Raksts ir daļa no pētījuma tēmas “Pākšaugu izturības pret patogēniem un kaitēkļiem uzlabošana”, skatīt visus 5 rakstus
Sēnīšu augu slimības nekrozes Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary izraisītājs izmanto daudzpakāpju stratēģiju, lai inficētu dažādus saimniekaugus. Šajā pētījumā tiek ierosināts izmantot diamīnu L-ornitīnu, neolbaltumvielu aminoskābi, kas stimulē citu neaizvietojamo aminoskābju sintēzi, kā alternatīvu pārvaldības stratēģiju, lai uzlabotu Phaseolus vulgaris L. molekulārās, fizioloģiskās un bioķīmiskās atbildes reakcijas uz balto pelējumu, ko izraisa Pseudomonas sclerotiorum. In vitro eksperimenti parādīja, ka L-ornitīns devas atkarīgā veidā būtiski kavē S. pyrenoidosa micēlija augšanu. Turklāt tas varēja ievērojami samazināt baltās pelējuma smagumu siltumnīcas apstākļos. L-ornitīns stimulēja apstrādāto augu augšanu, norādot, ka testētās L-ornitīna koncentrācijas nebija fitotoksiskas apstrādātajiem augiem. Turklāt L-ornitīns pastiprināja neenzimātisko antioksidantu (kopējo šķīstošo fenolu un flavonoīdu) un fermentatīvo antioksidantu (katalāzes (CAT), peroksidāzes (POX) un polifenolu oksidāzes (PPO)) ekspresiju un palielināja trīs ar antioksidantiem saistītu gēnu (PvCAT1, PvSOD un PvGR) ekspresiju. Turklāt in silico analīze atklāja iespējama oksaloacetāta acetilhidrolāzes (SsOAH) proteīna klātbūtni S. sclerotiorum genomā, kas funkcionālās analīzes, konservēto domēnu un topoloģijas ziņā bija ļoti līdzīgs Aspergillus fijiensis (AfOAH) un Penicillium sp. (PlOAH) oksaloacetāta acetilhidrolāzes (SsOAH) proteīniem. Interesanti, ka L-ornitīna pievienošana kartupeļu dekstrozes buljona (PDB) barotnei ievērojami samazināja SsOAH gēna ekspresiju S. sclerotiorum micēlijā. Līdzīgi, L-ornitīna eksogēna lietošana ievērojami samazināja SsOAH gēna ekspresiju sēnīšu micēlijā, kas savākta no apstrādātajiem augiem. Visbeidzot, L-ornitīna lietošana ievērojami samazināja skābeņskābes sekrēciju gan PDB vidē, gan inficētajās lapās. Noslēgumā jāsaka, ka L-ornitīnam ir galvenā loma redoksa statusa uzturēšanā, kā arī inficēto augu aizsardzības reakcijas uzlabošanā. Šī pētījuma rezultāti var palīdzēt izstrādāt inovatīvas, videi draudzīgas metodes baltās pelējuma kontrolei un tās ietekmes uz pupiņu ražošanu un citām kultūrām mazināšanai.
Baltā pelējuma sēne, ko izraisa nekrotrofā sēne Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary, ir postoša, ražu samazinoša slimība, kas nopietni apdraud pupiņu (Phaseolus vulgaris L.) ražošanu pasaulē (Bolton et al., 2006). Sclerotinia sclerotiorum ir viens no visgrūtāk kontrolējamajiem augsnē izplatītajiem sēnīšu augu patogēniem, kam ir plašs saimnieku klāsts, kurā ir vairāk nekā 600 augu sugu, un spēja ātri un nespecifiski sadalīt saimnieka audus (Liang un Rollins, 2018). Nevēlamos apstākļos tā piedzīvo kritisku dzīves cikla fāzi, ilgstoši paliekot miera stāvoklī kā melnas, cietas, sēklām līdzīgas struktūras, ko augsnē sauc par "sklerocijiem", vai kā balti, pūkaini izaugumi inficēto augu micēlijā vai stumbra serdē (Schwartz et al., 2005). S. sclerotiorum spēj veidot sklerocijus, kas ļauj tai ilgstoši izdzīvot inficētos laukos un saglabāties slimības laikā (Schwartz et al., 2005). Sklerocijas ir bagātas ar barības vielām, var ilgstoši saglabāties augsnē un kalpot kā primārais inokulums turpmākajām infekcijām (Schwartz et al., 2005). Labvēlīgos apstākļos sklerocijas dīgst un ražo gaisā esošas sporas, kas var inficēt visas auga virszemes daļas, tostarp, bet ne tikai, ziedus, stublājus vai pākstis (Schwartz et al., 2005).
Sclerotinia sclerotiorum izmanto daudzpakāpju stratēģiju, lai inficētu savus saimniekaugus, ietverot virkni koordinētu notikumu, sākot no sklerociju dīgšanas līdz simptomu attīstībai. Sākotnēji S. sclerotiorum ražo suspendētas sporas (sauktas par askosporām) no sēnēm līdzīgām struktūrām, ko sauc par apotēcijiem, kas nonāk gaisā un attīstās par nekustīgām sklerocijām uz inficētām augu atliekām (Bolton et al., 2006). Pēc tam sēne izdala skābeņskābi, virulences faktoru, lai kontrolētu augu šūnu sieniņu pH līmeni, veicinātu fermentatīvu degradāciju un audu invāziju (Hegedus un Rimmer, 2005), kā arī nomāktu saimniekauga oksidatīvo uzliesmojumu. Šis paskābināšanas process vājina augu šūnu sieniņu, nodrošinot labvēlīgu vidi sēnīšu šūnu sieniņu noārdošo enzīmu (CWDE) normālai un efektīvai darbībai, ļaujot patogēnam pārvarēt fizisko barjeru un iekļūt saimniekaudos (Marciano et al., 1983). Kad S. sclerotiorum ir iekļuvis, tas izdala vairākus CWDE, piemēram, poligalakturonāzi un celulāzi, kas veicina to izplatīšanos inficētajos audos un izraisa audu nekrozi. Bojājumu un hifu paklājiņu progresēšana izraisa raksturīgos baltās pelējuma simptomus (Hegedus un Rimmer, 2005). Tikmēr saimniekaugi atpazīst ar patogēniem saistītus molekulāros modeļus (PAMP), izmantojot modeļu atpazīšanas receptorus (PRR), izraisot virkni signalizācijas notikumu, kas galu galā aktivizē aizsardzības reakcijas.
Neskatoties uz gadu desmitiem ilgiem slimību kontroles centieniem, pupiņām, tāpat kā citām komerciālām kultūrām, joprojām trūkst atbilstoša rezistenta ģenētiskā materiāla patogēna rezistences, izdzīvošanas un pielāgošanās spējas dēļ. Tāpēc slimību apkarošana ir ārkārtīgi sarežģīta un prasa integrētu, daudzpusīgu stratēģiju, kas ietver kultivēšanas prakses, bioloģiskās kontroles un ķīmisko fungicīdu kombināciju (O'Sullivan et al., 2021). Baltās pelējuma ķīmiskā kontrole ir visefektīvākā, jo fungicīdi, pareizi un īstajā laikā lietoti, var efektīvi kontrolēt slimības izplatību, samazināt infekcijas smagumu un samazināt ražas zudumus. Tomēr pārmērīga fungicīdu lietošana un pārmērīga paļaušanās uz tiem var izraisīt rezistentu S. sclerotiorum celmu parādīšanos un negatīvi ietekmēt nemērķa organismus, augsnes veselību un ūdens kvalitāti (Le Cointe et al., 2016; Ceresini et al., 2024). Tāpēc videi draudzīgu alternatīvu atrašana ir kļuvusi par galveno prioritāti.
