Dažādas augu aizsardzības teorijas sniedz svarīgus teorētiskus norādījumus augu specializētā metabolisma modeļu skaidrošanai, taču to galvenās prognozes vēl ir jāpārbauda. Šeit mēs izmantojām objektīvu tandēma masas spektrometrijas (MS/MS) analīzi, lai sistemātiski izpētītu tabakas novājinātu celmu metabolomu no atsevišķiem augiem līdz populācijām un cieši radniecīgām sugām, un apstrādājām lielu skaitu masas spektrometrisko pazīmju teoriju, pamatojoties uz savienojumu spektriem informācijā. Ietvars, lai pārbaudītu optimālās aizsardzības (OD) un kustīgā mērķa (MT) teoriju galvenās prognozes. Augu metabolomikas informācijas komponents atbilst OD teorijai, bet ir pretrunā ar MT teorijas galveno prognozi par zālēdāju izraisīto metabolomikas dinamiku. No mikro līdz makro evolūcijas mērogam jasmonāta signāls tika identificēts kā galvenais OD noteicošais faktors, savukārt etilēna signāls nodrošināja zālēdājiem specifiskās atbildes precizēšanu, ko anotēja MS/MS molekulārais tīkls.
Īpaši metabolīti ar dažādām struktūrām ir galvenie dalībnieki augu adaptācijā videi, īpaši aizsardzībā pret ienaidniekiem (1). Apbrīnojamā augos sastopamā īpašā metabolisma dažādība ir stimulējusi gadu desmitiem ilgus padziļinātus pētījumus par tā daudzajiem ekoloģisko funkciju aspektiem un ir izveidojusi garu augu aizsardzības teoriju sarakstu, kas ir augu un kukaiņu mijiedarbības evolucionārā un ekoloģiskā attīstība. Empīriskie pētījumi sniedz svarīgus norādījumus (2). Tomēr šīs augu aizsardzības teorijas nesekoja hipotētiskas deduktīvās spriešanas normatīvajam ceļam, kurā galvenās prognozes bija vienādā analīzes līmenī (3) un tika pārbaudītas eksperimentāli, lai virzītu nākamo teorētiskās attīstības ciklu (4). Tehniskie ierobežojumi ierobežo datu vākšanu līdz konkrētām metabolisma kategorijām un izslēdz specializētu metabolītu visaptverošu analīzi, tādējādi novēršot starpkategoriju salīdzinājumus, kas ir būtiski teorētiskajai attīstībai (5). Visaptverošu metabolomikas datu un kopīgas valūtas trūkums, lai salīdzinātu metabolisma telpas apstrādes darbplūsmu starp dažādām augu grupām, kavē šīs jomas zinātnisko briedumu.
Jaunākie sasniegumi tandēma masas spektrometrijas (MS/MS) metabolomikas jomā var vispusīgi raksturot vielmaiņas izmaiņas dotās sistēmas klades sugās un starp tām, un tos var apvienot ar skaitļošanas metodēm, lai aprēķinātu strukturālo līdzību starp šiem sarežģītajiem maisījumiem. Priekšzināšanas ķīmijā (5). Progresīvu tehnoloģiju kombinācija analīzē un skaitļošanā nodrošina nepieciešamo ietvaru daudzu vielmaiņas daudzveidības ekoloģisko un evolūcijas teoriju prognožu ilgtermiņa pārbaudei. Šenons (6) pirmo reizi ieviesa informācijas teoriju savā fundamentālajā rakstā 1948. gadā, liekot pamatus informācijas matemātiskajai analīzei, kas ir izmantota daudzās citās jomās, ne tikai tās sākotnējā pielietojumā. Genomikā informācijas teorija ir veiksmīgi pielietota, lai kvantitatīvi noteiktu secības konservatīvo informāciju (7). Transkriptomikas pētījumos informācijas teorija analizē kopējās izmaiņas transkriptā (8). Iepriekšējos pētījumos mēs pielietojām informācijas teorijas statistisko ietvaru metabolomikai, lai aprakstītu audu līmeņa vielmaiņas kompetenci augos (9). Šeit mēs apvienojam MS/MS balstītu darbplūsmu ar informācijas teorijas statistisko ietvaru, ko raksturo vielmaiņas daudzveidība kopīgajā valūtā, lai salīdzinātu zālēdāju izraisītā metabolīta augu aizsardzības teorijas galvenās prognozes.
Augu aizsardzības teorētiskie pamati parasti ir savstarpēji iekļaujoši un tos var iedalīt divās kategorijās: tie, kas mēģina izskaidrot augiem raksturīgo metabolītu sadalījumu, pamatojoties uz aizsardzības funkcijām, piemēram, optimālās aizsardzības (OD) (10), kustīgā mērķa (MT) (11) un izskata (12) teorija, savukārt citi meklē mehāniskus skaidrojumus par to, kā resursu pieejamības izmaiņas ietekmē augu augšanu un specializēto metabolītu, piemēram, oglekļa, uzkrāšanos: barības vielu līdzsvara hipotēze (13), augšanas ātruma hipotēze (14) un augšanas un diferenciācijas līdzsvara hipotēze (15). Abas teoriju kopas atrodas dažādos analīzes līmeņos (4). Tomēr sarunā par augu konstitutīvo un inducējamo aizsardzību dominē divas teorijas, kas ietver aizsardzības funkcijas funkcionālā līmenī: OD teorija, kas pieņem, ka augi iegulda līdzekļus dārgās ķīmiskajās aizsardzībās tikai nepieciešamības gadījumā, piemēram, kad tie tiek norīti. Kad zāles dzīvnieks uzbrūk, savienojums ar aizsardzības funkciju tiek piešķirts atbilstoši nākotnes uzbrukuma iespējamībai (10); MT hipotēze apgalvo, ka nav virziena metabolītu izmaiņu ass, bet metabolīts mainās nejauši, tādējādi radot iespēju traucēt uzbrūkošo zālēdāju vielmaiņas “kustības mērķi”. Citiem vārdiem sakot, šīs divas teorijas sniedz pretējas prognozes par vielmaiņas pārveidošanos, kas notiek pēc zālēdāju uzbrukuma: saistību starp vienvirziena metabolītu uzkrāšanos ar aizsardzības funkciju (OD) un nevirzītām vielmaiņas izmaiņām (MT) (11).
OD un MT hipotēzes ietver ne tikai inducētās izmaiņas metabolomā, bet arī šo metabolītu uzkrāšanās ekoloģiskās un evolūcijas sekas, piemēram, šo vielmaiņas izmaiņu adaptīvās izmaksas un ieguvumus noteiktā ekoloģiskā vidē (16). Lai gan abas hipotēzes atzīst specializēto metabolītu aizsardzības funkciju, kas var būt dārga vai nē, galvenā prognoze, kas atšķir OD un MT hipotēzes, ir inducēto vielmaiņas izmaiņu virziens. OD teorijas prognoze līdz šim ir saņēmusi vislielāko eksperimentālo uzmanību. Šie testi ietver specifisku savienojumu dažādu audu tiešo vai netiešo aizsardzības funkciju izpēti siltumnīcās un dabiskos apstākļos, kā arī izmaiņas augu attīstības stadijā (17–19). Tomēr līdz šim, tā kā trūkst darbplūsmas un statistiskās sistēmas jebkura organisma vielmaiņas daudzveidības globālai visaptverošai analīzei, galvenā atšķirības prognoze starp abām teorijām (tas ir, vielmaiņas izmaiņu virziens) vēl ir jāpārbauda. Šeit mēs sniedzam šādu analīzi.
Viena no būtiskākajām augiem raksturīgo metabolītu īpašībām ir to ārkārtējā strukturālā daudzveidība visos līmeņos, sākot no atsevišķiem augiem, populācijām līdz līdzīgām sugām (20). Populāciju līmenī var novērot daudzas kvantitatīvas izmaiņas specializētajos metabolītos, savukārt sugu līmenī parasti saglabājas spēcīgas kvalitatīvas atšķirības (20). Tāpēc augu metabolisma daudzveidība ir galvenais funkcionālās daudzveidības aspekts, kas atspoguļo pielāgošanās spēju dažādām nišām, īpaši tām nišām, kurās ir atšķirīgas invāzijas iespējas, ko rada īpaši kukaiņi un parastie zālēdāji (21). Kopš Frenkela (22) revolucionārā raksta par augiem raksturīgo metabolītu pastāvēšanas iemesliem mijiedarbība ar dažādiem kukaiņiem tiek uzskatīta par svarīgu atlases spiedienu, un tiek uzskatīts, ka šī mijiedarbība ir veidojusi augus evolūcijas laikā. Metaboliskais ceļš (23). Starpsugu atšķirības specializēto metabolītu daudzveidībā var atspoguļot arī fizioloģisko līdzsvaru, kas saistīts ar konstitutīvo un inducējamo augu aizsardzību pret zālēdāju stratēģijām, jo ​​abas sugas bieži vien ir negatīvi korelētas viena ar otru (24). Lai gan var būt noderīgi visu laiku uzturēt labu aizsardzību, savlaicīgas vielmaiņas izmaiņas, kas saistītas ar aizsardzību, sniedz skaidras priekšrocības, ļaujot augiem piešķirt vērtīgus resursus citiem fizioloģiskiem ieguldījumiem (19, 24) un novēršot nepieciešamību pēc simbiozes. Blakus bojājumi (25). Turklāt šīs specializēto metabolītu reorganizācijas, ko izraisa kukaiņu zālēdāji, var izraisīt destruktīvu izplatību populācijā (26) un var atspoguļot tiešus būtisku dabisko izmaiņu rādījumus jasmonskābes (JA) signālā, kas var tikt saglabāts populācijā. Augsti un zemi JA signāli ir kompromisi starp aizsardzību pret zālēdājiem un konkurenci ar specifiskām sugām (27). Turklāt specializētie metabolītu biosintēzes ceļi evolūcijas laikā strauji izzudīs un transformēsies, kā rezultātā vielmaiņas sadalījums starp cieši radniecīgām sugām būs nevienmērīgs (28). Šos polimorfismus var ātri izveidot, reaģējot uz mainīgajiem zālēdāju modeļiem (29), kas nozīmē, ka zālēdāju kopienu svārstības ir galvenais faktors, kas veicina vielmaiņas heterogenitāti.
Šeit mēs konkrēti atrisinājām šādas problēmas. (I) Kā zālēdājs kukainis pārkonfigurē auga metabolomu? (Ii) Kādi ir galvenie vielmaiņas plastiskuma informācijas komponenti, kurus var kvantificēt, lai pārbaudītu ilgtermiņa aizsardzības teorijas prognozes? (Iii) Vai pārprogrammēt auga metabolomu uzbrucējam unikālā veidā, ja tā, kāda loma augu hormoniem ir specifiskas vielmaiņas reakcijas pielāgošanā, un kuri metabolīti veicina aizsardzības specifiku sugai? (Iv) Tā kā daudzu aizsardzības teoriju prognozes var attiecināt uz visiem bioloģisko audu līmeņiem, mēs jautājām, cik konsekventa ir izraisītā vielmaiņas reakcija, sākot no iekšējās salīdzināšanas līdz starpsugu salīdzinājumam? Šajā nolūkā mēs sistemātiski pētījām tabakas nikotīna lapu metabolomu, kas ir ekoloģisks modeļa augs ar bagātīgu specializētu metabolismu un ir efektīvs pret divu vietējo zālēdāju Lepidoptera Datura (Ms) (ļoti agresīvi, galvenokārt ēdami) kāpuriem. Solanaceae un Spodoptera littoralis (Sl) ģintīs kokvilnas lapu tārpi ir sava veida "ģints", ar Solanaceae saimniekaugiem un citiem ģinšu un dzimtu saimniekaugiem (Augu barība). Mēs analizējām MS/MS metabolomikas spektru un ieguvām informācijas teorijas statistiskos deskriptorus, lai salīdzinātu OD un MT teorijas. Izveidojām specifiskuma kartes, lai atklātu galveno metabolītu identitāti. Analīze tika paplašināta, iekļaujot N. nasi vietējo populāciju un cieši radniecīgas tabakas sugas, lai tālāk analizētu kovariāciju starp augu hormonu signalizāciju un OD indukciju.
