnu ekspresiju [15]. LX-2 šūnas tika apstrādātas ar 5 ng/ml TGF-β1 un 1 mM IPA kombinācijā (2.E–H att.). TGF-β1 apstrāde nemainīja apoptozes ātrumu, tomēr IPA vienlaicīga apstrāde palielināja vēlo apoptozi un apoptozes ātrumu (%), salīdzinot ar TGF-β1 apstrādi (2.E–H att.). Šie rezultāti liecina, ka 1 mM IPA var veicināt apoptozi LX-2 šūnās neatkarīgi no TGF-β1 indukcijas.
Mēs tālāk pētījām IPA ietekmi uz mitohondriju elpošanu LX-2 šūnās. Rezultāti parādīja, ka 1 mM IPA samazināja skābekļa patēriņa ātruma (OCR) parametrus: nemitohodriju elpošanu, bazālo un maksimālo elpošanu, protonu noplūdi un ATP veidošanos, salīdzinot ar kontroles grupu (3.A, B attēls), savukārt bioenerģētiskais veselības indekss (BHI) nemainījās.
IPA samazina mitohondriju elpošanu LX-2 šūnās. Mitohondriju elpošanas līkne (OCR) ir attēlota kā mitohondriju elpošanas parametri (nemitohondriju elpošana, bazālā elpošana, maksimālā elpošana, protonu noplūde, ATP ģenerēšana, SRC un BHI). Šūnas A un B tika inkubētas attiecīgi ar 10 μM, 100 μM un 1 mM IPA 24 stundas. Šūnas C un D tika inkubētas attiecīgi ar TGF-β1 (5 ng/ml) un 1 mM IPA seruma nesaturošā vidē 24 stundas. Visi mērījumi tika normalizēti atbilstoši DNS saturam, izmantojot CyQuant komplektu. BHI: bioenerģētiskais veselības indekss; SRC: elpošanas rezerves kapacitāte; OCR: skābekļa patēriņa ātrums. Dati ir attēloti kā vidējais ± standartnovirze (SN), n = 5 neatkarīgi eksperimenti. Statistikas salīdzinājumi tika veikti, izmantojot vienvirziena ANOVA un Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; un ***p < 0,001
Lai iegūtu visaptverošāku izpratni par IPA ietekmi uz TGF-β1 aktivēto LX-2 šūnu bioenerģētisko profilu, mēs analizējām mitohondriju oksidatīvo fosforilēšanu ar OCR (3.C, D att.). Rezultāti parādīja, ka TGF-β1 terapija varēja samazināt maksimālo elpošanu, elpošanas rezerves kapacitāti (SRC) un BHI, salīdzinot ar kontroles grupu (3.C, D att.). Turklāt kombinētā terapija samazināja bazālo elpošanu, protonu noplūdi un ATP veidošanos, bet SRC un BHI bija ievērojami augstāki nekā tiem, kas tika ārstēti ar TGF-β1 (3.C, D att.).
Mēs arī veicām Seahorse programmatūras nodrošināto “Cellular Energy Phenotype Test” (4.A–D papildattēls). Kā parādīts 3.B papildattēlā, gan OCR, gan ECAR metabolisma potenciāls pēc TGF-β1 terapijas samazinājās, tomēr kombinētās terapijas un IPA terapijas grupās netika novērota atšķirība salīdzinājumā ar kontroles grupu. Turklāt gan OCR bazālais, gan stresa līmenis pēc kombinētās terapijas un IPA terapijas samazinājās salīdzinājumā ar kontroles grupu (4.C papildattēls). Interesanti, ka līdzīga tendence tika novērota kombinētās terapijas gadījumā, kur netika novērotas izmaiņas ECAR bazālajā un stresa līmenī salīdzinājumā ar TGF-β1 terapiju (4.C papildattēls). HSC mitohondriju oksidatīvās fosforilēšanās samazināšanās un kombinētās terapijas spēja atjaunot SCR un BHI pēc TGF-β1 terapijas iedarbības nemainīja metabolisma potenciālu (OCR un ECAR). Kopumā šie rezultāti liecina, ka IPA var samazināt bioenerģētiku HSC, kas liecina, ka IPA var izraisīt zemāku enerģētisko profilu, kas novirza HSC fenotipu uz inaktivāciju (4.D papildattēls).