Poliamīni (PS), piemēram, putrescīns, spermidīns, spermīns un kadaverīns, var kalpot kā daudzsološas alternatīvas pret augsnē mītošiem augu patogēniem, tādējādi pilnībā vai daļēji samazinot bīstamo ķīmisko fungicīdu lietošanu (Nehela et al., 2024; Yi et al., 2024). Augstākajos augos PS ir iesaistīti daudzos fizioloģiskos procesos, tostarp, bet ne tikai, šūnu dalīšanās, diferenciācijas un reakcijas uz abiotisko un biotisko stresu procesos (Killiny un Nehela, 2020). Tie var darboties kā antioksidanti, palīdzēt iznīcināt reaktīvās skābekļa sugas (ROS), uzturēt redoksa homeostāzi (Nehela un Killiny, 2023), inducēt ar aizsardzību saistītus gēnus (Romero et al., 2018), regulēt dažādus vielmaiņas ceļus (Nehela un Killiny, 2023), modulēt endogēnos fitohormonus (Nehela un Killiny, 2019), izveidot sistēmisku iegūto rezistenci (SAR) un regulēt augu un patogēnu mijiedarbību (Nehela un Killiny, 2020; Asija et al., 2022; Czerwoniec, 2022). Ir vērts atzīmēt, ka PA specifiskie mehānismi un loma augu aizsardzībā atšķiras atkarībā no augu sugas, patogēniem un vides apstākļiem. Visbiežāk augos PA tiek biosintezēta no neaizvietojamā poliamīna L-ornitīna (Killiny un Nehela, 2020).
L-ornitīnam ir vairākas lomas augu augšanā un attīstībā. Piemēram, iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka rīsos (Oryza sativa) ornitīns var būt saistīts ar slāpekļa pārstrādi (Liu et al., 2018), rīsu ražu, kvalitāti un aromātu (Lu et al., 2020), kā arī ūdens stresa reakciju (Yang et al., 2000). Turklāt L-ornitīna eksogēna lietošana ievērojami uzlaboja sausuma toleranci cukurbietēs (Beta vulgaris) (Hussein et al., 2019) un mazināja sāls stresu sīpolu (Allium Cepa) (Çavuşoǧlu un Çavuşoǧlu, 2021) un kešju riekstu (Anacardium occidentale) augos (da Rocha et al., 2012). L-ornitīna potenciālā loma abiotiskā stresa aizsardzībā var būt saistīta ar tā iesaistīšanos prolīna uzkrāšanā apstrādātajos augos. Piemēram, iepriekš ir ziņots, ka ar prolīna metabolismu saistīti gēni, piemēram, ornitīna delta aminotransferāzes (delta-OAT) un prolīna dehidrogenāzes (ProDH1 un ProDH2) gēni, ir iesaistīti Nicotiana benthamiana un Arabidopsis thaliana aizsardzībā pret nesaimnieka Pseudomonas syringae celmiem (Senthil-Kumar un Mysore, 2012). No otras puses, sēnīšu ornitīna dekarboksilāze (ODC) ir nepieciešama patogēnu augšanai (Singh et al., 2020). Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici ODC mērķtiecīga ietekmēšana, izmantojot saimnieka inducētu gēnu apklusināšanu (HIGS), ievērojami uzlaboja tomātu augu izturību pret Fusarium vīti (Singh et al., 2020). Tomēr eksogēna ornitīna lietošanas potenciālā loma pret biotiskiem stresiem, piemēram, fitopatogēniem, nav labi pētīta. Vēl svarīgāk ir tas, ka ornitīna ietekme uz slimību rezistenci un ar to saistītajām bioķīmiskajām un fizioloģiskajām parādībām joprojām lielākoties nav izpētīta.
Izpratne par S. sclerotiorum infekcijas sarežģītību pākšaugos ir svarīga efektīvu kontroles stratēģiju izstrādei. Šajā pētījumā mēs centāmies noteikt diamīna L-ornitīna potenciālo lomu kā galveno faktoru pākšaugu aizsardzības mehānismu un rezistences uzlabošanā pret Sclerotinia sclerotiorum infekciju. Mēs izvirzām hipotēzi, ka papildus inficēto augu aizsardzības reakciju uzlabošanai L-ornitīnam ir arī galvenā loma redoksa statusa uzturēšanā. Mēs ierosinām, ka L-ornitīna potenciālā ietekme ir saistīta ar fermentatīvo un neenzimātisko antioksidantu aizsardzības mehānismu regulēšanu un iejaukšanos sēnīšu patogenitātes/virulences faktoros un saistītajos proteīnos. Šī L-ornitīna divējāda funkcionalitāte padara to par daudzsološu kandidātu ilgtspējīgai stratēģijai, lai mazinātu baltās pelējuma ietekmi un uzlabotu parasto pākšaugu kultūru izturību pret šo spēcīgo sēnīšu patogēnu. Šī pētījuma rezultāti varētu palīdzēt izstrādāt inovatīvas, videi draudzīgas metodes baltās pelējuma kontrolei un tās ietekmes uz pākšaugu ražošanu mazināšanai.
Šajā pētījumā kā eksperimentāls materiāls tika izmantota uzņēmīga parasto pupiņu komerciālā šķirne Giza 3 (Phaseolus vulgaris L. cv. Giza 3). Veselīgas sēklas laipni nodrošināja Pākšaugu pētniecības departaments, Lauksaimniecības pētījumu institūts (FCRI), Lauksaimniecības pētījumu centrs (ARC), Ēģipte. Piecas sēklas tika iesētas plastmasas podos (iekšējais diametrs 35 cm, dziļums 50 cm), kas piepildīti ar S. sclerotiorum inficētu augsni siltumnīcas apstākļos (25 ± 2 °C, relatīvais mitrums 75 ± 1%, 8 h gaismas/16 h tumsas). 7–10 dienas pēc sēšanas (DPS) stādus retināja, lai katrā podā paliktu tikai divi stādi ar vienmērīgu augšanu un trim pilnībā izplaucējušām lapām. Visus podos audzētos augus laistīja reizi divās nedēļās un mēsloja katru mēnesi ar ieteicamo devu konkrētajai šķirnei.
Lai pagatavotu 500 mg/l koncentrāciju L-ornitīndiamīna (pazīstams arī kā (+)-(S)-2,5-diaminopentānskābe; Sigma-Aldrich, Darmštate, Vācija), 50 mg vispirms tika izšķīdināti 100 ml sterila destilēta ūdens. Pēc tam standarta šķīdums tika atšķaidīts un izmantots turpmākajos eksperimentos. Īsumā, in vitro tika testētas sešas L-ornitīna koncentrāciju sērijas (12,5, 25, 50, 75, 100 un 125 mg/l). Turklāt kā negatīvā kontrole (Mock) tika izmantots sterils destilēts ūdens, bet kā pozitīvā kontrole - komerciāls fungicīds “Rizolex-T” 50% mitrināms pulveris (toklofosmetils 20% + tirams 30%; KZ-Kafr El Zayat Pesticides and Chemicals Company, Kafr El Zayat, Gharbia Gubernate, Ēģipte). Komerciālais fungicīds “Rizolex-T” tika testēts in vitro piecās koncentrācijās (2, 4, 6, 8 un 10 mg/l).
Parasto pupiņu stublāju un pāksšu paraugi ar tipiskiem baltās pelējuma simptomiem (invāzijas līmenis: 10–30%) tika savākti no komerciālām saimniecībām. Lai gan lielākā daļa inficēto augu materiālu tika identificēti pēc sugas/šķirnes (uzņēmīgā komerciālā šķirne Giza 3), citi, īpaši tie, kas iegūti no vietējiem tirgiem, bija nezināmas sugas. Savāktie inficētie materiāli vispirms tika virsmas dezinficēti ar 0,5% nātrija hipohlorīta šķīdumu 3 minūtes, pēc tam vairākas reizes noskaloti ar sterilu destilētu ūdeni un nosusināti ar sterilu filtrpapīru, lai noņemtu lieko ūdeni. Pēc tam inficētie orgāni tika sagriezti mazos gabaliņos no vidusaudiem (starp veselajiem un inficētajiem audiem), kultivēti kartupeļu dekstrozes agara (PDA) barotnē un inkubēti 25 ± 2 °C temperatūrā ar 12 h gaismas/12 h tumsas ciklu 5 dienas, lai stimulētu sklerociju veidošanos. Micēlija galu metode tika izmantota arī sēnīšu izolātu attīrīšanai no jauktām vai piesārņotām kultūrām. Attīrītais sēnīšu izolāts vispirms tika identificēts, pamatojoties uz tā kultūras morfoloģiskajām īpašībām, un pēc tam, pamatojoties uz mikroskopiskām pazīmēm, tika apstiprināts, ka tas ir S. sclerotiorum. Visbeidzot, visi attīrītie izolāti tika pārbaudīti attiecībā uz patogenitāti uz uzņēmīgo parasto pupiņu šķirni Giza 3, lai atbilstu Koha postulātiem.