Lai iegūtu vispārēju karti par zālēdāju tabakas lapu metaboloma plastiskumu un struktūru, mēs izmantojām iepriekš izstrādātu analīzes un aprēķinu darbplūsmu, lai vispusīgi apkopotu un dekonvolucionētu augstas izšķirtspējas datu neatkarīgus MS/MS spektrus no augu ekstraktiem (9). Šī nediferencētā metode (saukta par MS/MS) var konstruēt neredundantu savienojumu spektrus, kurus pēc tam var izmantot visām šeit aprakstītajām savienojumu līmeņa analīzēm. Šie dekonvolucionētie augu metabolīti ir dažādu veidu, kas sastāv no simtiem līdz tūkstošiem metabolītu (šeit aptuveni 500–1000 s/MS/MS). Šeit mēs aplūkojam vielmaiņas plastiskumu informācijas teorijas ietvaros un kvantitatīvi nosakām metaboloma daudzveidību un profesionalitāti, pamatojoties uz vielmaiņas biežuma sadalījuma Šenona entropiju. Izmantojot iepriekš ieviesto formulu (8), mēs aprēķinājām indikatoru kopumu, ko var izmantot, lai kvantitatīvi noteiktu metaboloma daudzveidību (Hj indikators), vielmaiņas profila specializāciju (δj indikators) un atsevišķa metabolīta vielmaiņas specifiskumu (Si indikators). Turklāt mēs izmantojām relatīvā attāluma plastiskuma indeksu (RDPI), lai kvantitatīvi noteiktu zālēdāju metabolomu inducējamību (1.A attēls) (30). Šajā statistikas sistēmā mēs uzskatām MS/MS spektru par pamatinformācijas vienību un apstrādājam MS/MS relatīvo pārpilnību frekvenču sadalījuma kartē, un pēc tam izmantojam Šenona entropiju, lai no tās novērtētu metabolomu daudzveidību. Metabolomu specializācija tiek mērīta ar viena MS/MS spektra vidējo specifiskumu. Tāpēc dažu MS/MS klašu pārpilnības palielināšanās pēc zālēdāju indukcijas tiek pārveidota par spektrālo inducējamību, RDPI un specializāciju, tas ir, δj indeksa palielināšanos, jo tiek ražoti specializētāki metabolīti un tiek ražots augsts Si indekss. Hj daudzveidības indeksa samazināšanās atspoguļo to, ka vai nu tiek samazināts ģenerēto MS/MS skaits, vai arī profila frekvenču sadalījums mainās mazāk vienmērīgā virzienā, vienlaikus samazinot tā kopējo nenoteiktību. Izmantojot Si indeksa aprēķinu, ir iespējams izcelt, kuras MS/MS izraisa noteikti zālēdāji, gluži pretēji, kuras MS/MS nereaģē uz indukciju, kas ir galvenais rādītājs, lai atšķirtu MT un OD prognozēšanu.
(A) Statistikas deskriptori, ko izmanto zālēdāju (H1 līdz Hx) MS/MS datu inducējamībai (RDPI), daudzveidībai (Hj indekss), specializācijai (δj indekss) un metabolītu specifiskumam (Si indekss). Specializācijas pakāpes (δj) palielināšanās norāda, ka vidēji tiks saražots vairāk zālēdājiem specifisku metabolītu, savukārt daudzveidības samazināšanās (Hj) norāda uz metabolītu ražošanas samazināšanos vai nevienmērīgu metabolītu sadalījumu sadalījuma kartē. Si vērtība novērtē, vai metabolīts ir specifisks noteiktam stāvoklim (šeit zālēdājiem) vai otrādi, tiek uzturēts tajā pašā līmenī. (B) Aizsardzības teorijas prognozēšanas konceptuālā diagramma, izmantojot informācijas teorijas asi. OD teorija prognozē, ka zālēdāju uzbrukums palielinās aizsardzības metabolītu daudzumu, tādējādi palielinot δj. Tajā pašā laikā Hj samazinās, jo profils tiek pārkārtots, lai samazinātu vielmaiņas informācijas nenoteiktību. MT teorija prognozē, ka zālēdāju uzbrukums izraisīs nevirzītas izmaiņas metabolomā, tādējādi palielinot Hj kā palielinātas vielmaiņas informācijas nenoteiktības indikatoru un izraisot Si nejaušu sadalījumu. Mēs arī ierosinājām jauktu modeli, labāko MT, kurā daži metabolīti ar augstākām aizsardzības vērtībām būs īpaši palielināti (augsta Si vērtība), bet citi uzrādīs nejaušas reakcijas (zemāka Si vērtība).
Izmantojot informācijas teorijas deskriptorus, mēs interpretējam OD teoriju, lai prognozētu, ka zālēdāju izraisītas īpašas metabolītu izmaiņas neinducētā konstitutīvā stāvoklī novedīs pie (i) vielmaiņas specifiskuma (Si indeksa) palielināšanās, kas veicinās metabonomisko specifiskumu (δj indekss) (noteiktu īpašu metabolītu grupu ar augstāku aizsardzības vērtību palielināšanos), un (ii) metabolomu daudzveidības (Hj indeksa) samazināšanās vielmaiņas frekvences sadalījuma izmaiņu dēļ uz lielāku leptīna ķermeņa sadalījumu. Atsevišķa metabolīta līmenī ir sagaidāms sakārtots Si sadalījums, kur metabolīts palielinās Si vērtību atbilstoši savam aizsardzības vērtībai (1.B attēls). Šajā sakarā mēs izskaidrojam MT teoriju, lai prognozētu, ka ierosināšana novedīs pie (i) nevirzāmām metabolītu izmaiņām, kā rezultātā samazināsies δj indekss, un (ii) Hj indeksa palielināšanās vielmaiņas nenoteiktības palielināšanās dēļ. Vai nejaušības, ko var kvantificēt ar Šenona entropiju vispārinātas daudzveidības veidā. Attiecībā uz vielmaiņas sastāvu MT teorija prognozēs Si nejaušu sadalījumu. Ņemot vērā, ka daži metabolīti atrodas noteiktos apstākļos noteiktos apstākļos, bet citi apstākļi neatrodas noteiktos apstākļos, un to aizsardzības vērtība ir atkarīga no vides, mēs arī ierosinājām jauktu aizsardzības modeli, kurā δj un Hj ir sadalīti divās daļās gar Si pieaugumu visos virzienos, tikai noteiktas metabolītu grupas, kurām ir augstākas aizsardzības vērtības, īpaši palielinās Si, savukārt citām būs nejaušs sadalījums (1.B attēls).
Lai pārbaudītu pārdefinētās aizsardzības teorijas prognozi uz informācijas teorijas deskriptora ass, mēs uz Nepenthes pallens lapām izaudzējām eksperta (Ms) vai ģeneralista (Sl) zālēdāju kāpurus (2.A attēls). Izmantojot MS/MS analīzi, mēs ieguvām 599 neredundantus MS/MS spektrus (datu fails S1) no lapu audu metanola ekstraktiem, kas savākti pēc kāpuru barošanās. Izmantojot RDPI, Hj un δj indeksus, lai vizualizētu informācijas satura rekonfigurāciju MS/MS konfigurācijas failos, atklājas interesantas tendences (2.B attēls). Kopējā tendence ir tāda, ka, kā aprakstīts informācijas deskriptorā, kāpuriem turpinot ēst lapas, visu vielmaiņas reorganizācijas pakāpe laika gaitā palielinās: 72 stundas pēc zālēdāja ēšanas RDPI ievērojami palielinās. Salīdzinot ar nebojāto kontroli, Hj bija ievērojami samazināts, kas bija saistīts ar vielmaiņas profila specializācijas pakāpes palielināšanos, ko kvantificēja ar δj indeksu. Šī šķietamā tendence atbilst OD teorijas prognozēm, taču ir pretrunā ar MT teorijas galvenajām prognozēm, kas uzskata, ka nejaušas (bez virziena) metabolītu līmeņu izmaiņas tiek izmantotas kā aizsardzības maskēšanās (1.B attēls). Lai gan šo divu zālēdāju perorālās sekrēcijas (OS) elicitoru saturs un barošanās paradumi atšķiras, to tieša barošanās izraisīja līdzīgas izmaiņas Hj un δj virzienos 24 stundu un 72 stundu ražas novākšanas periodos. Vienīgā atšķirība parādījās 72 stundas pēc RDPI. Salīdzinot ar Ms barošanas izraisīto metabolismu, Sl barošanas izraisītais kopējais metabolisms bija augstāks.
(A) Eksperimenta dizains: parastās cūkas (S1) vai eksperta (Ms) zālēdāji tiek baroti ar atsāļotām krūkaugu lapām, savukārt simulētai zālēdāju barošanai standartizētu lapu pozīciju caurduršanai tiek izmantots Ms (W + OSM) OS. S1 (W + OSSl) kāpuri vai ūdens (W + W). Kontrole (C) ir nebojāta lapa. (B) Inducējamības (RDPI salīdzinājumā ar kontroles karti), daudzveidības (Hj indekss) un specializācijas (δj indekss) indekss, kas aprēķināts īpašajai metabolītu kartei (599 MS/MS; datu fails S1). Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp tiešo zālēdāju barošanu un kontroles grupu (Stjūdenta t-tests ar pāru t-testu, *P<0,05 un ***P<0,001). ns, nav svarīgi. (C) Galvenā (zilā kaste, aminoskābe, organiskā skābe un cukurs; datu fails S2) un īpašā metabolīta spektra (sarkanā kaste 443 MS/MS; datu fails S1) laika izšķirtspējas indekss pēc simulētas zālēdāju apstrādes. Krāsu josla norāda uz 95% ticamības intervālu. Zvaigznīte norāda uz būtisku atšķirību starp apstrādi un kontroli [dispersijas kvadrātiskā analīze (ANOVA), kam seko Tukey godīgi nozīmīgā atšķirība (HSD) post hoc daudzkārtējiem salīdzinājumiem, *P<0,05, **P<0,01 un *** P <0,001]. (D) Izkliedes diagrammu un īpašo metabolītu profilu specializācija (atkārtoti paraugi ar atšķirīgu apstrādi).