IPA ietekme uz mitohondriju dinamiku tika pētīta, izmantojot mitohondriju morfoloģijas un tīkla savienojumu trīsdimensiju kvantifikāciju, kā arī MTR krāsošanu (4. attēls un 5. papildattēls). 4. attēlā redzams, ka, salīdzinot ar kontroles grupu, TGF-β1 apstrāde samazināja vidējo virsmas laukumu, zaru skaitu, kopējo zaru garumu un zaru savienojumu skaitu (4.A un B attēls) un mainīja mitohondriju īpatsvaru no sfēriskas uz vidēju morfoloģiju (4.C attēls). Tikai IPA apstrāde samazināja vidējo mitohondriju tilpumu un mainīja mitohondriju īpatsvaru no sfēriskas uz vidēju morfoloģiju, salīdzinot ar kontroles grupu (4.A attēls). Turpretī sfēriskums, vidējais zaru garums un mitohondriju aktivitāte, kas novērtēta ar mitohondriju membrānas potenciāla atkarīgo MTR (4.A un E attēls), palika nemainīga, un šie parametri starp grupām neatšķīrās. Kopumā šie rezultāti liecina, ka TGF-β1 un IPA apstrāde, šķiet, modulē mitohondriju formu un izmēru, kā arī tīkla sarežģītību dzīvās LX-2 šūnās.
IPA maina mitohondriju dinamiku un mitohondriju DNS daudzumu LX-2 šūnās. A. Dzīvu LX-2 šūnu, kas inkubētas ar TGF-β1 (5 ng/ml) un 1 mM IPA 24 stundas bezseruma vidē, reprezentatīvi konfokālie attēli, kuros redzami mitohondriju tīkli, kas iekrāsoti ar Mitotracker™ Red CMXRos, un kodoli, kas iekrāsoti zilā krāsā ar DAPI. Visos datos bija vismaz 15 attēli katrā grupā. Katram parauga veidam ieguvām 10 Z-kaudzes attēlus. Katrā Z ass secībā bija 30 šķēles, katra ar 9,86 μm biezumu. Mēroga josla: 10 μm. B. Reprezentatīvi objekti (tikai mitohondriji), kas identificēti, attēlam piemērojot adaptīvo sliekšņa noteikšanu. Visām šūnām katrā grupā tika veikta mitohondriju morfoloģisko tīkla savienojumu kvantitatīva analīze un salīdzinājums. C. Mitohondriju formas attiecību biežums. Vērtības, kas ir tuvu 0, norāda sfēriskas formas, un vērtības, kas ir tuvu 1, norāda pavedienveida formas. D Mitohondriju DNS (mtDNS) saturs tika noteikts, kā aprakstīts sadaļā Materiāli un metodes. E Mitotracker™ Red CMXRos analīze tika veikta, izmantojot plūsmas citometriju (30 000 notikumu), kā aprakstīts sadaļā “Materiāli un metodes”. Dati ir norādīti kā vidējais ± SD, n = 3 neatkarīgi eksperimenti. Statistiskie salīdzinājumi tika veikti, izmantojot vienvirziena ANOVA un Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Pēc tam mēs analizējām mtDNS saturu LX-2 šūnās kā mitohondriju skaita indikatoru. Salīdzinot ar kontroles grupu, TGF-β1 apstrādātajā grupā mtDNS saturs bija palielināts (4.D attēls). Salīdzinot ar TGF-β1 apstrādāto grupu, kombinētās terapijas grupā mtDNS saturs bija samazināts (4.D attēls), kas liecina, ka IPA var samazināt mtDNS saturu un, iespējams, mitohondriju skaitu, kā arī mitohondriju elpošanu (3.C attēls). Turklāt IPA, šķiet, samazināja mtDNS saturu kombinētajā terapijā, bet neietekmēja MTR mediēto mitohondriju aktivitāti (4.A–C attēls).
