Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai izslēgt saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiks attēlota bez stiliem un JavaScript.
Insulīna nanodaļiņas (NP) ar augstu pildījuma saturu ir atradušas dažādus pielietojumus dažādās zāļu formās. Šī darba mērķis ir novērtēt saldēšanas žāvēšanas un izsmidzināšanas žāvēšanas procesu ietekmi uz ar insulīnu pildītu hitīna nanodaļiņu struktūru ar vai bez mannīta kā krioprotektanta. Mēs arī novērtējām šo nanodaļiņu kvalitāti, tās atkārtoti izšķīdinot. Pirms dehidratācijas hitīna/nātrija tripolifosfāta/insulīna šķērssaistīto nanodaļiņu daļiņu izmērs tika optimizēts līdz 318 nm, PDI bija 0,18, iekapsulēšanas efektivitāte bija 99,4% un pildījums bija 25,01%. Pēc rekonstitūcijas visas nanodaļiņas, izņemot tās, kas ražotas ar saldēšanas žāvēšanas metodi, neizmantojot mannītu, saglabāja savu sfērisko daļiņu struktūru. Salīdzinot ar mannītu saturošām nanodaļiņām, kas dehidrētas ar jebkuru no izsmidzināšanas metodēm, mannītu nesaturošas izsmidzinātas nanodaļiņas uzrādīja arī mazāko vidējo daļiņu izmēru (376 nm) un augstāko pildījuma saturu (25,02%) ar līdzīgu iekapsulēšanas ātrumu (98,7%) un PDI (0,20), žāvējot. vai saldžāvēšanas metodes. Žāvētas nanodaļiņas, žāvējot ar izsmidzināšanas žāvēšanu bez mannīta, arī nodrošināja visātrāko insulīna izdalīšanos un visaugstāko šūnu uzņemšanas efektivitāti. Šis darbs parāda, ka izsmidzināšanas žāvēšana var dehidrēt insulīna nanodaļiņas bez nepieciešamības pēc krioprotektantiem, salīdzinot ar tradicionālajām saldžāvēšanas metodēm, radot lielāku iekraušanas jaudu, zemākas piedevu prasības un ekspluatācijas izmaksas, kas sniedz ievērojamas priekšrocības.
Kopš atklāšanas 1922. gadā1,2,3 insulīns un tā farmaceitiskie preparāti ir glābuši pacientu ar 1. tipa cukura diabētu (1. tipa cukura diabētu) un 2. tipa cukura diabētu (1. tipa cukura diabētu) dzīvības. Tomēr, pateicoties tā īpašībām kā augstas molekulmasas olbaltumvielai, insulīns viegli agregējas, sadalās proteolītisko enzīmu ietekmē un izvadās pirmā loka efekta rezultātā. Cilvēkiem, kuriem diagnosticēts 1. tipa cukura diabēts, insulīna injekcijas ir nepieciešamas visu atlikušo mūžu. Daudziem pacientiem, kuriem sākotnēji diagnosticēts 2. tipa cukura diabēts, ir nepieciešamas arī ilgstošas ​​insulīna injekcijas. Ikdienas insulīna injekcijas šiem cilvēkiem rada nopietnus ikdienas sāpju un diskomforta avotus, negatīvi ietekmējot garīgo veselību. Tā rezultātā tiek plaši pētītas citas insulīna ievadīšanas formas, kas rada mazāku diskomfortu, piemēram, iekšķīgi lietojama insulīna ievadīšana,5 jo tām ir potenciāls atjaunot aptuveni 5 miljardu cilvēku ar diabētu dzīves kvalitāti visā pasaulē.
Nanodaļiņu tehnoloģija ir sniegusi ievērojamu progresu mēģinājumos lietot iekšķīgi lietojamu insulīnu4,6,7. Tādu, kas efektīvi iekapsulē un aizsargā insulīnu no degradācijas, lai to varētu mērķtiecīgi piegādāt noteiktām ķermeņa vietām. Tomēr nanodaļiņu formulējumu lietošanai ir vairāki ierobežojumi, galvenokārt daļiņu suspensiju stabilitātes problēmu dēļ. Uzglabāšanas laikā var notikt zināma agregācija, kas samazina ar insulīnu pildītu nanodaļiņu biopieejamību8. Turklāt, lai nodrošinātu insulīna nanodaļiņu (NP) stabilitāti, jāņem vērā arī nanodaļiņu un insulīna polimēru matricas ķīmiskā stabilitāte. Pašlaik saldēšanas žāvēšanas tehnoloģija ir zelta standarts stabilu NP radīšanai, vienlaikus novēršot nevēlamas izmaiņas uzglabāšanas laikā9.
Tomēr saldēšanas žāvēšanai ir nepieciešams pievienot krioprotektantus, lai novērstu NP sfēriskās struktūras ietekmi uz ledus kristālu mehānisko spriegumu. Tas ievērojami samazina insulīna nanodaļiņu daudzumu pēc liofilizācijas, jo krioprotektants aizņem lielāko daļu svara attiecības. Tādēļ saražotās insulīna NP bieži vien ir nepiemērotas sauso pulveru zāļu formu, piemēram, iekšķīgi lietojamu tablešu un iekšķīgi lietojamu plēvju, ražošanai, jo ir nepieciešams liels daudzums sausu nanodaļiņu, lai sasniegtu insulīna terapeitisko logu.