Lai izpētītu, vai zālēdāju izraisītā remodelācija metabolomu līmenī atspoguļojas atsevišķu metabolītu līmeņa izmaiņās, mēs vispirms pievērsāmies metabolītiem, kas iepriekš tika pētīti Nepenthes pallens lapās ar pierādītu zālēdāju rezistenci. Fenola amīdi ir hidroksicinnamamīda-poliamīna konjugāti, kas uzkrājas kukaiņu zālēdāju procesa laikā un ir zināmi kā kukaiņu veiktspējas samazinātāji (32). Mēs meklējām atbilstošo MS/MS prekursorus un uzzīmējām to kumulatīvās kinētiskās līknes (S1 attēls). Nav pārsteidzoši, ka fenola atvasinājumi, kas nav tieši iesaistīti aizsardzībā pret zālēdājiem, piemēram, hlorogēnskābe (CGA) un rutīns, pēc zālēdāju lietošanas tiek nomākti. Turpretī zālēdāji var padarīt fenola amīdus ļoti spēcīgus. Abu zālēdāju nepārtraukta barošanās izraisīja gandrīz vienādu fenola amīdu ierosmes spektru, un šis modelis bija īpaši acīmredzams fenola amīdu de novo sintēzes gadījumā. Tā pati parādība tiks novērota, izpētot 17-hidroksigeranilnonanediola diterpēna glikozīdu (17-HGL-DTG) metabolisko ceļu, kas rada lielu skaitu aciklisko diterpēnu ar efektīvām pret zālēdājiem vērstām funkcijām (33), no kuriem Ms barošana ar Sl izraisīja līdzīgu ekspresijas profilu (S1 attēls)).
Iespējamais tiešo zālēdāju barošanās eksperimentu trūkums ir atšķirība lapu patēriņa ātrumā un zālēdāju barošanās laikā, kas apgrūtina zālēdājiem raksturīgo efektu, ko izraisa brūces un zālēdāji, novēršanu. Lai labāk atrisinātu zālēdāju sugu specifiku inducētajā lapu vielmaiņas reakcijā, mēs simulējām Ms un Sl kāpuru barošanos, nekavējoties pielietojot svaigi savākto OS (OSM un OSS1) standarta punkcijas W konsekventās lapu pozīcijās. Šo procedūru sauc par W + OS apstrādi, un tā standartizē indukciju, precīzi nosakot zālēdāja izraisītās reakcijas sākumu, neradot traucējošu ietekmi, ko rada atšķirības audu zuduma ātrumā vai daudzumā (2.A attēls) (34). Izmantojot MS/MS analīzes un aprēķinu plūsmu, mēs ieguvām 443 MS/MS spektrus (datu fails S1), kas pārklājās ar spektriem, kas iepriekš tika apkopoti no tiešās barošanas eksperimentiem. Šīs MS/MS datu kopas informācijas teorijas analīze parādīja, ka lapām specializēto metabolomu pārprogrammēšana, simulējot zālēdājus, uzrādīja OS specifiskas inducēšanas (2.C attēls). Jo īpaši, salīdzinot ar OSS1 apstrādi, OSM izraisīja metabolomu specializācijas uzlabošanos 4 stundu laikā. Jāatzīmē, ka, salīdzinot ar tiešās zālēdāju barošanas eksperimentālo datu kopu, vielmaiņas kinētika, kas vizualizēta divdimensiju telpā, izmantojot Hj un δj kā koordinātas, un metabolomu specializācijas virziens, reaģējot uz simulētu zālēdāju apstrādi laika gaitā, pieauga konsekventi (2.D attēls). Vienlaikus mēs kvantitatīvi noteicām aminoskābju, organisko skābju un cukuru saturu (datu fails S2), lai noskaidrotu, vai šis mērķtiecīgais metabolomu kompetences pieaugums ir saistīts ar centrālā oglekļa metabolisma pārkonfigurāciju, reaģējot uz simulētiem zālēdājiem (S2 attēls). Lai labāk izskaidrotu šo modeli, mēs tālāk uzraudzījām iepriekš apspriesto fenolamīda un 17-HGL-DTG ceļu vielmaiņas akumulācijas kinētiku. OS specifiskā zālēdāju indukcija tiek pārveidota par diferenciālu pārkārtošanās modeli fenolamīda metabolismā (S3 attēls). Fenola amīdus, kas satur kumarīna un kofeila grupas, galvenokārt inducē OSS1, savukārt OSM izraisa specifisku ferulila konjugātu indukciju. 17-HGL-DTG ceļā tika konstatēta diferenciāla OS indukcija ar lejupējiem malonilēšanas un dimalonilēšanas produktiem (S3. attēls).
Pēc tam mēs pētījām OS inducēto transkriptoma plastiskumu, izmantojot laika gaitas mikročipu datu kopu, kas simulē OSM izmantošanu rozetes auga lapu apstrādei zālēdājiem. Paraugu ņemšanas kinētika būtībā pārklājas ar šajā metabolomikas pētījumā izmantoto kinētiku (35). Salīdzinot ar metaboloma rekonfigurāciju, kurā vielmaiņas plastiskums laika gaitā ir īpaši palielināts, mēs novērojam pārejošus transkripcijas uzliesmojumus lapās, ko izraisa Ms, kur transkriptoma inducējamība (RDPI) un specializācija (δj) ir 1. Šajā laika punktā bija ievērojams stundu skaita un daudzveidības (Hj) pieaugums, BMP1 ekspresija bija ievērojami samazināta, kam sekoja transkriptoma specializācijas relaksācija (S4. attēls). Metabolisma gēnu saimes (piemēram, P450, glikoziltransferāze un BAHD aciltransferāze) piedalās īpašu metabolītu montāžas procesā no struktūrvienībām, kas iegūtas no primārā metabolisma, ievērojot iepriekš minēto agrīno augstas specializācijas modeli. Kā gadījuma izpēte tika analizēts fenilalanīna ceļš. Analīze apstiprināja, ka fenola amīda metabolisma kodolgēni zālēdājiem ir ļoti izteikti OS inducēti, salīdzinot ar nepievilinātiem augiem, un to ekspresijas modeļi ir cieši saistīti. Transkripcijas faktors MYB8 un strukturālie gēni PAL1, PAL2, C4H un 4CL šī ceļa augšpusē uzrādīja agrīnu transkripcijas iniciāciju. Aciltransferāzes, kurām ir nozīme fenola amīda galīgajā montāžā, piemēram, AT1, DH29 un CV86, uzrāda ilgstošu augšupregulācijas modeli (S4. attēls). Iepriekš minētie novērojumi liecina, ka transkripta specializācijas agrīna iniciācija un vēlāka metabolomikas specializācijas pastiprināšana ir saistīti, kas var būt saistīts ar sinhrono regulēšanas sistēmu, kas ierosina spēcīgu aizsardzības reakciju.
Augu hormonu signalizācijas rekonfigurācija darbojas kā regulējošs slānis, kas integrē zālēdāju informāciju, lai pārprogrammētu augu fizioloģiju. Pēc zālēdāju simulācijas mēs izmērījām galveno augu hormonu kategoriju kumulatīvo dinamiku un vizualizējām to laika koekspresiju [Pīrsona korelācijas koeficients (PCC) > 0,4] (3.A attēls). Kā paredzēts, ar biosintēzi saistītie augu hormoni ir saistīti augu hormonu koekspresijas tīklā. Turklāt šajā tīklā tiek kartēta vielmaiņas specifika (Si indekss), lai izceltu augu hormonus, ko inducē dažādas apstrādes. Tiek izdalītas divas galvenās zālēdāju specifiskās atbildes zonas: viena atrodas JA klasterī, kur JA (tā bioloģiski aktīvā forma JA-Ile) un citi JA atvasinājumi uzrāda augstāko Si rādītāju; otra ir etilēns (ET). Giberellīns uzrādīja tikai mērenu zālēdāju specifiskuma pieaugumu, savukārt citiem augu hormoniem, piemēram, citokinīnam, auksīnam un abscisīnskābei, bija zema indukcijas specifika zālēdājiem. Salīdzinot ar W + W izmantošanu atsevišķi, JA atvasinājumu maksimālās vērtības amplifikāciju, izmantojot OS lietojumprogrammu (W + OS), būtībā var pārveidot par spēcīgu specifisku JA indikatoru. Negaidīti ir zināms, ka OSM un OSS1 ar atšķirīgu elicitoru saturu izraisa līdzīgu JA un JA-Ile uzkrāšanos. Atšķirībā no OSS1, OSM specifiski un spēcīgi inducē OSM, savukārt OSS1 nepastiprina bazālo brūču reakciju (3.B attēls).
(A) Koekspresijas tīkla analīze, kuras pamatā ir PCC aprēķins zālēdāju inducētas augu hormonu uzkrāšanās kinētikas simulācijai. Mezgls apzīmē vienu augu hormonu, un mezgla lielums apzīmē Si indeksu, kas raksturīgs augu hormonam starp apstrādēm. (B) JA, JA-Ile un ET uzkrāšanās lapās, ko izraisa dažādas apstrādes, ko norāda dažādas krāsas: aprikožu, W + OSM; zila, W + OSSl; melna, W + W; pelēka, C (kontrole). Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp apstrādi un kontroli (divvirzienu ANOVA, kam seko Tukey HSD post hoc daudzkārtēja salīdzināšana, *** P <0,001). Informācijas teorijas analīze (C)697 MS/MS (datu fails S1) JA biosintēzē un traucētā uztveres spektrā (irAOC un irCOI1) un (D)585 MS/MS (datu fails S1) ETR1 ar traucētu ET signālu. Divas simulētas zālēdāju apstrādes izraisīja augu līnijas un tukša nesēja (EV) kontroles augus. Zvaigznītes norāda uz būtiskām atšķirībām starp W+OS apstrādi un nebojātu kontroli (divvirzienu ANOVA, kam seko Tukey HSD post hoc daudzkārtēja salīdzināšana, *P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001). (E) Izkaisīti grafiki, kas attēlo izkliedētu opozīciju specializācijai. Krāsas attēlo dažādas ģenētiski modificētas šķirnes; simboli attēlo dažādas apstrādes metodes: trīsstūris, W + OSS1; taisnstūris, W + OSM; aplis C
Pēc tam mēs izmantojam ģenētiski modificētu novājinātu Nepenthes celmu (irCOI1 un sETR1) JA un ET biosintēzes (irAOC un irACO) un uztveres (irCOI1 un sETR1) galvenajos posmos, lai analizētu šo divu augu hormonu metabolismu zālēdājos. Pārprogrammēšanas relatīvais ieguldījums. Saskaņā ar iepriekšējiem eksperimentiem mēs apstiprinājām zālēdāju-OS indukciju tukšos nesējos (EV) augos (3. attēls, C līdz D) un kopējo Hj indeksa samazināšanos, ko izraisa OSM, savukārt δj indekss palielinājās. Reakcija ir izteiktāka nekā OSS1 izraisītā reakcija. Divu līniju grafiks, kurā Hj un δj ir koordinātas, parāda specifisko deregulāciju (3.E attēls). Visacīmredzamākā tendence ir tāda, ka celmos, kuriem trūkst JA signāla, zālēdāju izraisītās metabolomu daudzveidības un specializācijas izmaiņas ir gandrīz pilnībā novērstas (3.C attēls). Turpretī klusā ET uztvere sETR1 augos, lai gan kopējā ietekme uz zālēdāju metabolisma izmaiņām ir daudz mazāka nekā JA signālu pārraidei, mazina Hj un δj indeksu atšķirību starp OSM un OSS1 ierosinājumiem (3D attēls un S5 attēls). Tas norāda, ka papildus JA signāla pārraides pamatfunkcijai ET signāla pārraide kalpo arī kā zālēdāju sugai specifiskās metabolisma atbildes precizēšana. Saskaņā ar šo precizējošo funkciju sETR1 augos netika novērotas izmaiņas kopējā metabolomu inducējamībā. No otras puses, salīdzinot ar sETR1 augiem, irACO augi izraisīja līdzīgu zālēdāju izraisīto metabolisma izmaiņu kopējo amplitūdu, bet uzrādīja ievērojami atšķirīgus Hj un δj rādītājus starp OSM un OSS1 ierosinājumiem (S5 attēls).