Mēs pētījām IPA saistību ar gēnu mRNS līmeņiem, kas saistīti ar fibrozi, apoptozi, izdzīvošanu un mitohondriju dinamiku LX-2 šūnās (5.A–D attēls). Salīdzinot ar kontroles grupu, TGF-β1 apstrādātajā grupā bija novērojama tādu gēnu kā I tipa kolagēna α2 ķēdes (COL1A2), α-gludo muskuļu aktīna (αSMA), matricas metaloproteināzes 2 (MMP2), metaloproteināzes 1 audu inhibitora (TIMP1) un dinamīnam 1 līdzīgā gēna (DRP1) pastiprināta ekspresija, kas norāda uz palielinātu fibrozi un aktivāciju. Turklāt, salīdzinot ar kontroles grupu, TGF-β1 terapija samazināja kodola pregnāna X receptora (PXR), kaspāzes 8 (CASP8), MAPKAPK3, B šūnu α inhibitora, kodolfaktora κ gēna vieglā peptīda pastiprinātāja (NFκB1A) un kodolfaktora κB kināzes apakšvienības β inhibitora (IKBKB) mRNS līmeni (5.A–D attēls). Salīdzinot ar TGF-β1 terapiju, kombinēta terapija ar TGF-β1 un IPA samazināja COL1A2 un MMP2 ekspresiju, bet palielināja PXR, TIMP1, B-šūnu limfomas-2 (BCL-2), CASP8, NFκB1A, NFκB1-β un IKBKB mRNS līmeni. IPA terapija ievērojami samazināja MMP2, Bcl-2 saistītā proteīna X (BAX), AKT1, redzes nerva atrofijas proteīna 1 (OPA1) un mitohondriju saplūšanas proteīna 2 (MFN2) ekspresiju, savukārt CASP8, NFκB1A, NFκB1B un IKBKB ekspresija bija palielināta, salīdzinot ar kontroles grupu. Tomēr netika konstatēta atšķirība kaspāzes-3 (CASP3), apoptotiskās peptidāzes aktivējošā faktora 1 (APAF1), mitohondriju saplūšanas proteīna 1 (MFN1) un dalīšanās proteīna 1 (FIS1) ekspresijā. Kopumā šie rezultāti liecina, ka IPA terapija modulē ar fibrozi, apoptozi, izdzīvošanu un mitohondriju dinamiku saistīto gēnu ekspresiju. Mūsu dati liecina, ka IPA terapija samazina fibrozi LX-2 šūnās; vienlaikus tā stimulē izdzīvošanu, novirzot fenotipu uz inaktivāciju.
IPA modulē fibroblastu, apoptozes, dzīvotspējas un mitohondriju dinamikas gēnu ekspresiju LX-2 šūnās. Histogrammās ir attēlota mRNS ekspresija attiecībā pret endogēno kontroli (RPLP0 vai PPIA) pēc tam, kad LX-2 šūnas 24 stundas tika inducētas ar TGF-β1 un IPA seruma nesaturošā vidē. A norāda fibroblastus, B norāda apoptotiskas šūnas, C norāda izdzīvojušās šūnas un D norāda mitohondriju dinamikas gēnu ekspresiju. Dati ir parādīti kā vidējais ± standartnovirze (SD), n = 3 neatkarīgi eksperimenti. Statistikas salīdzinājumi tika veikti, izmantojot vienvirziena ANOVA un Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001
Pēc tam šūnu lieluma (FSC-H) un citoplazmatiskās sarežģītības (SSC-H) izmaiņas tika novērtētas ar plūsmas citometriju (6A., B. attēls), un šūnu morfoloģijas izmaiņas pēc IPA apstrādes tika novērtētas ar transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM) un fāzu kontrasta mikroskopiju (6A.-B. papildattēls). Kā paredzēts, TGF-β1 apstrādātās grupas šūnas palielinājās izmērā, salīdzinot ar kontroles grupu (6A., B. attēls), parādot klasisku raupjā endoplazmatiskā tīkla (ER*) un fagolizosomu (P) paplašināšanos, kas norāda uz hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) aktivāciju (6A. papildattēls). Tomēr, salīdzinot ar TGF-β1 apstrādāto grupu, TGF-β1 un IPA kombinētās apstrādes grupā šūnu izmērs, citoplazmatiskās sarežģītības (6A., B. attēls) un ER* saturs samazinājās (6A. papildattēls). Turklāt IPA apstrāde samazināja šūnu izmēru, citoplazmatiskās sarežģītības (6A., B. attēls), P un ER* saturu (6A. papildattēls) salīdzinājumā ar kontroles grupu. Turklāt apoptotisko šūnu saturs palielinājās pēc 24 stundu IPA apstrādes, salīdzinot ar kontroles grupu (baltās bultiņas, 6.B papildattēls). Kopumā šie rezultāti liecina, ka 1 mM IPA var stimulēt HSC apoptozi un mainīt TGF-β1 izraisītās šūnu morfoloģisko parametru izmaiņas, tādējādi regulējot šūnu lielumu un sarežģītību, kas var būt saistīta ar HSC inaktivāciju.