Izsmidzināšanas žāvēšana ir labi pazīstams un lēts rūpnieciska mēroga process sausu pulveru ražošanai no šķidrajām fāzēm farmācijas rūpniecībā10,11. Daļiņu veidošanās procesa kontrole ļauj pareizi iekapsulēt vairākus bioaktīvus savienojumus12, 13. Turklāt tā ir kļuvusi par efektīvu metodi iekapsulētu olbaltumvielu sagatavošanai iekšķīgai lietošanai. Izsmidzināšanas žāvēšanas laikā ūdens ļoti ātri iztvaiko, kas palīdz uzturēt zemu daļiņu kodola temperatūru11,14, ļaujot to izmantot siltumjutīgu komponentu iekapsulēšanai. Pirms izsmidzināšanas žāvēšanas pārklājuma materiāls ir rūpīgi jāhomogenizē ar šķīdumu, kas satur iekapsulētās sastāvdaļas11,14. Atšķirībā no saldēšanas žāvēšanas, homogenizācija pirms iekapsulēšanas izsmidzināšanas žāvēšanā uzlabo iekapsulēšanas efektivitāti dehidratācijas laikā. Tā kā izsmidzināšanas žāvēšanas iekapsulēšanas procesam nav nepieciešami krioaizsardzības līdzekļi, izsmidzināšanas žāvēšanu var izmantot, lai iegūtu žāvētas NP ar augstu pildvielu saturu.
Šajā pētījumā ziņots par insulīnu saturošu nanodaļiņu ražošanu, izmantojot hitīna un nātrija tripolifosfāta šķērssaistīšanu, izmantojot jonu gela metodi. Jonu gelēšana ir sagatavošanas metode, kas ļauj ražot nanodaļiņas, izmantojot elektrostatisku mijiedarbību starp divām vai vairākām jonu sugām noteiktos apstākļos. Optimizēto hitīna/nātrija tripolifosfāta/insulīna šķērssaistīto nanodaļiņu dehidratācijai tika izmantotas gan saldēšanas, gan izsmidzināšanas žāvēšanas metodes. Pēc dehidratācijas to morfoloģija tika analizēta ar SEM. To rekombinācijas spēja tika novērtēta, izmērot to izmēru sadalījumu, virsmas lādiņu, PDI, iekapsulēšanas efektivitāti un ielādes saturu. Ar dažādām dehidratācijas metodēm iegūto atkārtoti izšķīdināto nanodaļiņu kvalitāte tika novērtēta arī, salīdzinot to insulīna aizsardzību, atbrīvošanās uzvedību un šūnu uzņemšanas efektivitāti.
Sajauktā šķīduma pH un hitīna un insulīna attiecība ir divi galvenie faktori, kas ietekmē galīgo NP daļiņu izmēru un iekapsulēšanas efektivitāti (EE), jo tie tieši ietekmē jonotropisko želejveida procesu. Sajauktā šķīduma pH ir ļoti korelēts ar daļiņu izmēru un iekapsulēšanas efektivitāti (1.a att.). Kā parādīts 1.a attēlā, palielinoties pH no 4,0 līdz 6,0, vidējais daļiņu izmērs (nm) samazinājās un EE ievērojami palielinājās, savukārt, palielinoties pH līdz 6,5, vidējais daļiņu izmērs sāka palielināties un EE palika nemainīgs. Palielinoties hitīna un insulīna attiecībai, palielinās arī vidējais daļiņu izmērs. Turklāt EE izmaiņas netika novērotas, kad nanodaļiņas tika sagatavotas ar hitīna/insulīna masas attiecību, kas pārsniedza 2,5:1 (m/m) (1.b att.). Tāpēc šajā pētījumā optimālie sagatavošanas apstākļi (pH 6,0, hitīna/insulīna masas attiecība 2,5:1) tika izmantoti, lai sagatavotu ar insulīnu pildītus preparātus. nanodaļiņas tālākai izpētei. Šādos sagatavošanas apstākļos insulīna nanodaļiņu vidējais daļiņu izmērs tika optimizēts līdz 318 nm (1.c attēls), PDI bija 0,18, iestrādāšanas efektivitāte bija 99,4%, zeta potenciāls bija 9,8 mv un insulīna slodze bija 25,01% (m/m). Pamatojoties uz transmisijas elektronu mikroskopijas (TEM) rezultātiem, optimizētās nanodaļiņas bija aptuveni sfēriskas un atsevišķas ar relatīvi vienādu izmēru (1.d attēls).
Insulīna nanodaļiņu parametru optimizācija: (a) pH ietekme uz insulīna nanodaļiņu vidējo diametru un iekapsulēšanas efektivitāti (EE) (sagatavotas ar hitīna un insulīna masas attiecību 5:1); (b) hitīns un insulīna masas attiecības ietekme uz insulīna nanodaļiņu vidējo diametru un iekapsulēšanas efektivitāti (EE) (sagatavotas ar pH 6); (c) optimizēto insulīna nanodaļiņu daļiņu izmēra sadalījums; (d) optimizēto insulīna nanodaļiņu TEM mikroattēls.