Turklāt visinvazīvākais S. sclerotiorum izolāts (izolāts Nr. 3) tika papildus apstiprināts, pamatojoties uz iekšējās transkripcijas starplikas (ITS) sekvencēšanu, kā aprakstījuši White et al., 1990; Baturo-Ciesniewska et al., 2017. Īsumā, izolāti tika kultivēti kartupeļu dekstrozes buljonā (PDB) un inkubēti 25 ± 2 °C temperatūrā 5–7 dienas. Pēc tam sēnīšu micēlijs tika savākts, filtrēts caur marli, divreiz mazgāts ar sterilu ūdeni un žāvēts ar sterilu filtrpapīru. Genomiskā DNS tika izolēta, izmantojot Quick-DNA™ sēnīšu/baktēriju minipreparācijas komplektu (Kuramae-Izioka, 1997; Atallah et al., 2022, 2024). Pēc tam ITS rDNS reģions tika amplificēts, izmantojot specifisko praimeru pāri ITS1/ITS4 (TCCGTAGGTGAACCTGCGG TCCTCCGCTTATTGATATGC; paredzamais izmērs: 540 bp) (Baturo-Ciesniewska et al., 2017). Attīrītie PCR produkti tika iesniegti sekvencēšanai (Beijing Aoke Dingsheng Biotechnology Co., Ltd.). ITS rDNS sekvences tika sekvencētas divvirzienu secībā, izmantojot Sanger sekvencēšanas metodi. Saliktās vaicājuma sekvences pēc tam tika salīdzinātas ar jaunākajiem datiem GenBank un Nacionālajā biotehnoloģijas informācijas centrā (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/), izmantojot BLASTn programmatūru. Vaicājuma secība tika salīdzināta ar 20 citiem S. sclerotiorum celmiem/izolātiem, kas iegūti no jaunākajiem datiem NCBI GenBank (1. papildtabula), izmantojot ClustalW Molecular Evolutionary Genetics Analysis Package (MEGA-11; 11. versija) (Kumar et al., 2024). Evolucionārā analīze tika veikta, izmantojot maksimālās ticamības metodi un vispārējo laika ziņā atgriezenisko nukleotīdu aizvietošanas modeli (Nei un Kumar, 2000). Attēlā redzams koks ar augstāko log-ticamību. Heiristiskās meklēšanas sākotnējais koks tiek izvēlēts, izvēloties koku ar augstāko log-ticamību starp kaimiņu savienošanās (NJ) koku (Kumar et al., 2024) un maksimālās parsimonijas (MP) koku. NJ koks tika konstruēts, izmantojot pāru attālumu matricu, kas aprēķināta, izmantojot vispārējo laika ziņā atgriezenisko modeli (Nei un Kumar, 2000).
L-ornitīna un baktericīda “Rizolex-T” antibakteriālā aktivitāte tika noteikta in vitro, izmantojot agara difūzijas metodi. Metode: Paņemiet atbilstošu L-ornitīna standarta šķīduma daudzumu (500 mg/l) un rūpīgi sajauciet to ar 10 ml PDA barības vielas, lai pagatavotu šķīdumus ar galīgo koncentrāciju attiecīgi 12,5, 25, 50, 75, 100 un 125 mg/l. Kā kontrolei tika izmantotas piecas fungicīda “Rizolex-T” koncentrācijas (2, 4, 6, 8 un 10 mg/l) un sterils destilēts ūdens. Pēc barotnes sacietēšanas svaigi pagatavotu Sclerotinia sclerotiorum kultūras micēlija aizbāzni 4 mm diametrā pārnesa uz Petri trauciņa centru un kultivēja 25±2°C temperatūrā, līdz micēlijs pārklāja visu kontroles Petri trauciņu, pēc tam reģistrēja sēnīšu augšanu. Aprēķiniet S. sclerotiorum radiālās augšanas inhibīcijas procentuālo daļu, izmantojot 1. vienādojumu:
Eksperiments tika atkārtots divas reizes, katrai kontroles/eksperimentālajai grupai izmantojot sešus bioloģiskos atkārtojumus un piecus podus (divi augi katrā podā) katram bioloģiskajam atkārtojumam. Katrs bioloģiskais atkārtojums tika analizēts divas reizes (divi tehniskie atkārtojumi), lai nodrošinātu eksperimentālo rezultātu precizitāti, ticamību un reproducējamību. Turklāt, lai aprēķinātu pusi no maksimālās inhibējošās koncentrācijas (IC50) un IC99 (Prentice, 1976), tika izmantota probita regresijas analīze.
Lai novērtētu L-ornitīna potenciālu siltumnīcas apstākļos, tika veikti divi secīgi podu eksperimenti. Īsumā, podi tika piepildīti ar sterilizētu māla-smilšu augsni (3:1) un inokulēti ar svaigi pagatavotu S. sclerotiorum kultūru. Vispirms visinvazīvākais S. sclerotiorum izolāts (izolāts Nr. 3) tika kultivēts, pārgriežot vienu sklerotiju uz pusēm, novietojot to ar virsmu uz leju uz PDA un inkubējot 25 °C temperatūrā pastāvīgā tumsā (24 h) 4 dienas, lai stimulētu micēlija augšanu. Pēc tam no priekšējās malas tika ņemti četri 5 mm diametra agara aizbāžņi un inokulēti ar 100 g sterila kviešu un rīsu kliju maisījuma (1:1, v/v), un visas kolbas tika inkubētas 25 ± 2 °C temperatūrā 12 h gaismas/12 h tumsas ciklā 5 dienas, lai stimulētu sklerociju veidošanos. Visu kolbu saturs tika rūpīgi sajaukts, lai nodrošinātu viendabīgumu pirms augsnes pievienošanas. Pēc tam katrā podā pievienoja 100 g kolonizējošās klijas maisījuma, lai nodrošinātu nemainīgu patogēnu koncentrāciju. Inokulētos podus laistīja, lai aktivizētu sēnīšu augšanu, un uz 7 dienām ievietoja siltumnīcas apstākļos.
Katrā podā iesēja piecas Giza 3 šķirnes sēklas. Podos, kas apstrādāti ar L-ornitīnu un fungicīdu Rizolex-T, sterilizētās sēklas vispirms divas stundas iemērcēja abu savienojumu ūdens šķīdumā ar galīgo IC99 koncentrāciju attiecīgi aptuveni 250 mg/l un 50 mg/l un pēc tam vienu stundu žāvēja gaisā pirms sēšanas. Savukārt sēklas kā negatīvu kontroli iemērcēja sterilā destilētā ūdenī. Pēc 10 dienām, pirms pirmās laistīšanas, stādus retināja, katrā podā atstājot tikai divus tīrus stādus. Turklāt, lai nodrošinātu inficēšanos ar S. sclerotiorum, pupiņu auga stublāji vienā attīstības stadijā (10 dienas) tika nogriezti divās dažādās vietās, izmantojot sterilizētu skalpeli, un katrā brūcē tika ievietoti aptuveni 0,5 g kolonizējošās klijas maisījuma, kam sekoja augsts mitrums, lai stimulētu infekciju un slimības attīstību visos inokulētajos augos. Kontroles augi tika līdzīgi ievainoti, un brūcē tika ievietots vienāds daudzums (0,5 g) sterila, nekolonizēta kliju maisījuma un uzturēts augstā mitruma apstākļos, lai simulētu slimības attīstības vidi un nodrošinātu konsekvenci starp apstrādes grupām.