IPA maina šūnu lielumu un citoplazmas sarežģītību LX-2 šūnās. Plūsmas citometrijas analīzes reprezentatīvi attēli. Analīzē tika izmantota LX-2 šūnām specifiska vārtēšanas stratēģija: SSC-A/FSC-A, lai definētu šūnu populāciju, FSC-H/FSC-A, lai identificētu dubletus, un SSC-H/FSC-H šūnu lieluma un sarežģītības analīzei. Šūnas tika inkubētas ar TGF-β1 (5 ng/ml) un 1 mM IPA seruma nesaturošā vidē 24 stundas. LX-2 šūnas tika sadalītas apakšējā kreisajā kvadrantā (SSC-H-/FSC-H-), augšējā kreisajā kvadrantā (SSC-H+/FSC-H-), apakšējā labajā kvadrantā (SSC-H-/FSC-H+) un augšējā labajā kvadrantā (SSC-H+/FSC-H+) šūnu lieluma un citoplazmas sarežģītības analīzei. B. Šūnu morfoloģija tika analizēta ar plūsmas citometriju, izmantojot FSC-H (uz priekšu vērsta izkliede, šūnas lielums) un SSC-H (sānu izkliede, citoplazmas sarežģītība) (30 000 notikumu). Dati ir attēloti kā vidējais ± standartnovirze, n = 3 neatkarīgi eksperimenti. Statistiskās salīdzināšanas tika veiktas, izmantojot vienvirziena ANOVA un Bonferroni post hoc testu. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001 un ****p < 0,0001
Zarnu metabolīti, piemēram, IPA, ir kļuvuši par karstu pētījumu tēmu, kas liecina, ka zarnu mikrobiotā varētu atklāt jaunus mērķus. Tāpēc ir interesanti, ka IPA, metabolīts, ko esam saistījuši ar aknu fibrozi cilvēkiem [15], ir pierādīts kā potenciāls antifibrotisks savienojums dzīvnieku modeļos [13, 14]. Šeit mēs pirmo reizi demonstrējam saistību starp seruma IPA līmeni un globālo aknu transkriptomiku un DNS metilēšanu aptaukošanās pacientiem bez 2. tipa diabēta (T2D), izceļot apoptozi, mitofāgiju un ilgmūžību, kā arī iespējamu AKT1 gēnu, kas regulē aknu homeostāzi. Vēl viens mūsu pētījuma jaunums ir tas, ka mēs demonstrējām IPA ārstēšanas mijiedarbību ar apoptozi, šūnu morfoloģiju, mitohondriju bioenerģētiku un dinamiku LX-2 šūnās, norādot uz zemākas enerģijas spektru, kas novirza HSC fenotipu uz inaktivāciju, padarot IPA par potenciālu kandidātu aknu fibrozes uzlabošanai.