Ir labi zināms, ka hitīns ir vājš polielektrolīts ar pKa 6,5. Skābā vidē tas ir pozitīvi lādēts, jo tā galveno aminogrupu protonē ūdeņraža joni15. Tāpēc to bieži izmanto kā nesēju negatīvi lādētu makromolekulu iekapsulēšanai. Šajā pētījumā hitīns tika izmantots insulīna iekapsulēšanai ar izoelektrisko punktu 5,3. Tā kā hitīns tiek izmantots kā pārklājuma materiāls, palielinoties tā proporcijai, attiecīgi palielinās nanodaļiņu ārējā slāņa biezums, kā rezultātā palielinās vidējais daļiņu izmērs. Turklāt augstāks hitīna līmenis var iekapsulēt vairāk insulīna. Mūsu gadījumā EE bija visaugstākais, kad hitīna un insulīna attiecība sasniedza 2,5:1, un EE būtiskas izmaiņas netika novērotas, kad attiecība turpināja pieaugt.
Papildus hitīna un insulīna attiecībai, arī pH bija izšķiroša loma NP sagatavošanā. Gan et al.17 pētīja pH ietekmi uz hitīna nanodaļiņu daļiņu izmēru. Viņi konstatēja nepārtrauktu daļiņu izmēra samazināšanos, līdz pH sasniedza 6,0, un ievērojams daļiņu izmēra pieaugums tika novērots pie pH > 6,0, kas atbilst mūsu novērojumiem. Šī parādība ir saistīta ar faktu, ka, palielinoties pH, insulīna molekula iegūst negatīvu virsmas lādiņu, tādējādi veicinot elektrostatisko mijiedarbību ar hitīna/nātrija tripolifosfāta (TPP) kompleksu, kā rezultātā rodas mazs daļiņu izmērs un augsts EE. Tomēr, kad pH tika noregulēts līdz 6,5, hitīna aminogrupas tika deprotonētas, kā rezultātā hitīns locījās. Tādējādi augsts pH samazina aminoskābju jonu iedarbību uz TPP un insulīnu, kā rezultātā samazinās šķērssaistīšanās, palielinās galīgais vidējais daļiņu izmērs un samazinās EE.
Liofilizētu un izsmidzinot žāvētu NP morfoloģisko īpašību analīze var palīdzēt izvēlēties labākas dehidratācijas un pulvera veidošanas metodes. Vēlamajai metodei jānodrošina zāļu stabilitāte, vienmērīga daļiņu forma, augsta zāļu koncentrācija un laba šķīdība sākotnējā šķīdumā. Šajā pētījumā, lai labāk salīdzinātu abas metodes, dehidratācijas laikā tika izmantotas insulīna NP ar vai bez 1% mannīta. Mannīts tiek izmantots kā pildviela vai krioprotektants dažādās sausās pulvera formulās saldžāvēšanai un izsmidzināšanas žāvēšanai. Liofilizētām insulīna nanodaļiņām bez mannīta, kā parādīts 2.a attēlā, skenējošās elektronu mikroskopijas (SEM) laikā tika novērota ļoti poraina pulvera struktūra ar lielām, neregulārām un raupjām virsmām. Pēc dehidratācijas pulverī tika konstatētas dažas atsevišķas daļiņas (2.e attēls). Šie rezultāti liecināja, ka lielākā daļa NP sadalījās saldžāvēšanas laikā bez jebkāda krioprotektanta. Liofilizētām un izsmidzinot žāvētām insulīna nanodaļiņām, kas satur 1% mannīta, tika novērotas sfēriskas nanodaļiņas ar gludām virsmām (2.b, d, f, h attēls). Bez mannīta izsmidzinot žāvētas insulīna nanodaļiņas palika sfēriskas, bet uz virsmas bija grumbainas. (2.c att.). Sfēriskas un grumbainas virsmas ir sīkāk aplūkotas atbrīvošanās uzvedības un šūnu uzņemšanas testos zemāk. Pamatojoties uz žāvēto NP redzamo izskatu, gan izsmidzinot žāvētas NP bez mannīta, gan saldējot žāvētas un izsmidzinot žāvētas NP ar mannītu deva smalkus NP pulverus (2.f, g, h att.). Jo lielāka ir virsmas laukums starp daļiņu virsmām, jo ​​lielāka ir šķīdība un līdz ar to lielāks atbrīvošanās ātrums.
Dažādu dehidrētu insulīna NP morfoloģija: (a) liofilizētu insulīna NP SEM attēls bez mannīta; (b) liofilizētu insulīna NP SEM attēls ar mannītu; (c) izsmidzinot žāvētas insulīna NP bez mannīta; (d) ar mannītu izsmidzinot žāvētu insulīna NP SEM attēls; (e) liofilizēta insulīna NP pulvera attēls bez mannīta; (f) liofilizētu insulīna NP attēls ar mannītu; (g) izsmidzinot žāvētu insulīna NP pulvera attēls bez mannīta; (h) izsmidzinot žāvētu insulīna NP pulvera attēls ar mannītu.