Lai identificētu specializētus metabolītus, kuriem ir nozīmīga loma zālēdāju sugai raksturīgajā reakcijā, un lai precīzi noregulētu to ražošanu, izmantojot ET signālus, mēs izmantojām iepriekš izstrādāto strukturālo MS/MS metodi. Šī metode balstās uz divklasterizēšanas metodi, lai atkārtoti secinātu metabolisma saimi no MS/MS fragmentiem [normalizēts skalārais reizinājums (NDP)] un līdzības rādītāja, pamatojoties uz neitrālo zudumu (NL). MS/MS datu kopa, kas izveidota, analizējot ET transgēnās līnijas, radīja 585 MS/MS (datu fails S1), kas tika sadalīti, grupējot tos septiņos galvenajos MS/MS moduļos (M) (4.A attēls). Daži no šiem moduļiem ir blīvi pildīti ar iepriekš raksturotiem īpašiem metabolītiem: piemēram, M1, M2, M3, M4 un M7 ir bagāti ar dažādiem fenolu atvasinājumiem (M1), flavonoīdu glikozīdiem (M2), acilcukuriem (M3 un M4) un 17-HGL-DTG (M7). Turklāt katrā modulī tiek aprēķināta atsevišķa metabolīta vielmaiņas specifiskā informācija (Si indekss), un tā Si sadalījumu var redzēt intuitīvi. Īsāk sakot, MS/MS spektriem, kas uzrāda augstu zālēdāju un genotipa specifiskumu, raksturīgas augstas Si vērtības, un ekscesa statistika norāda uz kažoka sadalījumu labajā astes stūrī. Viens šāds liesa koloīda sadalījums tika konstatēts M1, kurā fenola amīdam bija visaugstākā Si frakcija (4.B attēls). Iepriekš minētais zālēdāju inducējamais 17-HGL-DTG M7 uzrādīja mērenu Si rādītāju, kas norāda uz mērenu diferenciālās regulācijas pakāpi starp abiem OS veidiem. Turpretī lielākajai daļai konstitutīvi ražoto specializēto metabolītu, piemēram, rutīnam, CGA un acilcukuriem, ir vieni no zemākajiem Si rādītājiem. Lai labāk izpētītu strukturālo sarežģītību un Si sadalījumu starp īpašajiem metabolītiem, katram modulim tika konstruēts molekulārais tīkls (4.B attēls). Svarīga OD teorijas prognoze (apkopota 1.B attēlā) ir tāda, ka īpašo metabolītu reorganizācijai pēc zālēdāju invāzijas vajadzētu izraisīt vienvirziena izmaiņas metabolītos ar augstu aizsardzības vērtību, īpaši palielinot to specifiskumu (atšķirībā no nejauša sadalījuma) (režīms). Aizsardzības metabolīts, ko paredz MT teorija. Lielākā daļa M1 uzkrāto fenolu atvasinājumu ir funkcionāli saistīti ar kukaiņu veiktspējas samazināšanos (32). Salīdzinot Si vērtības M1 metabolītos starp inducētajām lapām un EV kontroles augu lapām 24 stundu laikā, mēs novērojām, ka daudzu metabolītu metabolisma specifiskumam pēc zālēdāju kukaiņiem ir ievērojama pieauguma tendence (4.C attēls). Si vērtības īpatnējais pieaugums tika konstatēts tikai aizsardzības fenolamīdos, bet citos fenolos un nezināmos metabolītos, kas pastāvēja līdzās šajā modulī, Si vērtības pieaugums netika konstatēts. Šis ir specializēts modelis, kas ir saistīts ar OD teoriju. Galvenās zālēdāju izraisīto metabolisma izmaiņu prognozes ir konsekventas. Lai pārbaudītu, vai šo fenola amīdu spektra īpatnību inducēja OS-specifiskais ET, mēs uzzīmējām metabolīta Si indeksu un izraisījām atšķirīgu ekspresijas vērtību starp OSM un OSS1 EV un sETR1 genotipos (4.D attēls). sETR1 genotipos fenola amīdu inducētā atšķirība starp OSM un OSS1 bija ievērojami samazināta. Divklasterizācijas metode tika pielietota arī MS/MS datiem, kas savākti celmos ar nepietiekamu JA, lai secinātu galvenos MS/MS moduļus, kas saistīti ar JA regulēto metabolisma specializāciju (S6. attēls).
(A) 585 MS/MS klasterizācijas rezultāti, kas balstīti uz kopīgu fragmentu (NDP līdzība) un kopīgu neitrālu zudumu (NL līdzība), liecina, ka modulis (M) atbilst zināmajai savienojumu saimei vai nezināmam vai slikti metabolizētam metabolītu sastāvam. Blakus katram modulim ir parādīts metabolīta (MS/MS) specifiskais (Si) sadalījums. (B) Modulārs molekulārais tīkls: Mezgli attēlo MS/MS un malas, NDP (sarkans) un NL (zils) MS/MS rādītājus (robežvērtība > 0,6). Pakāpeniski sadalītais metabolītu specifiskuma indekss (Si), kas iekrāsots, pamatojoties uz moduli (pa kreisi), un kartēts molekulārajam tīklam (pa labi). (C) EV auga M1 modulis konstitutīvā (kontroles) un inducētā stāvoklī (simulēts zālēdājs) pēc 24 stundām: molekulārā tīkla diagramma (Si vērtība ir mezgla lielums, aizsardzības fenolamīds ir iezīmēts zilā krāsā). (D) Spektra līnijas sETR1 M1 molekulārā tīkla diagramma ar traucētu EV un ET uztveri: fenola savienojums, ko attēlo zaļā apļa mezgls, un būtiskā atšķirība (P vērtība) starp W + OSM un W + OSS1 apstrādi kā mezgla izmērs. CP, N-kofeiltirozīns; CS, N-kofeilspermidīns; FP, N-ferulīnskābes esteris-urīnskābe; FS, N-ferulilspermidīns; CoP, N', N"-kumaroliltirozīns; DCS, N', N"-dikafeilspermidīns; CFS, N', N"-kofeils, feruloilspermidīns; Lycium barbarum vilkaču ogas Sonā; Nick. O-AS, O-acilcukurs.
Mēs tālāk paplašinājām analīzi no viena novājināta Nepenthes genotipa uz dabiskajām populācijām, kur iepriekš ir aprakstītas spēcīgas iekšsugas izmaiņas zālēdāju JA līmeņos un specifiskajos metabolītu līmeņos dabiskajās populācijās (26). Izmantojiet šo datu kopu, lai aptvertu 43 dīgļplazmas. Šīs dīgļplazmas sastāv no 123 N. pallens augu sugām. Šie augi tika ņemti no sēklām, kas savāktas dažādās vietējās dzīvotnēs Jūtā, Nevadā, Arizonā un Kalifornijā (S7. attēls), mēs aprēķinājām metabolomu daudzveidību (šeit sauktu par populācijas līmeni (β daudzveidību) un specializāciju, ko izraisa OSM. Saskaņā ar iepriekšējiem pētījumiem mēs novērojām plašu vielmaiņas izmaiņu diapazonu gar Hj un δj asīm, kas norāda, ka dīgļplazmām ir būtiskas atšķirības to vielmaiņas reakciju plastiskumā pret zālēdājiem (S7. attēls). Šī organizācija atgādina iepriekšējos novērojumus par zālēdāju izraisīto JA izmaiņu dinamisko diapazonu un ir saglabājusi ļoti augstu vērtību vienā populācijā (26, 36). Izmantojot JA un JA-Ile, lai pārbaudītu kopējā līmeņa korelāciju starp Hj un δj, mēs atklājām, ka pastāv būtiska pozitīva korelācija starp JA un metaboloma β daudzveidības un specializācijas indeksu (S7. attēls). Tas liecina, ka zālēdāju izraisītā JA indukcijas neviendabība, kas konstatēta populācijas līmenī, var būt saistīta ar galvenajiem metabolisma polimorfismiem, ko izraisa selekcija no kukaiņu zālēdājiem.
Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka tabakas veidi ievērojami atšķiras pēc veida un relatīvās atkarības no inducētajām un konstitutīvajām vielmaiņas aizsardzības spējām. Tiek uzskatīts, ka šīs izmaiņas pret zālēdājiem vērstajā signālu pārraidē un aizsardzības spējās regulē kukaiņu populācijas spiediens, augu dzīves cikls un aizsardzības ražošanas izmaksas nišā, kurā aug konkrētā suga. Mēs pētījām lapu metabolomu pārveidošanās konsekvenci, ko izraisa sešu Ziemeļamerikā un Dienvidamerikā dzimušu Nicotiana sugu zālēdāji. Šīs sugas ir cieši saistītas ar Nepenthes North America, proti, Nicolas Bociflo. La, N. nicotinis, Nicotiana n. attenuated grass, Nicotiana tabacum, lineārā tabaka, tabaka (Nicotiana spegazzinii) un tabakas lapu tabaka (Nicotiana obtusifolia) (5.A attēls) (37). Sešas no šīm sugām, tostarp labi raksturotā suga N. please, ir petūniju klades viengadīgi augi, un obtusifolia N. ir māsas klades Trigonophyllae daudzgadīgie augi (38). Pēc tam šīm septiņām sugām tika veikta W + W , W + OSM un W + OSS1 indukcija, lai pētītu kukaiņu barošanās metabolisma pārkārtošanos sugas līmenī.
(A) Filoģenētiskais koks ar atkārtotu ģenerēšanu, kas balstīts uz maksimālo ticamību [kodola glutamīna sintēzei (38)] un septiņu cieši radniecīgu Nicotiana sugu ģeogrāfisko izplatību (dažādas krāsas) (37). (B) Septiņu Nicotiana sugu metabolisma profilu specializētās daudzveidības izkliedes diagramma (939 MS/MS; datu fails S1). Sugu līmenī metabolomu daudzveidība ir negatīvi korelēta ar specializācijas pakāpi. Sugu līmeņa korelācijas analīze starp metabolisma daudzveidību un specializāciju, kā arī JA uzkrāšanos ir parādīta 2. attēlā. S9. Krāsa, dažādi veidi; trīsstūris, W + OSS1; taisnstūris, W + OSM; (C) Nicotiana JA un JA-Ile dinamika ir sarindota atbilstoši OS ierosmes amplitūdai (divvirzienu ANOVA un Tukey HSD pēc daudzkārtējas salīdzināšanas, * P <0,05, ** P <0,01 un * ** W + OS un W + W salīdzinājumam, P <0,001). Katras sugas (D) daudzveidības un (E) specializācijas lodziņu diagramma pēc zālēdāju un metil JA (MeJA) simulācijas. Zvaigznīte norāda uz būtisku atšķirību starp W + OS un W + W vai lanolīnu plus W (Lan + W) vai Lan plus MeJA (Lan + MeJa) un Lan kontroli (divvirzienu dispersijas analīze, kam sekoja Tukey HSD post hoc daudzkārtēja salīdzināšana, *P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001).