Mēs atklājām, ka apoptoze, mitofāgija un ilgmūžība bija vissvarīgākie kanoniskie ceļi, kas bagātināti ar aknu gēniem, kas saistīti ar cirkulējošo seruma IPA. Mitohondriju kvalitātes kontroles (MQC) sistēmas darbības traucējumi var izraisīt mitohondriju disfunkciju, mitofāgiju un apoptozi, tādējādi veicinot MASLD rašanos [33, 34]. Tādēļ mēs varam spekulēt, ka IPA varētu būt iesaistīts šūnu dinamikas un mitohondriju integritātes uzturēšanā, izmantojot apoptozi, mitofāgiju un ilgmūžību aknās. Mūsu dati parādīja, ka visos trijos testos bija kopīgi divi gēni: YKT6 un AKT1. Ir vērts atzīmēt, ka YKT6 ir SNARE proteīns, kas iesaistīts šūnu membrānas saplūšanas procesā. Tam ir nozīme autofāgijā un mitofāgijā, veidojot iniciācijas kompleksu ar STX17 un SNAP29 autofagosomā, tādējādi veicinot autofagosomu un lizosomu saplūšanu [35]. Turklāt YKT6 funkcijas zudums izraisa mitofagijas traucējumus [36], savukārt YKT6 regulācijas palielināšanās ir saistīta ar hepatocelulāras karcinomas (HCC) progresēšanu, parādot palielinātu šūnu izdzīvošanu [37]. No otras puses, AKT1 ir vissvarīgākais mijiedarbojošais gēns un tam ir svarīga loma aknu slimībās, tostarp PI3K/AKT signālceļā, šūnu ciklā, šūnu migrācijā, proliferācijā, fokālajā adhēzijā, mitohondriju funkcijā un kolagēna sekrēcijā [38–40]. Aktivētais PI3K/AKT signālceļš var aktivizēt hematopoētiskās cilmes šūnas (HSC), kas ir šūnas, kas atbild par ekstracelulārās matrices (ECM) veidošanos, un tā disregulācija var veicināt aknu fibrozes rašanos un progresēšanu [40]. Turklāt AKT ir viens no galvenajiem šūnu izdzīvošanas faktoriem, kas kavē no p53 atkarīgu šūnu apoptozi, un AKT aktivācija var būt saistīta ar aknu šūnu apoptozes inhibīciju [41, 42]. Iegūtie rezultāti liecina, ka IPA var būt iesaistīts ar aknu mitohondrijiem saistītajā apoptozē, ietekmējot hepatocītu lēmumu starp apoptozes iekļūšanu vai izdzīvošanu. Šīs sekas var regulēt AKT un/vai YKT6 kandidātu gēni, kas ir kritiski svarīgi aknu homeostāzei.
Mūsu rezultāti parādīja, ka 1 mM IPA izraisīja apoptozi un samazināja mitohondriju elpošanu LX-2 šūnās neatkarīgi no TGF-β1 apstrādes. Jāatzīmē, ka apoptoze ir galvenais fibrozes risināšanas un hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) aktivācijas ceļš, kā arī galvenais notikums aknu fibrozes atgriezeniskajā fizioloģiskajā reakcijā [4, 43]. Turklāt BHI atjaunošanās LX-2 šūnās pēc kombinētās terapijas sniedza jaunu ieskatu IPA potenciālajā lomā mitohondriju bioenerģētikas regulēšanā. Atpūtas un neaktīvos apstākļos hematopoētiskās šūnas parasti izmanto mitohondriju oksidatīvo fosforilēšanu, lai ražotu ATP, un tām ir zema vielmaiņas aktivitāte. No otras puses, HSC aktivācija uzlabo mitohondriju elpošanu un biosintēzi, lai kompensētu enerģijas patēriņu, kas nepieciešams, lai nonāktu glikolītiskajā stāvoklī [44]. Fakts, ka IPA neietekmēja vielmaiņas potenciālu un ECAR, liecina, ka glikolītiskais ceļš ir mazāk prioritārs. Līdzīgi citā pētījumā tika parādīts, ka 1 mM IPA spēja modulēt mitohondriju elpošanas ķēdes aktivitāti kardiomiocītos, cilvēka hepatocītu šūnu līnijā (Huh7) un cilvēka nabassaites vēnu endotēlija šūnās (HUVEC); Tomēr netika konstatēta IPA ietekme uz glikolīzi kardiomiocītos, kas liecina, ka IPA var ietekmēt citu šūnu tipu bioenerģētiku [45]. Tāpēc mēs pieņemam, ka 1 mM IPA varētu darboties kā viegls ķīmisks atdalītājs, jo tas var ievērojami samazināt fibrogēno gēnu ekspresiju, šūnu morfoloģiju un mitohondriju bioenerģētiku, nemainot mtDNS daudzumu [46]. Mitohondriju atdalītāji var kavēt kultūras izraisītu fibrozi un HSC aktivāciju [47] un samazināt mitohondriju ATP ražošanu, ko regulē vai inducē noteikti proteīni, piemēram, atdalītājproteīni (UCP) vai adenīna nukleotīdu translokāze (ANT). Atkarībā no šūnu tipa šī parādība var aizsargāt šūnas no apoptozes un/vai veicināt apoptozi [46]. Tomēr ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai noskaidrotu IPA lomu kā mitohondriju atdalītājam hematopoētisko cilmes šūnu inaktivācijā.