Saldžāvēšanas laikā mannitols darbojas kā krioaizsardzības līdzeklis, saglabājot NP amorfā formā un novēršot ledus kristālu radītos bojājumus19. Turpretī izsmidzināšanas žāvēšanas laikā nav sasaldēšanas posma. Tāpēc šajā metodē mannitols nav nepieciešams. Faktiski, izsmidzināšanas žāvēšanas procesā iegūtās NP bez mannīta deva smalkākas NP, kā aprakstīts iepriekš. Tomēr mannitols joprojām var darboties kā pildviela izsmidzināšanas žāvēšanas procesā, piešķirot NP sfēriskāku struktūru20 (2.d att.), kas palīdz panākt vienmērīgu šādu iekapsulētu NP atbrīvošanās uzvedību. Turklāt ir skaidrs, ka gan saldējot žāvētās, gan izsmidzināšanas žāvēšanas procesā iegūtās insulīna NP, kas satur mannītu, var noteikt dažas lielas daļiņas (2.b,d att.), kas var būt saistīts ar mannīta uzkrāšanos daļiņu kodolā kopā ar iekapsulēto insulīnu. Hitozāna slānis. Jāatzīmē, ka šajā pētījumā, lai nodrošinātu sfēriskās struktūras saglabāšanos pēc dehidratācijas, mannīta un hitozāna attiecība tiek saglabāta 5:1, lai liels pildvielas daudzums varētu palielināt arī žāvēto NP daļiņu izmēru.
Furjē transformācijas infrasarkanās vājinātās kopējās atstarošanas (FTIR-ATR) spektroskopija raksturoja brīvā insulīna, hitīna, hitīna, TPP un insulīna fizikālo maisījumu. Visas dehidrētās NP tika raksturotas, izmantojot FTIR-ATR spektroskopiju. Jāatzīmē, ka kapsulētās NP, kas žāvētas saldējot ar mannītu, un NP, kas žāvētas ar izsmidzināšanu ar mannītu un bez tā, tika novērota joslu intensitāte 1641, 1543 un 1412 cm-1 (3. att.). Kā jau iepriekš ziņots, šis stipruma pieaugums bija saistīts ar šķērssaistīšanu starp hitīnu, TPP un insulīnu. Hitīna un insulīna mijiedarbības pētījums parādīja, ka ar insulīnu pildītu hitīna nanodaļiņu FTIR spektros hitīna josla pārklājās ar insulīna joslu, palielinot karbonilgrupas intensitātes (1641 cm-1) un amīna (1543 cm-1) joslu. TPP tripolifosfāta grupas ir saistītas ar amonija grupām hitīnā, veidojot joslu pie 1412 cm-1.
Brīvā insulīna, hitīna, hitīna/TPP/insulīna fizikālo maisījumu un ar dažādām metodēm dehidrētu NP FTIR-ATR spektri.
Turklāt šie rezultāti atbilst SEM rezultātiem, kas parādīja, ka iekapsulētās NP palika neskartas gan izsmidzinot, gan sasaldējot ar mannītu, bet bez mannīta tikai izsmidzināšanas žāvēšana radīja iekapsulētas daļiņas. Turpretī bez mannīta sasaldējot žāvētu NP FTIR-ATR spektra rezultāti bija ļoti līdzīgi hitīna, TPP un insulīna fizikālajam maisījumam. Šis rezultāts norāda, ka bez mannīta sasaldētās žāvētās NP vairs nav šķērssaites starp hitīnu, TPP un insulīnu. Liofilizācijas laikā bez krioprotektanta NP struktūra tika iznīcināta, ko var redzēt SEM rezultātos (2.a att.). Pamatojoties uz dehidrētu insulīna NP morfoloģiju un FTIR rezultātiem, rekonstitūcijas eksperimentos tika izmantotas tikai liofilizētas, izsmidzināšanas žāvētas un mannītu nesaturošas NP, bet mannītu nesaturošas NP - mannītu nesaturošu NP sadalīšanās dēļ dehidratācijas laikā. Apspriediet.
Dehidratāciju izmanto ilgstošai uzglabāšanai un pārstrādei citās zāļu formās. Sauso NP spēja atjaunoties pēc uzglabāšanas ir kritiski svarīga to izmantošanai dažādās zāļu formās, piemēram, tabletēs un plēvēs. Mēs ievērojām, ka izsmidzinātā žāvētā insulīna NP vidējais daļiņu izmērs bez mannīta pēc atšķaidīšanas palielinājās tikai nedaudz. No otras puses, izsmidzinātā žāvētā un liofilizētā insulīna nanodaļiņu izmērs ar mannītu ievērojami palielinājās (1. tabula). PDI un EE pēc visu NP rekombinācijas šajā pētījumā būtiski nemainījās (p > 0,05) (1. tabula). Šis rezultāts norāda, ka lielākā daļa daļiņu pēc atkārtotas izšķīdināšanas palika neskartas. Tomēr mannīta pievienošana ievērojami samazināja liofilizēto un izsmidzinātā žāvēto mannīta nanodaļiņu insulīna daudzumu (1. tabula). Turpretī izsmidzinātā žāvētā NP bez mannīta insulīna daudzums palika tāds pats kā iepriekš (1. tabula).