Apstrādes metode: Pupu stādus laistīja ar 500 ml L-ornitīna (250 mg/l) vai fungicīda Rizolex-T (50 mg/l) ūdens šķīduma, apūdeņojot augsni, pēc tam apstrādi atkārtoja trīs reizes ar 10 dienu intervālu. Ar placebo apstrādātās kontroles grupas laistīja ar 500 ml sterila destilēta ūdens. Visas apstrādes tika veiktas siltumnīcas apstākļos (25 ± 2°C, 75 ± 1% relatīvais mitrums un fotoperiods 8 h gaismas/16 h tumsas). Visus podus laistīja ik pēc divām nedēļām un apstrādāja reizi mēnesī ar sabalansētu NPK mēslojumu (20-20-20, ar 3,6% sēra un TE mikroelementiem; Zain Seeds, Ēģipte) ar koncentrāciju 3–4 g/l, apsmidzinot lapas saskaņā ar konkrētās šķirnes ieteikumiem un ražotāja norādījumiem. Ja vien nav norādīts citādi, pilnībā izpletušās nobriedušās lapas (2. un 3. lapa no augšas) tika savāktas no katra bioloģiskā atkārtojuma 72 stundas pēc apstrādes (hpt), homogenizētas, apvienotas un uzglabātas -80 °C temperatūrā turpmākai analīzei, tostarp, bet ne tikai, oksidatīvā stresa indikatoru in situ histoķīmiskai lokalizācijai, lipīdu peroksidācijai, fermentatīvajiem un neenzimātiskajiem antioksidantiem un gēnu ekspresijai.
Baltās pelējuma infekcijas intensitāte tika novērtēta katru nedēļu 21 dienu pēc inokulācijas (dpi), izmantojot skalu no 1 līdz 9 (S2. papildtabula), kuras pamatā ir Petzolta un Diksona skala (1996), ko modificēja Terans et al. (2006). Īsumā, pupiņu augu stublāji un zari tika pārbaudīti, sākot no inokulācijas vietas, lai sekotu bojājumu progresēšanai gar starpmezgliem un mezgliem. Pēc tam tika mērīts bojājuma attālums no inokulācijas vietas līdz tālākajam punktam uz stublāja vai zara, un, pamatojoties uz bojājuma atrašanās vietu, tika piešķirts vērtējums no 1 līdz 9, kur (1) norādīja, ka inokulācijas vietas tuvumā nav redzamas infekcijas, un (2–9) norādīja uz pakāpenisku bojājuma lieluma palielināšanos un progresēšanu gar mezgliem/internodiem (S2. papildtabula). Baltās pelējuma infekcijas intensitāte pēc tam tika konvertēta procentos, izmantojot 2. formulu:
Turklāt laukums zem slimības progresēšanas līknes (AUDPC) tika aprēķināts, izmantojot formulu (Shaner un Finney, 1977), kas nesen tika pielāgota parasto pupiņu baltajai puvei (Chauhan et al., 2020), izmantojot 3. vienādojumu:
Kur Yi = slimības smaguma pakāpe laika momentā ti, Yi+1 = slimības smaguma pakāpe nākamajā laika momentā ti+1, ti = pirmā mērījuma laiks (dienās), ti+1 = nākamā mērījuma laiks (dienās), n = kopējais laika punktu vai novērošanas punktu skaits. Pupiņu auga augšanas parametri, tostarp auga augstums (cm), zaru skaits uz auga un lapu skaits uz auga, tika reģistrēti katru nedēļu 21 dienu visos bioloģiskajos atkārtojumos.
Katrā bioloģiskajā atkārtojumā lapu paraugi (otrā un trešā pilnībā attīstītā lapa no augšas) tika savākti 45. dienā pēc apstrādes (15 dienas pēc pēdējās apstrādes). Katrs bioloģiskais atkārtojums sastāvēja no pieciem podiem (divi augi katrā podā). Apmēram 500 mg sasmalcināto audu tika izmantoti fotosintēzes pigmentu (hlorofila a, hlorofila b un karotinoīdu) ekstrakcijai, izmantojot 80% acetonu 4 °C temperatūrā tumsā. Pēc 24 stundām paraugi tika centrifugēti, un supernatants tika savākts, lai kolorimetriski noteiktu hlorofila a, hlorofila b un karotinoīdu saturu, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna) saskaņā ar metodi (Lichtenthaler, 1987), mērot absorbciju trīs dažādos viļņu garumos (A470, A646 un A663 nm). Visbeidzot, fotosintēzes pigmentu saturs tika aprēķināts, izmantojot šādas 4.–6. formulas, ko aprakstījis Lichtenthaler (1987).
72 stundas pēc apstrādes (hpt) no katra bioloģiskā atkārtojuma tika savāktas lapas (otrā un trešā pilnībā attīstītā lapa no augšas), lai veiktu ūdeņraža peroksīda (H2O2) un superoksīda anjona (O2•−) histoķīmisko lokalizāciju in situ. Katrs bioloģiskais atkārtojums sastāvēja no pieciem podiem (divi augi katrā podā). Katrs bioloģiskais atkārtojums tika analizēts divos tehniskos atkārtojumos, lai nodrošinātu metodes precizitāti, ticamību un reproducējamību. H2O2 un O2•− tika noteikti, izmantojot attiecīgi 0,1% 3,3′-diaminobenzidīnu (DAB; Sigma-Aldrich, Darmštate, Vācija) vai nitrozilā tetrazoliju (NBT; Sigma-Aldrich, Darmštate, Vācija), ievērojot Romero-Puertas et al. (2004) un Adam et al. (1989) aprakstītās metodes ar nelielām modifikācijām. H2O2 histoķīmiskai lokalizācijai in situ lapiņas tika vakuumā infiltrētas ar 0,1% DAB 10 mM Tris buferšķīdumā (pH 7,8) un pēc tam inkubētas istabas temperatūrā gaismā 60 minūtes. Lapiņas tika balinātas 0,15% (v/v) TCA 4:1 (v/v) etanola:hloroforma šķīdumā (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaira, Ēģipte) un pēc tam pakļautas gaismai, līdz tās kļuva tumšas. Līdzīgi vārsti tika vakuumā infiltrēti ar 10 mM kālija fosfāta buferšķīdumu (pH 7,8), kas satur 0,1 w/v % HBT, lai noteiktu O2•− histoķīmisku lokalizāciju in situ. Lapiņas tika inkubētas gaismā istabas temperatūrā 20 minūtes, pēc tam balinātas, kā aprakstīts iepriekš, un pēc tam apgaismotas, līdz parādījās tumši zili/violeti plankumi. Iegūtās brūnās (kā H2O2 indikatora) vai zili violetās (kā O2•− indikatora) krāsas intensitāte tika novērtēta, izmantojot attēlu apstrādes pakotnes ImageJ Fidži versiju (http://fiji.sc; apmeklēts 2024. gada 7. martā).
Malondialdehīds (MDA; kā lipīdu peroksidācijas marķieris) tika noteikts saskaņā ar Du un Bramlage (1992) metodi ar nelielām modifikācijām. Lapas no katra bioloģiskā atkārtojuma (otrā un trešā pilnībā attīstītā lapa no augšas) tika savāktas 72 stundas pēc apstrādes (hpt). Katrā bioloģiskajā atkārtojumā bija pieci podi (divi augi katrā podā). Katrs bioloģiskais atkārtojums tika analizēts divos tehniskos atkārtojumos, lai nodrošinātu metodes precizitāti, ticamību un reproducējamību. Īsumā, 0,5 g samaltu lapu audu tika izmantoti MDA ekstrakcijai ar 20% trihloretiķskābi (TCA; MilliporeSigma, Burlington, MA, ASV), kas satur 0,01% butilēta hidroksitoluola (BHT; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV). Pēc tam MDA saturs supernatantā tika noteikts kolorimetriski, mērot absorbciju pie 532 un 600 nm, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna), un pēc tam izteikts kā nmol g−1 FW.
Lai novērtētu neenzimātiskos un fermentatīvos antioksidantus, 72 stundas pēc apstrādes (hpt) no katra bioloģiskā atkārtojuma tika savāktas lapas (otrā un trešā pilnībā attīstītā lapa no augšas). Katrs bioloģiskais atkārtojums sastāvēja no pieciem podiem (divi augi katrā podā). Katrs bioloģiskais paraugs tika analizēts divos eksemplāros (divi tehniskie paraugi). Divas lapas tika samaltas ar šķidru slāpekli un izmantotas tieši fermentatīvo un neenzimātisko antioksidantu, kopējo aminoskābju, prolīna satura, gēnu ekspresijas un oksalātu kvantitatīvās noteikšanas noteikšanai.