Pēc tam mēs pētījām, vai mitohondriju elpošanas izmaiņas atspoguļojas mitohondriju morfoloģijā dzīvās LX-2 šūnās. Interesanti, ka TGF-β1 terapija maina mitohondriju proporciju no sfēriskas uz vidēju, samazinot mitohondriju sazarojumu un palielinot DRP1, kas ir galvenais mitohondriju dalīšanās faktors, ekspresiju [48]. Turklāt mitohondriju fragmentācija ir saistīta ar kopējo tīkla sarežģītību, un pāreja no saplūšanas uz dalīšanos ir kritiski svarīga hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) aktivācijai, savukārt mitohondriju dalīšanās inhibīcija noved pie HSC apoptozes [49]. Tādējādi mūsu rezultāti liecina, ka TGF-β1 terapija var izraisīt mitohondriju tīkla sarežģītības samazināšanos ar samazinātu sazarojumu, kas ir biežāk sastopama mitohondriju dalīšanās gadījumā, kas saistīts ar aktivētām hematopoētiskajām cilmes šūnām (HSC). Turklāt mūsu dati parādīja, ka IPA var mainīt mitohondriju proporciju no sfēriskas uz vidēju formu, tādējādi samazinot OPA1 un MFN2 ekspresiju. Pētījumi liecina, ka OPA1 regulācijas samazināšana var izraisīt mitohondriju membrānas potenciāla samazināšanos un izraisīt šūnu apoptozi [50]. Ir zināms, ka MFN2 mediē mitohondriju saplūšanu un apoptozi [51]. Iegūtie rezultāti liecina, ka LX-2 šūnu indukcija ar TGF-β1 un/vai IPA, šķiet, modulē mitohondriju formu un lielumu, kā arī aktivācijas stāvokli un tīkla sarežģītību.
Mūsu rezultāti liecina, ka TGFβ-1 un IPA kombinētā terapija varētu samazināt mtDNS un šūnu morfoloģiskos parametrus, regulējot fibrozes, apoptozes un ar izdzīvošanu saistīto gēnu mRNS ekspresiju apoptozi izvairošās šūnās. Patiešām, IPA samazināja AKT1 un svarīgu fibrozes gēnu, piemēram, COL1A2 un MMP2, mRNS ekspresijas līmeni, bet palielināja CASP8 ekspresijas līmeni, kas ir saistīts ar apoptozi. Mūsu rezultāti parādīja, ka pēc IPA terapijas BAX ekspresija samazinājās un TIMP1 saimes apakšvienību, BCL-2 un NF-κB, mRNS ekspresija palielinājās, kas liecina, ka IPA varētu stimulēt izdzīvošanas signālus hematopoētiskajās cilmes šūnās (HSC), kas izvairās no apoptozes. Šīs molekulas var darboties kā izdzīvošanu veicinoši signāli aktivētās hematopoētiskajās cilmes šūnās, kas var būt saistīts ar antiapoptotisku olbaltumvielu (piemēram, Bcl-2) ekspresijas palielināšanos, proapoptotiska BAX ekspresijas samazināšanos un sarežģītu mijiedarbību starp TIMP un NF-κB [5, 7]. IPA iedarbojas caur PXR, un mēs atklājām, ka kombinēta ārstēšana ar TGF-β1 un IPA palielināja PXR mRNS ekspresijas līmeni, kas norāda uz HSC aktivācijas nomākšanu. Ir zināms, ka aktivētā PXR signalizācija inhibē HSC aktivāciju gan in vivo, gan in vitro [52, 53]. Mūsu rezultāti liecina, ka IPA var piedalīties aktivēto HSC klīrensā, veicinot apoptozi, samazinot fibrozi un mitohondriju metabolismu, kā arī uzlabojot izdzīvošanas signālus, kas ir tipiski procesi, kas pārveido aktivēto HSC fenotipu par inaktivētu. Vēl viens iespējamais IPA potenciālā mehānisma un lomas apoptozē skaidrojums ir tas, ka tas iznīcina disfunkcionālus mitohondrijus galvenokārt caur mitofagiju (iekšējais ceļš) un ārējo TNF signalizācijas ceļu (1. tabula), kas ir tieši saistīts ar NF-κB izdzīvošanas signalizācijas ceļu (7. papildattēls). Interesanti, ka ar IPA saistītie bagātinātie gēni spēj inducēt proapoptotiskus un pro-izdzīvošanas signālus apoptozes ceļā [54], kas liecina, ka IPA var inducēt apoptozes ceļu vai izdzīvošanu, mijiedarbojoties ar šiem gēniem. Tomēr joprojām nav skaidrs, kā IPA izraisa apoptozi vai izdzīvošanu HSC aktivācijas laikā un tā mehāniskie ceļi.