Ir labi zināms, ka nanodaļiņu slodze ir kritiski svarīga, ja tās tiek izmantotas zāļu piegādes nolūkos. NP ar zemu slodzi ir nepieciešams ļoti liels materiāla daudzums, lai sasniegtu terapeitisko slieksni. Tomēr tik augstu NP koncentrāciju augstā viskozitāte rada neērtības un grūtības attiecīgi iekšķīgi lietojot un injicējot zāļu formas 22. Turklāt insulīna NP var izmantot arī tablešu un viskozu bioplēvju 23, 24 pagatavošanai, kas prasa lielu NP daudzumu ar zemu slodzes līmeni, kā rezultātā rodas lielas tabletes un biezas bioplēves, kas nav piemērotas iekšķīgai lietošanai. Tāpēc dehidrētas NP ar augstu insulīna slodzi ir ļoti vēlamas. Mūsu rezultāti liecina, ka bez mannīta izsmidzināšanas žāvētu NP augstā insulīna slodze var piedāvāt daudzas pievilcīgas priekšrocības šīm alternatīvajām piegādes metodēm.
Visas dehidrētās NP trīs mēnešus tika turētas ledusskapī. SEM rezultāti parādīja, ka visu dehidrēto NP morfoloģija trīs mēnešu uzglabāšanas laikā būtiski nemainījās (4. att.). Pēc atšķaidīšanas ūdenī visām NP bija neliels EE samazinājums un trīs mēnešu uzglabāšanas laikā tās izdalīja aptuveni nelielu daudzumu (~5%) insulīna (2. tabula). Tomēr visu nanodaļiņu vidējais daļiņu izmērs palielinājās. Ar izsmidzinātu žāvētu NP bez mannīta daļiņu izmērs palielinājās līdz 525 nm, savukārt ar izsmidzinātu žāvētu un liofilizētu NP ar mannītu daļiņu izmērs palielinājās attiecīgi līdz 872 un 921 nm (2. tabula).
Trīs mēnešus uzglabātu dažādu dehidrētu insulīna NP morfoloģija: (a) liofilizētu insulīna NP ar mannītu SEM attēls; (b) izsmidzinot žāvētu insulīna nanodaļiņu SEM attēls bez mannīta; (c) izsmidzinot žāvētu insulīna NP SEM attēli bez mannīta.
Turklāt rekonstituētajās insulīna nanodaļiņās, kas žāvētas ar izsmidzinot ar mannītu un liofilizētas, tika novērotas nogulsnes (S2. att.). To var izraisīt lielas daļiņas, kas nav pareizi suspendētas ūdenī. Visi iepriekš minētie rezultāti liecina, ka izsmidzināšanas žāvēšanas tehnika var aizsargāt insulīna nanodaļiņas no dehidratācijas un ka lielu insulīna nanodaļiņu daudzumu var iegūt bez jebkādām pildvielām vai krioprotektantiem.
Insulīna aizture tika pārbaudīta pH = 2,5 vidē ar pepsīnu, tripsīnu un α-himotripsīnu, lai pierādītu NP aizsargājošo spēju pret fermentatīvu gremošanu pēc dehidratācijas. Dehidrētu NP insulīna aizture tika salīdzināta ar svaigi pagatavotu NP insulīna aizture, un brīvais insulīns tika izmantots kā negatīva kontrole. Šajā pētījumā brīvais insulīns uzrādīja ātru insulīna elimināciju 4 stundu laikā visās trijās fermentatīvajās apstrādēs (5.a–c att.). Turpretī insulīna eliminācijas tests ar mannītu saldēti žāvētām NP un ar mannītu vai bez tā izsmidzinot žāvētām NP parādīja ievērojami augstāku šo NP aizsardzību pret fermentatīvu gremošanu, kas bija līdzīga svaigi pagatavotu insulīna NP aizsardzībai (5.a–c att.). Ar pepsīna, tripsīna un α-himotripsīna nanodaļiņu palīdzību 4 stundu laikā varēja aizsargāt attiecīgi vairāk nekā 50%, 60% un 75% insulīna (5.a–c att.). Šī insulīna aizsargājošā spēja var palielināt lielākas insulīna absorbcijas iespējamību asinsritē25. Šie rezultāti liecina, ka izsmidzināšanas žāvēšana ar vai bez mannīta un saldēšanas žāvēšana ar mannītu var saglabāt NP insulīna aizsargājošo spēju pēc dehidratācijas.
Dehidrētu insulīna NP aizsardzības un atbrīvošanās uzvedība: (a) insulīna aizsardzība pepsīna šķīdumā; (b) insulīna aizsardzība tripsīna šķīdumā; (c) insulīna aizsardzība ar α-himotripsīna šķīdumu; (d) Dehidrētu NP atbrīvošanās uzvedība pH = 2,5 šķīdumā; (e) Dehidrētu NP atbrīvošanās uzvedība pH = 6,6 šķīdumā; (f) Dehidrētu NP atbrīvošanās uzvedība pH = 7,0 šķīdumā.