Izmantojot divkāršo klasteru metodi, mēs identificējām 9 moduļus ar 939 MS/MS (datu fails S1). Dažādu apstrādes veidu pārveidoto MS/MS sastāvs starp dažādiem moduļiem starp sugām ievērojami atšķiras (S8. attēls). Vizualizējot Hj (šeit sauktu par sugas līmeņa γ-daudzveidību) un δj, atklājas, ka dažādas sugas vielmaiņas telpā agregējas ļoti dažādās grupās, kur sugu līmeņa dalījums parasti ir izteiktāks nekā ierosināšana. Izņemot N. linear un N. obliquus, tām ir plašs indukcijas efektu dinamiskais diapazons (5.B attēls). Turpretī tādām sugām kā N. purpurea un N. obtusifolia ir mazāk acīmredzama vielmaiņas reakcija uz apstrādi, bet metaboloms ir daudzveidīgāks. Sugai raksturīgais inducētās vielmaiņas reakcijas sadalījums izraisīja būtisku negatīvu korelāciju starp specializāciju un gamma daudzveidību (PCC = -0,46, P = 4,9×10-8). OS izraisītās JA līmeņa izmaiņas ir pozitīvi korelētas ar metaboloma specializāciju un negatīvi korelētas ar katras sugas vielmaiņas gamma daudzveidību (5.B attēls un S9 attēls). Jāatzīmē, ka sugas, kuras 5.C attēlā sarunvalodā dēvē par “signālatbildes” sugām, piemēram, Nepenthes nematodes, Nepenthes nepenthes, Nepenthes acute un Nepenthes attenuated, izraisīja ievērojamas pazīmes 30 minūtēs. Nesenie OS specifiskie JA un JA-Ile uzliesmojumi, savukārt citas baktērijas, ko sauc par “signālam nereaģējošām”, piemēram, Nepenthes mills, Nepenthes powdery un N. obtusifolia, uzrāda tikai JA-Ile Edge indukciju bez jebkādas OS specifiskuma (5.C attēls). Metabolisma līmenī, kā minēts iepriekš, novājinātām Nepenthes signālam reaģējošās vielas uzrādīja OS specifiskumu un ievērojami palielināja δj, vienlaikus samazinot Hj. Šis OS specifiskais ierosināšanas efekts netika konstatēts sugām, kas klasificētas kā signālam nereaģējošas sugas (5. attēls, D un E). OS specifiskie metabolīti biežāk tiek kopīgoti starp signālam reaģējošām sugām, un šie signālu klasteri grupējas ar sugām ar vājākām signāla atbildēm, savukārt sugas ar vājākām signāla atbildēm uzrāda mazāku savstarpējo atkarību (S8 attēls). Šis rezultāts norāda, ka OS specifiskā JA indukcija un OS specifiskā lejupējā metabolīta pārkonfigurācija ir saistītas sugu līmenī.
Pēc tam mēs izmantojām lanolīna pastu, kas satur metil-JA (MeJA), lai apstrādātu augus, lai izpētītu, vai šos savienošanās veidus ierobežo JA pieejamība, ko pielieto eksogēnais JA, kas atradīsies augu citoplazmā. Ātra deesterifikācija ir JA. Mēs atklājām tādu pašu tendenci pakāpeniskām pārmaiņām no signālreaģējošām sugām uz signālnereaģējošām sugām, ko izraisa nepārtraukta JA piegāde (5. attēls, D un E). Īsāk sakot, MeJA apstrāde spēcīgi pārprogrammēja lineāro nematodu, N. obliquus, N. aquaticus, N. pallens un N. mikimotoi, metabolītus, kā rezultātā ievērojami palielinājās δj un samazinājās Hj. N. purpurea uzrādīja tikai δj pieaugumu, bet ne Hj. N. obtusifolia, kurai iepriekš ir pierādīts, ka tā uzkrāj ārkārtīgi zemu JA līmeni, arī vāji reaģē uz MeJA apstrādi metabolomu rekonfigurācijas ziņā. Šie rezultāti liecina, ka JA ražošana vai signāla transdukcija ir fizioloģiski ierobežota signālnereaģējošām sugām. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, mēs pētījām četras sugas (N. pallens, N. mills, N. pink un N. microphylla), ko inducēja W + W, W + OSM un W + OSS1 transkriptoms (39). Atbilstoši metabolomu remodelācijas modelim, sugas ir labi atdalītas transkriptoma telpā, starp kurām N. attenuated uzrādīja visaugstāko OS inducēto RDPI, savukārt N. gracilis bija viszemākais (6.A attēls). Tomēr tika konstatēts, ka N. oblonga inducētā transkriptoma daudzveidība bija viszemākā starp četrām sugām, pretēji N. oblonga augstākajai metabonomiskajai daudzveidībai, kas iepriekš tika novērota septiņās sugās. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka gēnu kopums, kas saistīts ar agrīnajiem aizsardzības signāliem, tostarp JA signāliem, izskaidro zālēdājiem saistītu elicitoru izraisīto agrīno aizsardzības reakciju specifiku Nicotiana sugās (39). Salīdzinot JA signālceļus starp šīm četrām sugām, atklājās interesants modelis (6.B attēls). Lielākā daļa šī ceļa gēnu, piemēram, AOC, OPR3, ACX un COI1, šajās četrās sugās uzrādīja relatīvi augstu indukcijas līmeni. Tomēr galvenais gēns JAR4 pārveido JA par tā bioloģiski aktīvo JA-Ile uzkrāto transkriptu formu, un tā transkripcijas līmenis ir ļoti zems, īpaši N. mills, Nepenthes pieris un N. microphylla. Turklāt N. bifidum netika konstatēts tikai cita gēna AOS transkripts. Šīs gēnu ekspresijas izmaiņas var būt atbildīgas par ekstremālajiem fenotipiem, ko izraisa zemā JA produkcija signālerģiskās sugās un N. gracilis indukcija.
(A) Informācijas teorijas analīze par četru cieši radniecīgu tabakas sugu agrīno transkripcijas reakciju pārprogrammēšanu, kas ņemtas 30 minūtes pēc zālēdāju indukcijas. RDPI tiek aprēķināts, salīdzinot ar zālēdāju OS inducētās lapas ar brūču kontroles lapām. Krāsas norāda dažādas sugas, un simboli norāda dažādas apstrādes metodes. (B) Gēnu ekspresijas analīze JA signālceļos starp četrām sugām. Vienkāršotais JA ceļš ir parādīts blakus lodziņu diagrammai. Dažādas krāsas norāda dažādas apstrādes metodes. Zvaigznīte norāda, ka pastāv būtiska atšķirība starp W + OS apstrādi un W + W kontroli (Stjūdenta t-testam pāru atšķirībām, *P<0,05, **P<0,01 un ***P<0,001). OPDA, 12-oksofitodienskābe; OPC-8: 0,3-okso-2(2′(Z)-pentenil)-ciklopentāna-1-oktānskābe.
Pēdējā daļā mēs pētījām, kā dažādu augu sugu metaboloma kukaiņu sugai raksturīgā pārveidošanās var būt rezistenta pret zālēdājiem. Iepriekšējie pētījumi uzsvēra Nicotiana ģinti. To rezistence pret Ms un kāpuriem ievērojami atšķiras (40). Šeit mēs pētījām saistību starp šo modeli un to metabolisma plastiskumu. Izmantojot iepriekš minētās četras tabakas sugas un pārbaudot korelāciju starp zālēdāju izraisīto metaboloma daudzveidību un specializāciju un augu rezistenci pret Ms un Sl, mēs atklājām, ka rezistence, daudzveidība un specializācija pret ģeneralistu Sl All ir pozitīvi korelētas, savukārt korelācija starp rezistenci pret ekspertu dāmām un specializāciju ir vāja, un korelācija ar daudzveidību nav nozīmīga (S10. attēls). Attiecībā uz S1 rezistenci gan novājinātajai N. chinensis, gan N. gracilis, kurām iepriekš tika pierādīts gan JA signāla transdukcijas līmenis, gan metaboloma plastiskums, bija ļoti atšķirīga reakcija uz zālēdāju indukciju, un tām bija arī līdzīga augsta rezistence. Dzimums.
Pēdējo sešdesmit gadu laikā augu aizsardzības teorija ir nodrošinājusi teorētisku ietvaru, uz kura pamata pētnieki ir prognozējuši ievērojamu skaitu augu specializēto metabolītu evolūcijas un funkciju. Lielākā daļa šo teoriju neievēro parasto spēcīgo secinājumu procedūru (41). Tās piedāvā galvenās prognozes (3) vienā un tajā pašā analīzes līmenī. Kad galveno prognožu pārbaude ļauj analizēt konkrētas teorijas, tas liks Joma virzās uz priekšu. Tiks atbalstīta, bet citas tiks noraidītas (42). Tā vietā jaunā teorija sniedz prognozes dažādos analīzes līmeņos un pievieno jaunu aprakstošu apsvērumu slāni (42). Tomēr divas funkcionālā līmenī piedāvātās teorijas, MT un OD, var viegli izskaidrot kā svarīgas zālēdāju izraisītu specializētu vielmaiņas izmaiņu prognozes: OD teorija uzskata, ka izmaiņas specializētajā vielmaiņas "telpā" ir ļoti virzītas. MT teorija uzskata, ka šīs izmaiņas būs bezvirziena un nejauši izvietotas vielmaiņas telpā, un tām parasti ir augstas aizsardzības vērtības metabolīti. Iepriekšējās OD un MT prognožu pārbaudes ir pārbaudītas, izmantojot šauru a priori "aizsardzības" savienojumu kopu. Šie uz metabolītiem orientētie testi neļauj analizēt metabolomu rekonfigurācijas apmēru un trajektoriju zālēdāju dzīves laikā un neļauj testēšanai konsekventā statistikas sistēmā pieprasīt galvenās prognozes, kuras var uzskatīt par vienotu veselumu. Kvantitatīvi noteikt izmaiņas augu metabolomā. Šeit mēs izmantojām inovatīvu metabolomikas tehnoloģiju, kuras pamatā ir skaitļošanas MS, un veicām dekonvolūcijas MS analīzi informācijas teorijas deskriptoru vispārējā valūtā, lai pārbaudītu atšķirību starp abiem ierosinātajiem globālā metabolomikas līmenī. Šīs teorijas galvenā prognoze. Informācijas teorija ir pielietota daudzās jomās, īpaši bioloģiskās daudzveidības un barības vielu plūsmas pētījumu kontekstā (43). Tomēr, cik mums zināms, šis ir pirmais pielietojums, kas izmantots, lai aprakstītu augu vielmaiņas informācijas telpu un risinātu ekoloģiskas problēmas, kas saistītas ar īslaicīgām vielmaiņas izmaiņām, reaģējot uz vides norādēm. Jo īpaši šīs metodes spēja slēpjas tās spējā salīdzināt modeļus augu sugu ietvaros un starp tām, lai pārbaudītu, kā zālēdāji ir attīstījušies no dažādām sugām līdz starpsugu makroevolūcijas modeļiem dažādos evolūcijas līmeņos. Metabolisms.