IPA ir mikrobiāls metabolīts, kas veidojas no uztura triptofāna, izmantojot zarnu mikrobiotu. Pētījumi liecina, ka tam piemīt pretiekaisuma, antioksidanta un epigenetiskas regulējošas īpašības zarnu vidē.[55] Pētījumi liecina, ka IPA var modulēt zarnu barjeras funkciju un samazināt oksidatīvo stresu, kas var veicināt tā lokālo fizioloģisko iedarbību.[56] Faktiski IPA tiek transportēts uz mērķa orgāniem caur asinsriti, un, tā kā IPA ir līdzīga galvenā metabolīta struktūra ar triptofānu, serotonīnu un indola atvasinājumiem, IPA veic vielmaiņas darbības, kā rezultātā rodas konkurējoši vielmaiņas likteņi.[52] IPA var konkurēt ar triptofāna atvasinātiem metabolītiem par saistīšanās vietām pie enzīmiem vai receptoriem, potenciāli traucējot normālus vielmaiņas ceļus. Tas uzsver nepieciešamību veikt turpmākus pētījumus par tā farmakokinētiku un farmakodinamiku, lai labāk izprastu tā terapeitisko logu.[57] Vēl jānoskaidro, vai tas var notikt arī hematopoētiskajās cilmes šūnās (HSC).
Mēs atzīstam, ka mūsu pētījumam ir daži ierobežojumi. Lai īpaši pārbaudītu ar IPA saistītās saistības, mēs izslēdzām pacientus ar 2. tipa cukura diabētu (T2DM). Mēs atzīstam, ka tas ierobežo mūsu atklājumu plašo piemērojamību pacientiem ar 2. tipa cukura diabētu un progresējošu aknu slimību. Lai gan IPA fizioloģiskā koncentrācija cilvēka serumā ir 1–10 μM [11, 20], 1 mM IPA koncentrācija tika izvēlēta, pamatojoties uz augstāko netoksisko koncentrāciju [15] un augstāko apoptozes ātrumu, bez atšķirības nekrotisko šūnu populācijas procentuālajā daļā. Lai gan šajā pētījumā tika izmantoti suprafizioloģiski IPA līmeņi, pašlaik nav vienprātības par efektīvo IPA devu [52]. Lai gan mūsu rezultāti ir nozīmīgi, plašāks IPA metabolisma liktenis joprojām ir aktīva pētījumu joma. Turklāt mūsu atklājumi par saistību starp seruma IPA līmeni un aknu transkriptu DNS metilēšanu tika iegūti ne tikai no hematopoētiskajām cilmes šūnām (HSC), bet arī no aknu audiem. Mēs izvēlējāmies izmantot cilvēka LX-2 šūnas, pamatojoties uz iepriekšējiem transkriptomas analīzes atklājumiem, ka IPA ir saistīts ar hematopoētisko cilmes šūnu (HSC) aktivāciju [15], un HSC ir galvenās šūnas, kas iesaistītas aknu fibrozes progresēšanā. Aknas sastāv no vairākiem šūnu tipiem, tāpēc, lai pētītu IPA lomu un tā mijiedarbību ar citiem aknu šūnu tipiem, jāņem vērā citi šūnu modeļi, piemēram, hepatocītu-HSC-imūnšūnu kopkultūras sistēma apvienojumā ar kaspāzes aktivāciju un DNS fragmentāciju, kā arī darbības mehānisms, tostarp olbaltumvielu līmenis.