Svaigi pagatavotas un rekonstituētas sausās insulīna NP tika inkubētas dažādos buferšķīdumos (pH = 2,5, 6,6, 7,0) 37 °C temperatūrā, simulējot kuņģa, divpadsmitpirkstu zarnas un tievās zarnas augšdaļas pH vidi, lai pārbaudītu insulīna ietekmi uz insulīna rezistenci. Izdalīšanās uzvedība dažādās vidēs. Kuņģa-zarnu trakta fragments. Pie pH = 2,5 ar insulīnu pildītas NP un atkārtoti izšķīdinātas sausā insulīna NP sākotnēji uzrādīja strauju izdalīšanos pirmās stundas laikā, kam sekoja lēna izdalīšanās nākamo 5 stundu laikā (5.d att.). Šī straujā izdalīšanās sākumā, visticamāk, ir olbaltumvielu molekulu, kas nav pilnībā imobilizētas daļiņas iekšējā struktūrā, straujas virsmas desorbcijas rezultāts. Pie pH = 6,5 ar insulīnu pildītas NP un rekonstituētas sausā insulīna NP uzrādīja vienmērīgu un lēnu izdalīšanos 6 stundu laikā, jo testa šķīduma pH bija līdzīgs NP sagatavotā šķīduma pH (5.e att.). Pie pH = 7 NP bija nestabilas un gandrīz pilnībā sadalījās pirmo divu stundu laikā (5.f att.). Tas ir tāpēc, ka hitīna deprotonācija notiek augstākā pH līmenī, kā rezultātā veidojas mazāk kompakts polimēru tīkls un izdalās pildīts insulīns.
Turklāt insulīna NP, kas žāvētas ar izsmidzināšanu bez mannīta, uzrādīja ātrāku atbrīvošanās profilu nekā citas dehidrētās NP (5.d–f att.). Kā iepriekš aprakstīts, rekonstituētās insulīna NP, kas žāvētas bez mannīta, uzrādīja mazāko daļiņu izmēru. Mazas daļiņas nodrošina lielāku virsmas laukumu, tāpēc lielākā daļa attiecīgo zāļu atradīsies daļiņu virsmā vai tās tuvumā, kā rezultātā zāļu izdalīšanās būs ātra26.
NP citotoksicitāte tika pētīta ar MTT testu. Kā parādīts S4. attēlā, visām dehidrētajām NP nebija būtiskas ietekmes uz šūnu dzīvotspēju 50–500 μg/ml koncentrācijās, kas liecina, ka visas dehidrētās NP var droši izmantot, lai sasniegtu terapeitisko logu.
Aknas ir galvenais orgāns, caur kuru insulīns veic savas fizioloģiskās funkcijas. HepG2 šūnas ir cilvēka hepatomas šūnu līnija, ko parasti izmanto kā in vitro hepatocītu uzņemšanas modeli. Šeit HepG2 šūnas tika izmantotas, lai novērtētu NP šūnu uzņemšanu, kas dehidrētas, izmantojot saldēšanas žāvēšanas un izsmidzināšanas žāvēšanas metodes. Šūnu uzņemšana tika veikta ar konfokālu lāzera skenēšanu, izmantojot plūsmas citometriju un redzi, pēc vairāku stundu inkubācijas ar brīvu FITC insulīnu 25 μg/ml koncentrācijā, svaigi pagatavotām FITC insulīna piesātinātām NP un dehidrētām FITC insulīna piesātinātām NP vienādās insulīna koncentrācijās. Tika veikti kvantitatīvās mikroskopijas (CLSM) novērojumi. Liofilizētas NP bez mannīta dehidratācijas laikā tika iznīcinātas un šajā testā netika novērtētas. Svaigi pagatavotu ar insulīnu piesātinātu NP, liofilizētu NP ar mannītu un izsmidzināšanas žāvētu NP ar un bez mannīta (6.a att.) intracelulārās fluorescences intensitāte bija attiecīgi 4,3, 2,6, 2,4 un 4,1 reizes augstāka nekā brīvajām NP. FITC-insulīna grupā (6.b att.). Šīs Rezultāti liecina, ka iekapsulēts insulīns ir spēcīgāks šūnu uzņemšanā nekā brīvais insulīns, galvenokārt pētījumā saražoto insulīnu saturošo nanodaļiņu mazākā izmēra dēļ.
HepG2 šūnu uzņemšana pēc 4 stundu inkubācijas ar svaigi pagatavotām NP un dehidrētām NP: (a) FITC-insulīna uzņemšanas sadalījums HepG2 šūnās. (b) Fluorescences intensitātes ģeometriskais vidējais, kas analizēts ar plūsmas citometriju (n = 3), *P < 0,05, salīdzinot ar brīvo insulīnu.