Galveno komponentu analīze (PCA) pārveido daudzfaktoru datu kopu dimensiju samazināšanas telpā, lai varētu izskaidrot datu galveno tendenci, tāpēc to parasti izmanto kā izpētes metodi datu kopas parsēšanai, piemēram, dekonvolūcijas metabolomu. Tomēr dimensiju samazināšana zaudēs daļu informācijas satura datu kopā, un PCA nevar sniegt kvantitatīvu informāciju par īpašībām, kas ir īpaši būtiskas ekoloģiskajai teorijai, piemēram: kā zālēdāji pārveido daudzveidību specializētās jomās (piemēram, bagātība, izplatība un pārpilnība) metabolītos? Kuri metabolīti ir dotā zālēdāja inducētā stāvokļa prognozētāji? No specifiskuma, daudzveidības un inducējamības viedokļa lapu specifiskā metabolītu profila informācijas saturs tiek sadalīts, un tiek konstatēts, ka zālēdāju ēšana var aktivizēt specifisku metabolismu. Negaidīti mēs novērojām, ka, kā aprakstīts ieviestajos informācijas teorijas indikatoros, iegūtajai metabolisma situācijai ir liela pārklāšanās pēc abu zālēdāju (nakts barotā ģenerālista Sl) un Solanaceae ekspertes Ms. uzbrukumiem. Lai gan to barošanās uzvedība un koncentrācija ievērojami atšķiras. Taukskābju-aminoskābju konjugāta (FAC) ierosinātājs OS (31). Izmantojot zālēdāju OS standartizētu dūrienu brūču ārstēšanai, simulēta zālēdāju ārstēšana arī uzrādīja līdzīgu tendenci. Šī standartizētā procedūra augu reakcijas simulēšanai uz zālēdāju uzbrukumiem novērš traucējošos faktorus, ko izraisa izmaiņas zālēdāju ēšanas paradumos, kas dažādos laikos noved pie dažādas pakāpes bojājumiem (34). FAC, kas ir zināms kā galvenais OSM cēlonis, samazina JAS un citu augu hormonu reakcijas OSS1, savukārt OSS1 samazina simtiem reižu (31). Tomēr OSS1 izraisīja līdzīgu JA uzkrāšanās līmeni salīdzinājumā ar OSM. Iepriekš ir pierādīts, ka JA reakcija novājinātās Nepenthes ir ļoti jutīga pret OSM, kur FAC var saglabāt savu aktivitāti pat tad, ja tas ir atšķaidīts ar ūdeni proporcijā 1:1000 (44). Tāpēc, salīdzinot ar OSM, lai gan FAC OSS1 ir ļoti zems, tas ir pietiekams, lai izraisītu pietiekamu JA uzliesmojumu. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka porīniem līdzīgie proteīni (45) un oligosaharīdi (46) var tikt izmantoti kā molekulāri pavedieni, lai ierosinātu augu aizsardzības reakcijas OSS1. Tomēr joprojām nav skaidrs, vai šie elicitori OSS1 ir atbildīgi par JA uzkrāšanos, kas novērota pašreizējā pētījumā.
Lai gan ir maz pētījumu, kas apraksta diferenciālos vielmaiņas pirkstu nospiedumus, ko izraisa dažādu zālēdāju vai eksogēnu JA vai SA (salicilskābes) lietošana (47), neviens nav pētījis zālēdāju sugai raksturīgo perturbāciju augu un zāļu tīklā un tās ietekmi uz konkrēto personisko informāciju. Metabolisma kopējā ietekme tiek sistemātiski pētīta. Šī analīze vēl vairāk apstiprināja, ka iekšējā hormonu tīkla saistība ar citiem augu hormoniem, kas nav JA, veido zālēdāju izraisītās vielmaiņas reorganizācijas specifiku. Jo īpaši mēs atklājām, ka OSM izraisītais ET bija ievērojami lielāks nekā OSS1 izraisītais. Šis režīms atbilst lielākam FAC saturam OSM, kas ir nepieciešams un pietiekams nosacījums ET uzliesmojuma izraisīšanai (48). Mijiedarbības kontekstā starp augiem un zālēdājiem ET signalizācijas funkcija uz augiem raksturīgo metabolītu dinamiku joprojām ir sporādiska un vērsta tikai uz vienu savienojumu grupu. Turklāt lielākajā daļā pētījumu ir izmantota ET vai tā prekursoru vai dažādu inhibitoru eksogēna lietošana, lai pētītu ET regulāciju, starp kurām šīs eksogēnā ķīmiskā lietošana radīs daudzas nespecifiskas blakusparādības. Mūsuprāt, šis pētījums ir pirmais plaša mēroga sistemātisks ET lomas pētījums ET izmantošanā, lai radītu un uztvertu traucētus transgēnus augus, lai koordinētu augu metabolomu dinamiku. Zālēdājiem specifiska ET indukcija galu galā var modulēt metabolomu reakciju. Visnozīmīgākā ir ET biosintēzes (ACO) un uztveres (ETR1) gēnu transgēnā manipulācija, kas atklāja zālēdājiem specifisku fenolamīdu uzkrāšanos de novo. Iepriekš ir pierādīts, ka ET var precīzi noregulēt JA izraisīto nikotīna uzkrāšanos, regulējot putrescīna N-metiltransferāzi (49). Tomēr no mehāniskā viedokļa nav skaidrs, kā ET precīzi noregulē fenolamīda indukciju. Papildus ET signāla pārraides funkcijai vielmaiņas plūsmu var arī novirzīt uz S-adenozil-1-metionīnu, lai regulētu ieguldījumu poliaminofenola amīdos. S-adenozil-1-metionīns ir ET un kopīgs poliamīnu biosintēzes ceļa starpprodukts. Mehānisms, ar kuru ET signāls regulē fenolamīda līmeni, ir jāturpina pētīt.
Ilgu laiku, ņemot vērā lielo skaitu īpašu metabolītu ar nezināmu struktūru, intensīvā uzmanība specifiskām vielmaiņas kategorijām nav spējusi stingri novērtēt vielmaiņas daudzveidības izmaiņas laikā pēc bioloģiskās mijiedarbības. Pašlaik, pamatojoties uz informācijas teorijas analīzi, MS/MS spektra iegūšanas galvenais rezultāts, pamatojoties uz objektīviem metabolītiem, ir tāds, ka zālēdāji, kas ēd zālēdājus vai imitē tos, turpina samazināt lapas metabolīta kopējo vielmaiņas daudzveidību, vienlaikus palielinot tā specializācijas pakāpi. Šis zālēdāju izraisītais īslaicīgais metabolīta specifiskuma pieaugums ir saistīts ar transkripta specifiskuma sinerģisku pieaugumu. Pazīme, kas visvairāk veicina šo lielāko metabolīta specializāciju (ar augstāku Si vērtību), ir īpašais metabolīts ar iepriekš raksturoto zālēdāja funkciju. Šis modelis atbilst OD teorijas prognozei, bet MT prognoze, kas saistīta ar metabolīta pārprogrammēšanas nejaušību, nav konsekventa. Tomēr šie dati atbilst arī jauktā modeļa prognozei (labākais MT; 1.B attēls), jo citi neraksturīgi metabolīti ar nezināmām aizsardzības funkcijām joprojām var sekot nejaušam Si sadalījumam.
Ievērības cienīgs modelis, ko vēl vairāk atklāj šis pētījums, ir tas, ka no mikroevolūcijas līmeņa (atsevišķa auga un tabakas populācija) līdz plašākam evolūcijas mērogam (cieši radniecīgas tabakas sugas) dažādi evolūcijas organizācijas līmeņi ir “vislabākajā aizsardzībā”. Zālēdāju spējās ir ievērojamas atšķirības. Mūrs un līdzautori (20) un Keslers un Kalske (1) neatkarīgi ierosināja pārveidot trīs sākotnēji Vitakera (50) izdalītos bioloģiskās daudzveidības funkcionālos līmeņus par ķīmiskās daudzveidības konstitutīvajām un inducētajām laika izmaiņām; šie autori neapkopoja ne vienu, ne otru. Liela mēroga metabolomu datu vākšanas procedūras arī neieskicē, kā aprēķināt vielmaiņas daudzveidību no šiem datiem. Šajā pētījumā nelielas Vitakera funkcionālās klasifikācijas korekcijas ņems vērā α-metabolisma daudzveidību kā MS/MS spektru daudzveidību noteiktā augā un β-metabolisma daudzveidību kā populāciju grupas pamata iekšsugas metabolismu, un γ-metabolisma daudzveidība būs līdzīgu sugu analīzes paplašinājums.
JA signāls ir būtisks plašam zālēdāju metabolisma reakciju klāstam. Tomēr trūkst stingru kvantitatīvu testu par JA biosintēzes intrasugas regulācijas ieguldījumu metabolomu daudzveidībā, un joprojām nav skaidrs, vai JA signāls ir vispārēja stresa izraisītas metabolisma diversifikācijas vieta augstākā makroevolūcijas mērogā. Mēs novērojām, ka Nepenthes zālēdāju zālēdāju daba izraisa metabolomu specializāciju, un metabolomu specializācijas variācijas Nicotiana sugu populācijā un starp cieši radniecīgām Nicotiana sugām sistemātiski pozitīvi korelē ar JA signalizāciju. Turklāt, ja JA signāls ir traucēts, viena genotipa zālēdāja inducētā metabolisma specifika tiks atcelta (3. attēls, C un E). Tā kā dabiski novājināto Nepenthes populāciju metabolisma spektra izmaiņas lielākoties ir kvantitatīvas, metabolisma β daudzveidības un specifiskuma izmaiņas šajā analīzē lielā mērā var būt saistītas ar spēcīgu metabolītiem bagātu savienojumu kategoriju ierosmi. Šīs savienojumu klases dominē daļā metabolomu profila un rada pozitīvu korelāciju ar JA signāliem.
Tā kā cieši radniecīgo tabakas sugu bioķīmiskie mehānismi ir ļoti atšķirīgi, metabolīti tiek specifiski identificēti kvalitatīvajā aspektā, tāpēc tas ir analītiskāks. Informācijas teorijas apstrādātais metabolisma profils atklāj, ka zālēdāju indukcija saasina kompromisu starp metabolisma gamma daudzveidību un specializāciju. JA signālam ir centrāla loma šajā kompromisā. Metabolomu specializācijas pieaugums atbilst galvenajai OD prognozei un ir pozitīvi korelēts ar JA signālu, savukārt JA signāls ir negatīvi korelēts ar metabolisma gamma daudzveidību. Šie modeļi norāda, ka augu OD kapacitāti galvenokārt nosaka JA plastiskums, neatkarīgi no tā, vai tas notiek mikroevolūcijas mērogā vai plašākā evolūcijas mērogā. Eksogēni JA pielietošanas eksperimenti, kas apiet JA biosintēzes defektus, vēl vairāk atklāj, ka cieši radniecīgas tabakas sugas var atšķirt signālreaģējošās un signālnereaģējošās sugās, tāpat kā to JA veids un metabolomu plastiskums, ko inducē zālēdāji. Signālnereaģējošās sugas nevar reaģēt, jo tās nespēj ražot endogēnu JA, un tāpēc tām ir fizioloģiski ierobežojumi. To var izraisīt mutācijas dažos galvenajos gēnos JA signālceļā (AOS un JAR4 N. crescens). Šis rezultāts uzsver, ka šos starpsugu makroevolūcijas modeļus galvenokārt var noteikt izmaiņas iekšējo hormonu uztverē un reaģētspējā.