Kopējais šķīstošo fenolu daudzums tika noteikts, izmantojot Folin-Ciocalteu reaģentu (Sigma-Aldrich, Sentluisa, Misūri, ASV) ar nelielām Kahkonena u.c. (1999) aprakstītās metodes modifikācijām. Īsumā, aptuveni 0,1 g homogenizētu lapu audu ekstrahēja ar 20 ml 80% metanola tumsā 24 stundas, un pēc centrifugēšanas savāca supernatantu. 0,1 ml parauga ekstrakta sajauca ar 0,5 ml Folin-Ciocalteu reaģenta (10%), kratīja 30 sekundes un atstāja tumsā 5 minūtes. Pēc tam katrā mēģenē pievienoja 0,5 ml 20% nātrija karbonāta šķīduma (Na2CO3; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies Company, Kaira, Ēģipte), rūpīgi samaisīja un inkubēja istabas temperatūrā tumsā 1 stundu. Pēc inkubācijas reakcijas maisījuma absorbcija tika mērīta pie 765 nm, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna). Kopējo šķīstošo fenolu koncentrācija paraugu ekstraktos tika noteikta, izmantojot gallskābes kalibrēšanas līkni (Fisher Scientific, Hampton, NH, ASV), un izteikta kā gallskābes ekvivalenta miligrami uz svaiga svara gramu (mg GAE g-1 svaigs svars).
Kopējais šķīstošo flavonoīdu saturs tika noteikts saskaņā ar Djeridane et al. (2006) metodi ar nelielām izmaiņām. Īsumā, 0,3 ml iepriekš minētā metanola ekstrakta sajauca ar 0,3 ml 5% alumīnija hlorīda šķīduma (AlCl3; Fisher Scientific, Hampton, NH, ASV), enerģiski maisīja un pēc tam inkubēja istabas temperatūrā 5 minūtes, pēc tam pievienoja 0,3 ml 10% kālija acetāta šķīduma (Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Kaira, Ēģipte), rūpīgi samaisīja un inkubēja istabas temperatūrā 30 minūtes tumsā. Pēc inkubācijas reakcijas maisījuma absorbcija tika mērīta pie 430 nm, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna). Kopējo šķīstošo flavonoīdu koncentrācija paraugu ekstraktos tika noteikta, izmantojot rutīna kalibrēšanas līkni (TCI America, Portland, OR, ASV), un pēc tam izteikta kā rutīna ekvivalenta miligrami uz gramu svaiga svara (mg RE g-1 svaiga svara).
Kopējais brīvo aminoskābju saturs pupiņu lapās tika noteikts, izmantojot modificētu ninhidrīna reaģentu (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ASV), pamatojoties uz Yokoyama un Hiramatsu (2003) ierosināto un Sun et al. (2006) modificēto metodi. Īsumā, 0,1 g samaltu audu ekstrahēja ar pH 5,4 buferšķīdumu, un 200 μL supernatanta reaģēja ar 200 μL ninhidrīna (2%) un 200 μL piridīna (10%; Spectrum Chemical, New Brunswick, NJ, ASV), inkubēja verdoša ūdens vannā 30 minūtes, pēc tam atdzesēja un mērīja pie 580 nm, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna). Savukārt prolīns tika noteikts ar Bates metodi (Bates et al., 1973). Prolīns tika ekstrahēts ar 3% sulfosalicilskābi (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ASV), un pēc centrifugēšanas 0,5 ml supernatanta sajauca ar 1 ml ledus etiķskābes (Fisher Scientific, Hampton, NH, ASV) un ninhidrīna reaģentu, inkubēja 90°C temperatūrā 45 minūtes, atdzesēja un mērīja pie 520 nm, izmantojot to pašu spektrofotometru kā iepriekš. Kopējās brīvās aminoskābes un prolīns lapu ekstraktos tika noteikts, izmantojot glicīna un prolīna kalibrēšanas līknes (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ASV), un izteikts kā mg/g svaiga svara.
Lai noteiktu antioksidantu enzīmu fermentatīvo aktivitāti, aptuveni 500 mg homogenizētu audu ekstrahēja ar 3 ml 50 mM Tris buferšķīduma (pH 7,8), kas saturēja 1 mM EDTA-Na2 (Sigma-Aldrich, Sentluisa, Misūri, ASV) un 7,5% polivinilpirolidona (PVP; Sigma-Aldrich, Sentluisa, Misūri, ASV), centrifugēja ar 10 000 × g 20 minūtes ledusskapī (4 °C), un supernatants (neapstrādāts enzīmu ekstrakts) tika savākts (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Pēc tam katalāze (CAT) tika reaģēta ar 2 ml 0,1 M nātrija fosfāta buferšķīduma (pH 6,5; Sigma-Aldrich, Sentluisa, Misūri, ASV) un 100 μl 269 mM H2O2 šķīduma, lai noteiktu tās fermentatīvo aktivitāti saskaņā ar Aebi (1984) metodi ar nelielām modifikācijām (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Guajakola atkarīgās peroksidāzes (POX) fermentatīvā aktivitāte tika noteikta, izmantojot Harrach et al. (2009) metodi. (2008) ar nelielām modifikācijām (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023), un polifenola oksidāzes (PPO) fermentatīvā aktivitāte tika noteikta pēc reakcijas ar 2,2 ml 100 mM nātrija fosfāta buferšķīduma (pH 6,0), 100 μl guaiakola (TCI Chemicals, Portland, OR, ASV) un 100 μl 12 mM H2O2. Metode tika nedaudz modificēta no (El-Nagar et al., 2023; Osman et al., 2023). Tests tika veikts pēc reakcijas ar 3 ml katehola šķīduma (Thermo Scientific Chemicals, Waltham, MA, ASV) (0,01 M), kas svaigi pagatavots 0,1 M fosfāta buferšķīdumā (pH 6,0). KAT aktivitāte tika mērīta, kontrolējot H2O2 sadalīšanos pie 240 nm (A240), POX aktivitāte tika mērīta, kontrolējot absorbcijas pieaugumu pie 436 nm (A436), un PPO aktivitāte tika mērīta, reģistrējot absorbcijas svārstības pie 495 nm (A495) ik pēc 30 s 3 minūtes, izmantojot UV-160A spektrofotometru (Shimadzu, Japāna).
Pupiņu lapās (otrajā un trešajā pilnībā attīstītajā lapā no augšas) 72 stundas pēc pēdējās apstrādes tika izmantota reāllaika RT-PCR, lai noteiktu trīs ar antioksidantiem saistītu gēnu, tostarp peroksisomālās katalāzes (PvCAT1; GenBank piekļuves Nr. KF033307.1), superoksīda dismutāzes (PvSOD; GenBank piekļuves Nr. XM_068639556.1) un glutationa reduktāzes (PvGR; GenBank piekļuves Nr. KY195009.1), transkripta līmeņus. Īsumā, RNS tika izolēta, izmantojot Simply P Total RNA Extraction Kit (Kat. Nr. BSC52S1; BioFlux, Biori Technology, Ķīna) saskaņā ar ražotāja protokolu. Pēc tam cDNS tika sintezēta, izmantojot TOP script™ cDNA Synthesis Kit saskaņā ar ražotāja norādījumiem. Iepriekš minēto trīs gēnu praimeru secības ir uzskaitītas S3 papildtabulā. Kā saimniekgēns tika izmantots PvActin-3 (GenBank piekļuves numurs: XM_068616709.1), un relatīvā gēna ekspresija tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCT metodi (Livak un Schmittgen, 2001). Tika pierādīta aktīna stabilitāte biotiskā stresa (nesaderīga mijiedarbība starp parastajiem pākšaugiem un antraknozes sēnīti Colletotrichum lindemuthianum) un abiotiskā stresa (sausums, sāļums, zema temperatūra) apstākļos (Borges et al., 2012).