Tāpat CLSM attēli parādīja, ka svaigi pagatavotu ar FITC insulīnu piesātinātu NP un ar FITC insulīnu piesātinātu izsmidzinot žāvētu NP (bez mannīta) FITC fluorescences intensitāte bija daudz spēcīgāka nekā citiem paraugiem (6.a att.). Turklāt, pievienojot mannītu, šķīduma augstākā viskozitāte palielināja rezistenci pret šūnu uzņemšanu, kā rezultātā samazinājās insulīna proliferācija. Šie rezultāti liecina, ka bez mannīta izsmidzinot žāvētām NP bija visaugstākā šūnu uzņemšanas efektivitāte, jo to daļiņu izmērs bija mazāks nekā liofilizētām NP pēc atkārtotas izšķīdināšanas.
Hitīns (vidējā molekulmasa 100 kDa, 75–85% deacetilēts) tika iegādāts no Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanāda). Nātrija tripolifosfāts (TPP) tika iegādāts no VWR (Radnor, Pennsylvania, ASV). Šajā pētījumā izmantotais rekombinantā cilvēka insulīns bija no Fisher Scientific (Waltham, MA, ASV). Ar fluoresceīna izotiocianātu (FITC) iezīmēts cilvēka insulīns un 4',6-diamidino-2-fenilindola dihidrohlorīds (DAPI) tika iegādāti no Sigma-Aldrich (Oakville, Ontario, Kanāda). HepG2 šūnu līnija tika iegūta no ATCC (Manassas, Virginia, ASV). Visi pārējie reaģenti bija analītiskās vai hromatogrāfiskās kvalitātes.
Sagatavojiet 1 mg/ml CS šķīdumu, izšķīdinot to divkārši destilētā ūdenī (DD ūdenī), kas satur 0,1% etiķskābes. Sagatavojiet 1 mg/ml TPP un insulīna šķīdumus, izšķīdinot tos attiecīgi DD ūdenī un 0,1% etiķskābē. Preemulsija tika sagatavota ar polytron PCU-2-110 ātrgaitas homogenizatoru (Brinkmann Ind. Westbury, NY, ASV). Sagatavošanas process ir šāds: vispirms 2 ml TPP šķīduma pievieno 4 ml insulīna šķīduma, maisījumu maisa 30 minūtes un pilnībā samaisa. Pēc tam sajaukto šķīdumu pa pilienam pievieno CS šķīdumam caur šļirci, maisot ar lielu ātrumu (10 000 apgr./min). Maisījumus 30 minūtes maisa ar lielu ātrumu (15 000 apgr./min) ledus vannā, un tos noregulē līdz noteiktam pH līmenim, lai iegūtu savstarpēji saistītas insulīna NP. Lai vēl vairāk homogenizētu un samazinātu insulīna NP daļiņu izmēru, tos vēl 30 minūtes apstrādāja ar ultraskaņu. ledus vannā, izmantojot zondes tipa ultraskaņas ierīci (UP 200ST, Hielscher Ultrasonics, Teltova, Vācija).
Insulīna NPS tika pārbaudīti attiecībā uz Z vidējo diametru, polidispersitātes indeksu (PDI) un zeta potenciālu, izmantojot dinamiskās gaismas izkliedes (DLS) mērījumus ar Litesizer 500 (Anton Paar, Grāca, Austrija) atšķaidot tos DD ūdenī 25°C temperatūrā. Morfoloģija un izmēru sadalījums tika raksturots ar Hitachi H7600 transmisijas elektronmikroskopu (TEM) (Hitachi, Tokija, Japāna), un attēli pēc tam tika analizēti, izmantojot Hitachi attēlveidošanas programmatūru (Hitachi, Tokija, Japāna). Lai novērtētu insulīna NP iekapsulēšanas efektivitāti (EE) un ielādes kapacitāti (LC), NP tika pipetētas ultrafiltrācijas mēģenēs ar molekulmasas robežvērtību 100 kDa un centrifugētas ar 500 xg 30 minūtes. Neiekapsulētais insulīns filtrātā tika kvantitatīvi noteikts, izmantojot Agilent 1100 sērijas HPLC sistēmu (Agilent, Santa Clara, Kalifornija, ASV), kas sastāvēja no kvaternārā sūkņa, automātiskā paraugu ņemšanas ierīces, kolonnas sildītāja un DAD detektora. Insulīns tika analizēts ar C18 kolonnu. (Zorbax, 3,5 μm, 4,6 mm × 150 mm, Agilent, ASV) un detektēts pie 214 nm. Mobilā fāze bija acetonitrils un ūdens, kas saturēja 0,1% TFA, gradienta attiecības no 10/90 līdz 100/0, un darbojās 10 minūtes. Mobilā fāze tika sūknēta ar plūsmas ātrumu 1,0 ml/min. Kolonnas temperatūra tika iestatīta uz 20 °C. Aprēķiniet EE un LC procentuālo daudzumu, izmantojot vienādojumus (1) un (2).