Papildus mijiedarbībai starp augiem un zālēdājiem, vielmaiņas daudzveidības izpēte ir saistīta ar visiem svarīgākajiem teorētiskajiem sasniegumiem bioloģiskās adaptācijas videi un sarežģītu fenotipisko īpašību evolūcijas pētījumos. Pieaugot datu apjomam, ko iegūst ar mūsdienu MS instrumentiem, hipotēžu pārbaude par vielmaiņas daudzveidību tagad var pārsniegt individuālās/kategorijas metabolītu atšķirības un veikt globālu analīzi, lai atklātu negaidītus modeļus. Liela mēroga analīzes procesā svarīga metafora ir ideja par jēgpilnu karšu izveidi, kuras var izmantot datu izpētei. Tāpēc svarīgs pašreizējās objektīvās MS/MS metabolomikas un informācijas teorijas kombinācijas rezultāts ir tas, ka tā nodrošina vienkāršu metriku, ko var izmantot karšu veidošanai, lai pārlūkotu vielmaiņas daudzveidību dažādos taksonomiskos mērogos. Tā ir šīs metodes pamatprasība. Mikro/makro evolūcijas un kopienu ekoloģijas izpēte.
Makroevolūcijas līmenī Ērliha un Ravena (51) augu un kukaiņu koevolūcijas teorijas pamatā ir paredzējums, ka starpsugu vielmaiņas daudzveidības variācijas ir augu līniju dažādošanas cēlonis. Tomēr piecdesmit gadu laikā kopš šī fundamentālā darba publicēšanas šī hipotēze ir reti pārbaudīta (52). Tas lielā mērā ir saistīts ar salīdzināmu vielmaiņas īpašību filoģenētiskajām īpašībām tālsatiksmes augu līnijās. Šo retumu var izmantot, lai nostiprinātu mērķa analīzes metodes. Pašreizējā MS/MS darbplūsma, ko apstrādā informācijas teorija, kvantificē nezināmu metabolītu MS/MS strukturālo līdzību (bez iepriekšējas metabolītu atlases) un pārveido šīs MS/MS par MS/MS kopu, tādējādi profesionālā metabolismā Šie makroevolūcijas modeļi tiek salīdzināti klasifikācijas skalā. Vienkārši statistikas rādītāji. Process ir līdzīgs filoģenētiskajai analīzei, kurā var izmantot secības saskaņošanu, lai kvantificētu dažādošanas vai rakstura evolūcijas ātrumu bez iepriekšējas prognozēšanas.
Bioķīmiskā līmenī Firna un Džounsa (53) skrīninga hipotēze liecina, ka vielmaiņas daudzveidība tiek uzturēta dažādos līmeņos, lai nodrošinātu izejvielas iepriekš nesaistītu vai aizvietotu metabolītu bioloģiskās aktivitātes īstenošanai. Informācijas teorijas metodes nodrošina sistēmu, kurā šīs metabolītiem raksturīgās evolūcijas pārejas, kas notiek metabolītu specializācijas laikā, var kvantitatīvi noteikt kā daļu no ierosinātā evolūcijas skrīninga procesa: bioloģiski aktīva adaptācija no zemas specifiskuma līdz augstai specifiskumam. Dotās vides inhibētie metabolīti.
Kopumā molekulārās bioloģijas pirmsākumos tika izstrādātas nozīmīgas augu aizsardzības teorijas, un deduktīvās hipotēžu vadītās metodes tiek plaši uzskatītas par vienīgo zinātniskā progresa līdzekli. Tas lielā mērā ir saistīts ar visa metaboloma mērīšanas tehniskajiem ierobežojumiem. Lai gan hipotēžu vadītās metodes ir īpaši noderīgas citu cēloņsakarību mehānismu izvēlē, to spēja uzlabot mūsu izpratni par bioķīmiskajiem tīkliem ir ierobežotāka nekā skaitļošanas metodes, kas pašlaik ir pieejamas mūsdienu datu ietilpīgajā zinātnē. Tāpēc teorijas, kuras nevar paredzēt, ir tālu ārpus pieejamo datu apjoma, tāpēc hipotētisko formulas/testa ciklu progresam pētniecības jomā nevar atcelt (4). Mēs paredzam, ka šeit ieviestā metabolomikas skaitļošanas darbplūsma var atdzīvināt interesi par nesenajiem (kā) un galīgajiem (kāpēc) vielmaiņas daudzveidības jautājumiem un dot ieguldījumu jaunā teorētiski vadītas datu zinātnes laikmetā. Šis laikmets atkārtoti pārskatīja svarīgās teorijas, kas iedvesmoja iepriekšējās paaudzes.
Tieša zālēdāju barošana tiek veikta, izaudzējot otrās stadijas kāpuru jeb Sl kāpuru uz vienas gaišas krāsas krūkauga lapas uz viena rozes ziedoša auga, veicot 10 auga atkārtojumus uz katra auga. Kukaiņu kāpuri tika saspiesti ar skavām, un atlikušie lapu audi tika savākti 24 un 72 stundas pēc inficēšanas un ātri sasaldēti, un metabolīti tika ekstrahēti.
Simulēt zālēdāju apstrādi ļoti sinhronizētā veidā. Metode ir tāda, ka auduma rakstu ripu izmantošana auduma vainaga augšanas stadijā katrā auga trīs pilnībā izpletušos lapu vidusdaļas pusē caurdur trīs ērkšķu rindas un nekavējoties uzklāt 1:5 atšķaidītu Ms. Vai arī ar cimdotiem pirkstiem ievietot S1 OS caurduršanas brūcē. Novākt un apstrādāt lapu, kā aprakstīts iepriekš. Izmantojiet iepriekš aprakstīto metodi, lai iegūtu primāros metabolītus un augu hormonus (54).
Eksogēnas JA lietošanas gadījumā katras sugas sešu rožu ziedu trīs lapu kātiņus apstrādā ar 20 μl lanolīna pastas, kas satur 150 μg MeJA (Lan + MeJA), un 20 μl lanolīna plus brūču apstrādes līdzekļa (Lan + W) vai izmanto 20 μl tīra lanolīna kā kontroles līdzekli. Lapas tika novāktas 72 stundas pēc apstrādes, ātri sasaldētas šķidrā slāpeklī un uzglabātas -80 °C temperatūrā līdz lietošanai.
Mūsu pētniecības grupā ir identificētas četras JA un ET transgēnās līnijas, proti, irAOC (36), irCOI1 (55), irACO un sETR1 (48). irAOC uzrādīja izteiktu JA un JA-Ile līmeņa samazināšanos, savukārt irCOI1 nebija jutīgs pret JA. Salīdzinot ar EV, JA-Ile uzkrāšanās palielinājās. Līdzīgi irACO samazinās ET ražošanu, un, salīdzinot ar EV, sETR1, kas ir nejutīgs pret ET, palielinās ET ražošanu.
ET mērījumus neinvazīvi veic, izmantojot fotoakustisko lāzera spektrometru (Sensor Sense ETD-300 reāllaika ET sensors). Tūlīt pēc apstrādes puse lapu tika nogrieztas un pārvietotas uz 4 ml noslēgtu stikla flakonu, un brīvajai telpai ļāva uzkrāties 5 stundu laikā. Mērījuma laikā katrs flakons 8 minūtes tika skalots ar 2 litru/stundā tīra gaisa plūsmu, kas iepriekš bija izplūdusi caur Sensor Sense nodrošinātu katalizatoru, lai atdalītu CO2 un ūdeni.
Mikročipu dati sākotnēji tika publicēti (35) un saglabāti Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) gēnu ekspresijas visaptverošajā datubāzē (piekļuves numurs GSE30287). Šajā pētījumā tika iegūti dati par lapām, ko izraisījusi apstrāde ar W + OSM, un nebojāto kontroli. Neapstrādātā intensitāte ir log2. Pirms statistiskās analīzes bāzes līnija tika konvertēta un normalizēta līdz tās 75. procentīlei, izmantojot R programmatūras pakotni.
Sākotnējie Nicotiana sugu RNS sekvencēšanas (RNS sekvencēšanas) dati tika iegūti no NCBI īsās lasīšanas arhīva (SRA), projekta numurs ir PRJNA301787, par ko ziņoja Džou et al. (39), un turpinājums tika veikts, kā aprakstīts (56). Šajā pētījumā analīzei tika atlasīti neapstrādāti dati, ko apstrādāja W + W, W + OSM un W + OSS1 un kas atbilst Nicotiana sugām, un apstrādāti šādi: vispirms neapstrādātie RNS sekvencēšanas nolasījumi tika konvertēti FASTQ formātā. HISAT2 konvertē FASTQ uz SAM, un SAMtools konvertē SAM failus sakārtotos BAM failos. StringTie tiek izmantots gēnu ekspresijas aprēķināšanai, un tā ekspresijas metode ir tāda, ka ir fragmenti uz tūkstoš bāzes fragmentiem uz miljonu sekvencētu transkripcijas fragmentu.
Analīzē izmantotā Acclaim hromatogrāfijas kolonna (150 mm x 2,1 mm; daļiņu izmērs 2,2 μm) un 4 mm x 4 mm aizsargkolonna sastāv no viena un tā paša materiāla. Dionex UltiMate 3000 īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfijas (UHPLC) sistēmā tiek izmantots šāds binārais gradients: 0 līdz 0,5 minūtes, izokrātisks 90% A [dejonizēts ūdens, 0,1% (v/v) acetonitrils un 0,05% skudrskābe], 10% B (acetonitrils un 0,05% skudrskābe); 0,5 līdz 23,5 minūtes, gradienta fāze ir attiecīgi 10% A un 90% B; 23,5 līdz 25 minūtes, izokrātisks 10% A un 90% B. Plūsmas ātrums ir 400 μl/min. Visām MS analīzēm kolonnas eluentu ievada kvadrupola un lidojuma laika (qTOF) analizatorā, kas aprīkots ar elektroizsmidzināšanas avotu, kas darbojas pozitīvās jonizācijas režīmā (kapilārais spriegums, 4500 V; kapilāra izeja 130 V; žāvēšanas temperatūra 200°C; žāvēšanas gaisa plūsma 10 litri/min).