Sākotnēji mēs veicām S. sclerotiorum oksaloacetāta acetilhidrolāzes (OAH) proteīnu genoma mēroga in silico analīzi, izmantojot proteīnu-proteīnu BLAST rīku (BLASTp 2.15.0+) (Altschul et al., 1997, 2005). Īsumā, mēs izmantojām OAH no Aspergillus fijiensis CBS 313.89 (AfOAH; taksīds: 1191702; GenBank piekļuves numurs XP_040799428.1; 342 aminoskābes) un Penicillium lagena (PlOAH; taksīds: 94218; GenBank piekļuves numurs XP_056833920.1; 316 aminoskābes) kā vaicājuma secības, lai kartētu homologo proteīnu S. sclerotiorum (taksīds: 5180). BLASTp tika veikta, izmantojot jaunākos pieejamos S. sclerotiorum genoma datus GenBank datubāzē Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) tīmekļa vietnē http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/.
Turklāt, izmantojot maksimālās ticamības metodi MEGA11 (Tamura et al., 2021) un uz JTT matricu balstītu modeli (Jones et al., 1992), tika secināts paredzētais OAH gēns no S. sclerotiorum (SsOAH), kā arī AfOAH evolūcijas analīze un filoģenētiskais koks no A. fijiensis CBS 313.89 un PlOAH no P. lagena. Filoģenētiskais koks tika apvienots ar visu paredzēto OAH gēnu (SsOAH) no S. sclerotiorum olbaltumvielu secību daudzkārtēju saskaņošanas analīzi un vaicājuma secību, izmantojot uz ierobežojumiem balstīto saskaņošanas rīku (COBALT; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/cobalt/re_cobalt.cgi) (Papadopoulos un Agarwala, 2007). Turklāt, izmantojot ClustalW (http://www.genome.jp/tools-bin/clustalw), vislabāk atbilstošās SsOAH aminoskābju sekvences no S. sclerotiorum tika saskaņotas ar vaicājuma sekvencēm (AfOAH un PlOAH) (Larkin et al., 2007), un saglabātie reģioni izlīdzinājumā tika vizualizēti, izmantojot ESPript rīku (3.0 versija; https://espript.ibcp.fr/ESPript/ESPript/index.php).
Turklāt paredzētie S. sclerotiorum SsOAH funkcionālie reprezentatīvie domēni un konservatīvās vietas tika interaktīvi klasificētas dažādās ģimenēs, izmantojot InterPro rīku (https://www.ebi.ac.uk/interpro/) (Blum et al., 2021). Visbeidzot, paredzētā S. sclerotiorum SsOAH trīsdimensiju (3D) struktūras modelēšana tika veikta, izmantojot olbaltumvielu homoloģijas/analoģijas atpazīšanas dzinēju (Phyre2 servera 2.0 versija; http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/~phyre2/html/page.cgi?id=index) (Kelley et al., 2015), un validēta, izmantojot SWISS-MODEL serveri (https://swissmodel.expasy.org/) (Biasini et al., 2014). Paredzētās trīsdimensiju struktūras (PDB formātā) tika interaktīvi vizualizētas, izmantojot UCSF-Chimera paketi (1.15. versija; https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/) (Pettersen et al., 2004).
Kvantitatīva reālā laika fluorescences PCR tika izmantota, lai noteiktu oksaloacetāta acetilhidrolāzes (SsOAH; GenBank piekļuves numurs: XM_001590428.1) transkripcijas līmeni Sclerotinia sclerotiorum micēlijā. Īsumā, S. sclerotiorum tika inokulēts kolbā ar PDB un ievietots kratīšanas inkubatorā (modelis: I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ASV) 25 ± 2 °C temperatūrā pie 150 apgr./min un pastāvīgā tumsā (24 h), lai stimulētu micēlija augšanu. Pēc tam šūnas tika apstrādātas ar L-ornitīnu un fungicīdu Rizolex-T galīgajās IC50 koncentrācijās (attiecīgi aptuveni 40 un 3,2 mg/l) un pēc tam kultivētas vēl 24 stundas tādos pašos apstākļos. Pēc inkubācijas kultūras tika centrifugētas pie 2500 apgr./min 5 minūtes, un supernatants (sēnīšu micēlijs) tika savākts gēnu ekspresijas analīzei. Līdzīgi, sēnīšu micēlijs tika savākts 0, 24, 48, 72, 96 un 120 stundas pēc inficēšanās no inficētiem augiem, kuriem uz inficēto audu virsmas bija izveidojusies baltā pelējuma un kokvilnas micēlija forma. No sēnīšu micēlija tika ekstrahēta RNS, un pēc tam tika sintezēta kDNS, kā aprakstīts iepriekš. SsOAH praimeru sekvences ir uzskaitītas S3 papildtabulā. Kā saimniekgēns tika izmantots SsActin (GenBank piekļuves numurs: XM_001589919.1), un relatīvā gēna ekspresija tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCT metodi (Livak un Schmittgen, 2001).
Skābeņskābes daudzums kartupeļu dekstrozes buljonā (PDB) un augu paraugos, kas satur sēnīšu patogēnu Sclerotinia sclerotiorum, tika noteikts saskaņā ar Sju un Džana (2000) metodi ar nelielām modifikācijām. Īsumā, S. sclerotiorum izolāti tika inokulēti kolbās, kas satur PDB, un pēc tam kultivēti kratīšanas inkubatorā (modelis I2400, New Brunswick Scientific Co., Edison, NJ, ASV) ar ātrumu 150 apgr./min 25 ± 2 °C temperatūrā 3–5 dienas pastāvīgā tumsā (24 h), lai stimulētu micēlija augšanu. Pēc inkubācijas sēnīšu kultūra vispirms tika filtrēta caur Whatman #1 filtrpapīru un pēc tam centrifugēta ar ātrumu 2500 apgr./min 5 minūtes, lai noņemtu atlikušo micēliju. Supernatants tika savākts un uzglabāts 4 °C temperatūrā turpmākai oksalāta kvantitatīvai noteikšanai. Augu paraugu sagatavošanai aptuveni 0,1 g augu audu fragmentu trīs reizes ekstrahēja ar destilētu ūdeni (katru reizi 2 ml). Pēc tam paraugus centrifugēja ar ātrumu 2500 apgr./min 5 minūtes, supernatantu sausā veidā filtrēja caur Whatman Nr. 1 filtrpapīru un savāca tālākai analīzei.
Skābeņskābes kvantitatīvai analīzei reakcijas maisījums tika sagatavots stikla aizbāžņa mēģenē šādā secībā: 0,2 ml parauga (vai PDB kultūras filtrāta vai skābeņskābes standartšķīduma), 0,11 ml bromfenola zilā (BPB, 1 mM; Fisher Chemical, Pittsburgh, PA, ASV), 0,198 ml 1 M sērskābes (H2SO4; Al-Gomhoria Pharmaceuticals and Medical Supplies, Cairo, Ēģipte) un 0,176 ml 100 mM kālija dihromāta (K2Cr2O7; TCI chemicals, Portland, OR, ASV), un pēc tam šķīdumu atšķaidīja līdz 4,8 ml ar destilētu ūdeni, enerģiski samaisīja un nekavējoties ievietoja 60 °C ūdens vannā. Pēc 10 minūtēm reakciju apturēja, pievienojot 0,5 ml nātrija hidroksīda šķīduma (NaOH; 0,75 M). Reakcijas maisījuma absorbcija (A600) tika mērīta pie 600 nm, izmantojot UV-160 spektrofotometru (Shimadzu Corporation, Japāna). PDB un destilēts ūdens tika izmantoti kā kontroles attiecīgi kultūras filtrātu un augu paraugu kvantitatīvai noteikšanai. Skābeņskābes koncentrācija kultūras filtrātos, izteikta kā skābeņskābes mikrogrami uz mililitru PDB barotnes (μg.mL−1), un lapu ekstraktos, izteikta kā skābeņskābes mikrogrami uz gramu svaiga svara (μg.g−1 FW), tika noteikta, izmantojot skābeņskābes kalibrēšanas līkni (Thermo Fisher Scientific Chemicals, Waltham, MA, ASV).