Veiciet MS/MS fragmentu analīzi (turpmāk tekstā — MS/MS), kas nav būtiska vai nav atšķirama no datiem, lai iegūtu strukturālu informāciju par kopējo nosakāmo metabolisma profilu. Nediferenciālās MS/MS metodes koncepcija balstās uz faktu, ka kvadrupolam ir ļoti liels masas izolācijas logs [tāpēc visus masas un lādiņa attiecības (m/z) signālus uzskata par fragmentiem]. Šī iemesla dēļ, tā kā Impact II instruments nespēja radīt CE slīpumu, tika veiktas vairākas neatkarīgas analīzes, izmantojot palielinātas sadursmes izraisītas disociācijas sadursmes enerģijas (CE) vērtības. Īsāk sakot, vispirms analizējiet paraugu ar UHPLC-elektrosmidzināšanas jonizāciju/qTOF-MS, izmantojot vienas masas spektrometrijas režīmu (zemas fragmentācijas apstākļi, ko rada fragmentācija avotā), skenējot no m/z 50 līdz 1500 ar atkārtošanās frekvenci 5 Hz. Izmantojiet slāpekli kā sadursmes gāzi MS/MS analīzei un veiciet neatkarīgus mērījumus ar šādiem četriem dažādiem sadursmes izraisītiem disociācijas spriegumiem: 20, 30, 40 un 50 eV. Visā mērīšanas procesā kvadrupolam ir lielākais masas izolācijas logs, no m/z 50 līdz 1500. Kad priekšējā ķermeņa m/z un izolācijas platuma eksperiments ir iestatīts uz 200, masas diapazonu automātiski aktivizē instrumenta operētājsistēmas programmatūra un 0 Da. Masas fragmentus skenējiet tāpat kā vienas masas režīmā. Masas kalibrēšanai izmantojiet nātrija formiātu (50 ml izopropanola, 200 μl skudrskābes un 1 ml 1M NaOH ūdens šķīduma). Izmantojot Bruker augstas precizitātes kalibrēšanas algoritmu, datu fails tiek kalibrēts pēc vidējā spektra aprēķināšanas noteiktā laika periodā. Izmantojiet Data Analysis v4.0 programmatūras (Brook Dalton, Brēmene, Vācija) eksporta funkciju, lai konvertētu neapstrādātus datu failus NetCDF formātā. MS/MS datu kopa ir saglabāta atvērtajā metabolomikas datubāzē MetaboLights (www.ebi.ac.uk) ar piekļuves numuru MTBLS1471.
MS/MS montāžu var realizēt, izmantojot korelācijas analīzi starp MS1 un MS/MS kvalitātes signāliem zemai un augstai sadursmju enerģijai un jaunieviestiem noteikumiem. R skripts tiek izmantots, lai realizētu prekursora sadalījuma korelācijas analīzi produktam, un C# skripts (https://github.com/MPI-DL/indiscriminant-MS-MS-assembly-pipeline) tiek izmantots noteikumu ieviešanai.
Lai samazinātu fona trokšņa un noteiktu m/z pazīmju noteikšanas tikai dažos paraugos izraisītās kļūdaini pozitīvās kļūdas, mēs izmantojam R pakotnes XCMS (fona trokšņa korekcijai) funkciju “aizpildītais pīķis”. Tā jāizmanto, lai aizstātu “NA” (nenotektā pīķa) intensitāti. Izmantojot aizpildījuma pīķa funkciju, datu kopā joprojām ir daudz “0” intensitātes vērtību, kas ietekmēs korelācijas aprēķinu. Pēc tam mēs salīdzinām datu apstrādes rezultātus, kas iegūti, izmantojot aizpildītā pīķa funkciju, un tos, kad aizpildītā pīķa funkcija netiek izmantota, un aprēķinām fona trokšņa vērtību, pamatojoties uz vidējo koriģēto novērtēto vērtību, un pēc tam šīs 0 intensitātes vērtības aizstājam ar aprēķināto fona vērtību. Mēs arī ņēmām vērā tikai tās pazīmes, kuru intensitāte trīs reizes pārsniedza fona vērtību, un uzskatījām tās par “īstajiem pīķiem”. PCC aprēķiniem tiek ņemti vērā tikai parauga prekursora (MS1) m/z signāli un fragmentu datu kopas ar vismaz astoņiem patiesiem pīķiem.
Ja prekursora kvalitātes pazīmes intensitāte visā paraugā ir būtiski korelēta ar tās pašas kvalitātes pazīmes samazināto intensitāti, kas pakļauta zemai vai augstai sadursmes enerģijai, un CAMERA šo pazīmi nav apzīmējusi kā izotopu pīķi, to var sīkāk definēt. Pēc tam, aprēķinot visus iespējamos prekursora-produkta pārus 3 s robežās (aprēķinātais pīķa saglabāšanas laika logs), tiek veikta korelācijas analīze. Tikai tad, ja m/z vērtība ir zemāka par prekursora vērtību un MS/MS fragmentācija notiek tajā pašā parauga vietā datu kopā, kur notiek prekursors, no kura tas ir iegūts, tas tiek uzskatīts par fragmentu.
Pamatojoties uz šiem diviem vienkāršajiem noteikumiem, mēs izslēdzam norādītos fragmentus ar m/z vērtībām, kas ir lielākas par identificētā prekursora m/z, un pamatojoties uz parauga pozīciju, kur parādās prekursors, un norādīto fragmentu. Ir iespējams arī atlasīt daudzu MS1 režīmā ģenerētu avota fragmentu ģenerētās kvalitātes pazīmes kā kandidātu prekursorus, tādējādi ģenerējot liekus MS/MS savienojumus. Lai samazinātu šo datu redundanci, ja spektru NDP līdzība pārsniedz 0,6 un tie pieder hromatogrammai “pcgroup”, ko anotējusi CAMERA, mēs tos apvienosim. Visbeidzot, mēs apvienojam visus četrus ar prekursoru un fragmentiem saistītos CE rezultātus galīgajā dekonvolucionētajā saliktajā spektrā, izvēloties augstākās intensitātes pīķi starp visiem kandidātu pīķiem ar vienādu m/z vērtību pie dažādām sadursmes enerģijām. Turpmākie apstrādes soļi ir balstīti uz saliktā spektra koncepciju un ņem vērā dažādos CE apstākļus, kas nepieciešami, lai palielinātu fragmentācijas varbūtību, jo dažus fragmentus var noteikt tikai ar noteiktu sadursmes enerģiju.
Metabolisma profila inducējamības aprēķināšanai tika izmantots RDPI (30). Metabolisma spektra daudzveidība (Hj indekss) tiek iegūta no MS/MS prekursoru daudzuma, izmantojot MS/MS frekvences sadalījuma Šenona entropiju ar šādu vienādojumu, ko aprakstījuši Martiness et al. (8). Hj = −∑i = 1mPijlog2(Pij), kur Pij atbilst i-tā MS/MS relatīvajai frekvencei j-tajā paraugā (j = 1, 2,…, m) (i = 1, 2, …, m) t).
Metabolisma specifiskums (Si indekss) ir definēts kā dotā MS/MS ekspresijas identitāte attiecībā pret biežumu starp attiecīgajiem paraugiem. MS/MS specifiskums tiek aprēķināts kā Si = 1t (∑j = 1tPijPilog2PijPi).
Izmantojiet šādu formulu, lai izmērītu katra j parauga metaboloma specifisko δj indeksu un MS/MS specifiskuma vidējo vērtību δj = ∑i = 1mPijSi.
MS/MS spektri tiek izlīdzināti pa pāriem, un līdzība tiek aprēķināta, pamatojoties uz abiem rādītājiem. Vispirms, izmantojot standarta NDP (pazīstama arī kā kosinusa korelācijas metode), izmantojiet šādu vienādojumu, lai novērtētu segmentu līdzību starp spektriem: NDP = (∑iS1 un S2WS1, iWS2, i) 2∑iWS1, i2∑iWS2, i2, kur S1 un S2 Attiecīgi 1. un 2. spektram, kā arī WS1, i un WS2 i apzīmē svaru, pamatojoties uz pīķa intensitāti, ka i-tā kopīgā pīķa starpība starp abiem spektriem ir mazāka par 0,01 Da. Svars tiek aprēķināts šādi: W = [pīķa intensitāte] m [kvalitāte] n, m = 0,5, n = 2, kā iesaka MassBank.
Tika ieviesta otra vērtēšanas metode, kas ietvēra koplietotā NL analīzi starp MS/MS. Šim nolūkam mēs izmantojām 52 NL sarakstus, kas bieži sastopami MS fragmentācijas procesā, vienlaikus un specifiskāko NL (datu fails S1), kas iepriekš ir anotēts novājināto Nepenthes sugu sekundāro metabolītu MS/MS spektram (9, 26). Katram MS/MS izveidojiet bināro vektoru ar 1 un 0, kas atbilst attiecīgi kāda NL pašreizējai un neesošajai vērtībai. Pamatojoties uz Eiklīda attāluma līdzību, NL līdzības rādītājs tiek aprēķināts katram bināro NL vektoru pārim.
Lai veiktu divkāršu klasterizāciju, mēs izmantojām R pakotni DiffCoEx, kas ir balstīta uz svērtās gēnu koekspresijas analīzes (WGCNA) paplašinājumu. Izmantojot MS/MS spektru NDP un NL vērtēšanas matricas, mēs izmantojām DiffCoEx, lai aprēķinātu salīdzinošās korelācijas matricu. Binārā klasterizācija tiek veikta, iestatot parametru “cutreeDynamic” uz method = “hybrid”, cutHeight = 0,9999, deepSplit = T un minClusterSize = 10. DiffCoEx R pirmkodu no 1. papildu faila lejupielādēja Tesson et al. (57); Nepieciešamo R WGCNA programmatūras pakotni var atrast šeit: https://horvath.genetics.ucla.edu/html/CoexpressionNetwork/Rpackages/WGCNA.
Lai veiktu MS/MS molekulārā tīkla analīzi, mēs aprēķinājām pāru spektrālo savienojamību, pamatojoties uz NDP un NL līdzības tipiem, un izmantojām Cytoscape programmatūru, lai vizualizētu tīkla topoloģiju, izmantojot organisko izkārtojumu CyFilescape yFiles izkārtojuma algoritma paplašinājuma lietojumprogrammā.
Lai veiktu datu statistisko analīzi, izmantojiet R 3.0.1 versiju. Statistiskā nozīmība tika novērtēta, izmantojot divvirzienu dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey godīgi nozīmīgās atšķirības (HSD) post-hoc tests. Lai analizētu atšķirību starp zālēdāju apstrādi un kontroli, divu paraugu grupu ar vienādu dispersiju divpusējais sadalījums tika analizēts, izmantojot Stjudenta t testu.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/24/eaaz0381/DC1.
Šis ir brīvas piekļuves raksts, kas izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution-NonCommercial licences noteikumiem, kas atļauj tā izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja vien galīgais pielietojums nav paredzēts komerciālam ieguvumam un ja vien oriģināldarbs ir pareizs. Atsauce.
Piezīme. Lūdzam norādīt savu e-pasta adresi tikai tāpēc, lai persona, kuru iesakāt lapai, zinātu, ka vēlaties, lai tā redzētu e-pastu un ka tas nav surogātpasts. Mēs neiegūsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Informācijas teorija nodrošina universālu valūtu īpašu metabolomu salīdzināšanai un testa aizsardzības teoriju prognozēšanai.
Informācijas teorija nodrošina universālu valūtu īpašu metabolomu salīdzināšanai un testa aizsardzības teoriju prognozēšanai.
©2021 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija. visas tiesības paturētas. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.