Visā pētījumā visi eksperimenti tika plānoti pilnībā randomizētā dizainā (CRD) ar sešiem bioloģiskiem atkārtojumiem katrā apstrādē un pieciem podiem katrā bioloģiskajā atkārtojumā (divi augi katrā podā), ja vien nav norādīts citādi. Bioloģiskie atkārtojumi tika analizēti divos eksemplāros (divi tehniskie atkārtojumi). Tehniskie atkārtojumi tika izmantoti, lai pārbaudītu viena un tā paša eksperimenta reproducējamību, bet netika izmantoti statistiskajā analīzē, lai izvairītos no viltus atkārtojumiem. Dati tika statistiski analizēti, izmantojot dispersijas analīzi (ANOVA), kam sekoja Tukey-Kramera godīgi nozīmīgas atšķirības (HSD) tests (p ≤ 0,05). In vitro eksperimentiem IC50 un IC99 vērtības tika aprēķinātas, izmantojot probita modeli, un tika aprēķināti 95% ticamības intervāli.
Kopumā četri izolāti tika savākti no dažādiem sojas pupiņu laukiem El Gabijas guberņā, Ēģiptē. Uz PDA barotnes visi izolāti veidoja krēmīgi baltu micēliju, kas ātri kļuva vatei balts (1.A attēls) un pēc tam sklerocija stadijā bēšs vai brūns. Sklerocijas parasti ir blīvas, melnas, sfēriskas vai neregulāras formas, 5,2 līdz 7,7 mm garas un 3,4 līdz 5,3 mm diametrā (1.B attēls). Lai gan četriem izolātiem pēc 10–12 dienu inkubācijas 25 ± 2 °C temperatūrā barotnes malā izveidojās sklerociju margināls raksts (1.A attēls), sklerociju skaits uz vienu plati starp tiem bija ievērojami atšķirīgs (P < 0,001), un 3. izolātam bija vislielākais sklerociju skaits (32,33 ± 1,53 sklerocijas uz vienu plati; 1.C attēls). Līdzīgi, 3. izolāts PDB producēja vairāk skābeņskābes nekā citi izolāti (3,33 ± 0,49 μg.mL−1; 1. att. D). 3. izolātam bija raksturīgas fitopatogēnās sēnītes Sclerotinia sclerotiorum tipiskās morfoloģiskās un mikroskopiskās īpašības. Piemēram, uz PDA 3. izolāta kolonijas strauji auga, bija krēmīgi baltas (1. attēls A), apgriezti bēšas vai gaiši lašu dzeltenbrūnas, un tām bija nepieciešamas 6–7 dienas 25 ± 2 °C temperatūrā, lai pilnībā pārklātu 9 cm diametra plāksnes virsmu. Pamatojoties uz iepriekš minētajām morfoloģiskajām un mikroskopiskajām īpašībām, 3. izolāts tika identificēts kā Sclerotinia sclerotiorum.
1. attēls. S. sclerotiorum izolātu raksturojums un patogenitāte no parastajiem pākšaugiem. (A) Četru S. sclerotiorum izolātu micēlija augšana uz PDA barotnes, (B) četru S. sclerotiorum izolātu sklerociju skaits, (C) sklerociju skaits (uz plates), (D) skābeņskābes sekrēcija uz PDB barotnes (μg.mL−1) un (E) četru S. sclerotiorum izolātu slimības smaguma pakāpe (%) uz uzņēmīgas komerciālās pākšaugu šķirnes Giza 3 siltumnīcas apstākļos. Vērtības atspoguļo piecu bioloģisko atkārtojumu vidējo vērtību ± SD (n = 5). Dažādi burti norāda statistiski nozīmīgas atšķirības starp apstrādēm (p < 0,05). (F–H) Tipiski baltās pelējuma simptomi parādījās attiecīgi uz virszemes stublājiem un zariņiem 10 dienas pēc inokulācijas ar 3. izolātu (dpi). (I) S. sclerotiorum izolāta Nr. 3 iekšējās transkripcijas starplikas (ITS) reģiona evolūcijas analīze tika veikta, izmantojot maksimālās ticamības metodi, un salīdzināta ar 20 references izolātiem/celmiem, kas iegūti no Nacionālā biotehnoloģijas informācijas centra (NCBI) datubāzes (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Skaitļi virs klasterizācijas līnijām norāda reģiona pārklājumu (%), un skaitļi zem klasterizācijas līnijām norāda zara garumu.
Turklāt, lai apstiprinātu patogenitāti, četri iegūtie S. sclerotiorum izolāti tika izmantoti, lai siltumnīcas apstākļos inokulētu uzņēmīgo komerciālo pupiņu šķirni Giza 3, kas atbilst Koha postulātiem (1.E attēls). Lai gan visi iegūtie sēnīšu izolāti bija patogēni un varēja inficēt zaļās pupiņas (šķirne Giza 3), izraisot tipiskus baltās pelējuma simptomus uz visām virszemes daļām (1.F attēls), īpaši uz kātiem (1.G attēls) un pākstīm (1.H attēls) 10 dienas pēc inokulācijas (dpi), 3. izolāts bija agresīvākais divos neatkarīgos eksperimentos. 3. izolātam bija visaugstākā slimības smaguma pakāpe (%) uz pupiņu augiem (attiecīgi 24,0 ± 4,0, 58,0 ± 2,0 un 76,7 ± 3,1 7, 14 un 21 dienu pēc inficēšanas; 1.F attēls).
Visinvazīvākā S. sclerotiorum izolāta Nr. 3 identifikācija tika papildus apstiprināta, pamatojoties uz iekšējās transkripcijas starplikas (ITS) sekvencēšanu (1. att.). Filoģenētiskā analīze starp izolātu Nr. 3 un 20 references izolātiem/celmiem uzrādīja augstu līdzību (>99 %) starp tiem. Jāatzīmē, ka S. sclerotiorum izolātam Nr. 3 (533 bp) ir augsta līdzība ar Amerikas S. sclerotiorum izolātu LPM36, kas izolēts no sausām zirņu sēklām (GenBank piekļuves numurs MK896659.1; 540 bp), un Ķīnas S. sclerotiorum izolātu YKY211 (GenBank piekļuves numurs OR206374.1; 548 bp), kas izraisa vijolīšu (Matthiola incana) stublāju puvi, un tie visi ir grupēti atsevišķi dendrogrammas augšdaļā (1. att.). Jaunā secība ir deponēta NCBI datubāzē un nosaukta par “Sclerotinia sclerotiorum – izolāts YN-25” (GenBank piekļuves numurs PV202792). Var redzēt, ka 3. izolāts ir visinvazīvākais izolāts; tāpēc šis izolāts tika izvēlēts pētījumam visos turpmākajos eksperimentos.
Diamīna L-ornitīna (Sigma-Aldrich, Darmštate, Vācija) antibakteriālā aktivitāte dažādās koncentrācijās (12,5, 25, 50, 75, 100 un 125 mg/l) pret S. sclerotiorum izolātu 3 tika pētīta in vitro. Jāatzīmē, ka L-ornitīnam bija antibakteriāla iedarbība un tas pakāpeniski inhibēja S. sclerotiorum hifu radiālo augšanu devas atkarīgā veidā (2.A, B attēls). Augstākajā testētajā koncentrācijā (125 mg/l) L-ornitīns uzrādīja visaugstāko micēlija augšanas inhibīcijas līmeni (99,62 ± 0,27%; 2.B attēls), kas bija līdzvērtīgs komerciālā fungicīda Rizolex-T (inhibīcijas līmenis 99,45 ± 0,39%; 2.C attēls) augstākajā testētajā koncentrācijā (10 mg/l), norādot uz līdzīgu efektivitāti.
2. attēls. L-ornitīna antibakteriālā aktivitāte in vitro pret Sclerotinia sclerotiorum. (A) Dažādu L-ornitīna koncentrāciju antibakteriālās aktivitātes salīdzinājums pret S. sclerotiorum ar komerciālo fungicīdu Rizolex-T (10 mg/l). (B, C) S. sclerotiorum micēlija augšanas inhibīcijas ātrums (%) pēc apstrādes ar dažādām L-ornitīna koncentrācijām (12,5, 25, 50, 75, 100 un 125 mg/l) vai Rizolex-T (2, 4, 6, 8 un 10 mg/l). Vērtības atspoguļo piecu bioloģisko atkārtojumu vidējo vērtību ± standartnovirzi (n = 5). Dažādi burti apzīmē statistiskās atšķirības starp apstrādēm (p < 0,05). (D, E) L-ornitīna un komerciālā fungicīda Rizolex-T probita modeļa regresijas analīze. Probit modeļa regresijas līnija ir attēlota kā nepārtraukta zila līnija, un ticamības intervāls (95%) ir attēlots kā pārtraukta sarkana līnija.
Turklāt tika veikta probita regresijas analīze, un atbilstošie grafiki ir parādīti 1. tabulā un 2.D un E attēlos. Īsumā, L-ornitīna pieņemamā slīpuma vērtība (y = 2,92x − 4,67) un saistītā nozīmīgā statistika (Cox & Snell R2 = 0,3709, Nagelkerke R2 = 0,4998 un p < 0,0001; 2.D attēls) norādīja uz pastiprinātu pretsēnīšu aktivitāti pret S. sclerotiorum, salīdzinot ar komerciālo fungicīdu Rizolex-T (y = 1,96x − 0,99, Cox & Snell R2 = 0,1242, Nagelkerke R2 = 0,1708 un p < 0,0001) (1. tabula).
1. tabula. L-ornitīna un komerciālā fungicīda “Rizolex-T” pusmaksimālās inhibējošās koncentrācijas (IC50) un IC99 (mg/l) vērtības pret S. sclerotiorum.
Kopumā L-ornitīns (250 mg/l) ievērojami samazināja baltās pelējuma attīstību un smagumu apstrādātajos parasto pupiņu augos, salīdzinot ar neapstrādātiem ar S. sclerotiorum inficētiem augiem (kontrole; 3.A attēls). Īsumā, lai gan neapstrādātu inficētu kontroles augu slimības smagums pakāpeniski palielinājās (52,67 ± 1,53, 83,21 ± 2,61 un 92,33 ± 3,06%), L-ornitīns ievērojami samazināja slimības smagumu (%) visā eksperimentā (8,97 ± 0,15, 18,00 ± 1,00 un 26,36 ± 3,07) attiecīgi 7, 14 un 21 dienu pēc apstrādes (dpt) (3.A attēls). Līdzīgi, kad ar S. sclerotiorum inficētos pupiņu augus apstrādāja ar 250 mg/L L-ornitīna, laukums zem slimības progresēšanas līknes (AUDPC) samazinājās no 1274,33 ± 33,13 neapstrādātajā kontrolē līdz 281,03 ± 7,95, kas bija nedaudz zemāks nekā pozitīvās kontroles 50 mg/L Rizolex-T fungicīdam (183,61 ± 7,71; 3.B att.). Tā pati tendence tika novērota arī otrajā eksperimentā.
3. att. L-ornitīna eksogēna lietošanas ietekme uz parasto pupiņu baltās puves attīstību, ko izraisa Sclerotinia sclerotiorum, siltumnīcas apstākļos. (A) Parasto pupiņu baltās pelējuma slimības progresēšanas līkne pēc apstrādes ar 250 mg/L L-ornitīna. (B) Parasto pupiņu baltās pelējuma laukums zem slimības progresēšanas līknes (AUDPC) pēc apstrādes ar L-ornitīnu. Vērtības atspoguļo piecu bioloģisko atkārtojumu vidējo vērtību ± standartnovirzi (n = 5). Dažādi burti apzīmē statistiski nozīmīgas atšķirības starp apstrādēm (p < 0,05).
Eksogēna 250 mg/l L-ornitīna lietošana pakāpeniski palielināja auga augstumu (4.A att.), zaru skaitu uz auga (4.B att.) un lapu skaitu uz auga (4.C att.) pēc 42 dienām. Lai gan komerciālajam fungicīdam Rizolex-T (50 mg/l) bija vislielākā ietekme uz visiem pētītajiem uztura parametriem, eksogēna 250 mg/l L-ornitīna lietošana bija otra lielākā ietekme, salīdzinot ar neapstrādātu kontroli (4.A–C att.). No otras puses, L-ornitīna apstrādei nebija būtiskas ietekmes uz fotosintēzes pigmentu hlorofila a (4.D att.) un hlorofila b (4.E att.) saturu, bet nedaudz palielināja kopējo karotinoīdu saturu (0,56 ± 0,03 mg/g no svara), salīdzinot ar negatīvo kontroli (0,44 ± 0,02 mg/g no svara) un pozitīvo kontroli (0,46 ± 0,02 mg/g no svara; 4.F att.). Kopumā šie rezultāti liecina, ka L-ornitīns nav fitotoksisks apstrādātajiem pākšaugiem un var pat stimulēt to augšanu.
4. att. Eksogēna L-ornitīna lietošanas ietekme uz Sclerotinia sclerotiorum inficētu pupiņu lapu augšanas īpašībām un fotosintēzes pigmentiem siltumnīcas apstākļos. (A) Auga augstums (cm), (B) Zarotu skaits uz auga, (C) Lapu skaits uz auga, (D) Hlorofila a saturs (mg g-1 fr wt), (E) Hlorofila b saturs (mg g-1 fr wt), (F) Kopējais karotinoīdu saturs (mg g-1 fr wt). Vērtības ir piecu bioloģisko atkārtojumu vidējais rādītājs ± SD (n = 5). Dažādi burti norāda statistiski nozīmīgas atšķirības starp apstrādēm (p < 0,05).
Reaktīvo skābekļa sugu (ROS; izteiktas kā ūdeņraža peroksīds [H2O2]) un brīvo radikāļu (izteikti kā superoksīda anjoni [O2•−]) histoķīmiskā lokalizācija in situ atklāja, ka L-ornitīna (250 mg/l) eksogēna lietošana ievērojami samazināja H2O2 (96,05 ± 5,33 nmol.g−1 FW; 5.A att.) un O2•− (32,69 ± 8,56 nmol.g−1 FW; 5.B att.) uzkrāšanos, salīdzinot ar gan neapstrādātu inficētu augu (attiecīgi 173,31 ± 12,06 un 149,35 ± 7,94 nmol.g−1 FW), gan augu, kas apstrādāti ar 50 mg/l komerciālā fungicīda Rizolex-T (attiecīgi 170,12 ± 9,50 un 157,00 ± 7,81 nmol.g−1 fr wt) uzkrāšanos 72 stundu laikā. Augsts H2O2 un O2•− līmenis uzkrājās hpt apstākļos (5.A, B att.). Līdzīgi, TCA bāzes malondialdehīda (MDA) tests parādīja, ka ar S. sclerotiorum inficētie pupiņu augi uzkrāja augstāku MDA līmeni (113,48 ± 10,02 nmol.g fr wt) savās lapās (5.C att.). Tomēr L-ornitīna eksogēna lietošana ievērojami samazināja lipīdu peroksidāciju, ko apliecina MDA satura samazināšanās apstrādātajos augos (33,08 ± 4,00 nmol.g fr wt).
5. att. Eksogēnā L-ornitīna lietošanas ietekme uz galvenajiem oksidatīvā stresa marķieriem un neenzimātiskiem antioksidantu aizsardzības mehānismiem pupiņu lapās, kas inficētas ar S. sclerotiorum 72 stundas pēc inficēšanas siltumnīcas apstākļos. (A) Ūdeņraža peroksīds (H2O2; nmol g−1 FW) pie 72 hpt, (B) superoksīda anjons (O2•−; nmol g−1 FW) pie 72 hpt, (C) malondialdehīds (MDA; nmol g−1 FW) pie 72 hpt, (D) kopējie šķīstošie fenoli (mg GAE g−1 FW) pie 72 hpt, (E) kopējie šķīstošie flavonoīdi (mg RE g−1 FW) pie 72 hpt, (F) kopējie brīvie aminoskābju daudzumi (mg g−1 FW) pie 72 hpt un (G) prolīna saturs (mg g−1 FW) pie 72 hpt. Vērtības atspoguļo piecu bioloģisko atkārtojumu vidējo vērtību ± standartnovirzi (vidējais ± SD) (n = 5). Dažādi burti norāda statistiski nozīmīgas atšķirības starp apstrādes metodēm (p < 0,05).