Lai optimizētu insulīna NP, tika pārbaudītas dažādas CS/insulīna attiecības no 2,0 līdz 4,0. Sagatavošanas laikā tika pievienots dažāds CS šķīduma daudzums, saglabājot nemainīgu insulīna/TPP maisījumu. Insulīna NP tika sagatavotas pH diapazonā no 4,0 līdz 6,5, rūpīgi kontrolējot maisījuma pH pēc visu šķīdumu (insulīna, TPP un CS) pievienošanas. Lai optimizētu insulīna NP veidošanos, tika novērtēts insulīna nanodaļiņu EE un daļiņu izmērs pie dažādām pH vērtībām un CS/insulīna masas attiecībām.
Optimizētās insulīna NP tika novietotas uz alumīnija konteinera un pārklātas ar salveti, kas pievilkta ar līmlenti. Pēc tam skrūvētie konteineri tika ievietoti Labconco FreeZone saldēšanas žāvētājā (Labconco, Kansas City, Misūri, ASV), kas aprīkots ar paplātes žāvētāju. Temperatūra un vakuuma spiediens tika iestatīti uz -10 °C, 0,350 Torr pirmajās 2 stundās un 0 °C un 0,120 Torr atlikušajās 22 stundās no 24 stundām, lai iegūtu sausas insulīna NP.
Iekapsulēta insulīna ražošanai tika izmantots Buchi Mini Spray Dryer B-290 (BÜCHI, Flawil, Šveice). Izvēlētie žāvēšanas parametri bija: temperatūra 100 °C, padeves plūsma 3 l/min un gāzes plūsma 4 l/min.
Insulīna nanodaļiņas pirms un pēc dehidratācijas tika raksturotas, izmantojot FTIR-ATR spektroskopiju. Dehidratētās nanodaļiņas, kā arī brīvais insulīns un hitīns tika analizēti, izmantojot Spectrum 100 FTIR spektrofotometru (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ASV), kas aprīkots ar universālu ATR paraugu ņemšanas piederumu (PerkinElmer, Waltham, Massachusetts, ASV). Signālu vidējie rādītāji tika iegūti no 16 skenējumiem ar izšķirtspēju 4 cm2 frekvenču diapazonā no 4000 līdz 600 cm2.
Sauso insulīna NP morfoloģija tika novērtēta, izmantojot saldēta žāvēta un izsmidzinot žāvēta insulīna NP SEM attēlus, kas uzņemti ar Helios NanoLab 650 fokusēta jonu kūļa skenējošo elektronmikroskopu (FIB-SEM) (FEI, Hillsboro, Oregona, ASV). Galvenais izmantotais parametrs bija spriegums 5 keV un strāva 30 mA.
Visas dehidrētās insulīna NP tika atkārtoti izšķīdinātas dd ūdenī. Daļiņu izmērs, PDI, EE un LC tika atkārtoti pārbaudīti, izmantojot to pašu iepriekš minēto metodi, lai novērtētu to kvalitāti pēc dehidratācijas. Anhidroinsulīna NP stabilitāte tika mērīta arī, pārbaudot NP īpašības pēc ilgstošas ​​uzglabāšanas. Šajā pētījumā visas NP pēc dehidratācijas tika uzglabātas ledusskapī trīs mēnešus. Pēc trīs mēnešu uzglabāšanas NP tika pārbaudītas attiecībā uz morfoloģisko daļiņu izmēru, PDI, EE un LC.
Lai novērtētu insulīna efektivitāti NP aizsardzībā pēc dehidratācijas, izšķīdiniet 5 ml rekombinētu NP 45 ml simulēta kuņģa šķidruma (pH 1,2, kas satur 1% pepsīna), zarnu šķidruma (pH 6,8, kas satur 1% tripsīna) vai himotripsīna šķīduma (100 μg/ml, fosfātu buferšķīdumā, pH 7,8). Tās tika inkubētas 37°C temperatūrā ar maisīšanas ātrumu 100 apgr./min. Dažādos laika punktos tika savākti 500 μl šķīduma, un insulīna koncentrācija tika noteikta ar HPLC.
Svaigi pagatavotu un dehidrētu insulīna NP izdalīšanās in vitro uzvedība tika pārbaudīta, izmantojot dialīzes maisiņa metodi (molekulmasas robežvērtība 100 kDa, Spectra Por Inc.). Svaigi pagatavotas un rekonstituētas sausās NP tika dializētas šķidrumos ar pH 2,5, pH 6,6 un pH 7,0 (0,1 M fosfātu buferēts sāls šķīdums, PBS), lai simulētu attiecīgi kuņģa, divpadsmitpirkstu zarnas un tievās zarnas augšdaļas pH vidi. Visi paraugi tika inkubēti 37 °C temperatūrā, nepārtraukti kratot ar ātrumu 200 apgr./min. Šķidrums no 5 ml dialīzes maisiņa tika aspirēts šādos laikos: 0,5, 1, 2, 3, 4 un 6 stundas, un tilpums nekavējoties tika papildināts ar svaigu dializātu. Insulīna piesārņojums šķidrumā tika analizēts ar HPLC, un insulīna izdalīšanās ātrums no nanodaļiņām tika aprēķināts no brīvā izdalītā insulīna attiecības pret kopējo nanodaļiņās iekapsulēto insulīnu (3. vienādojums).
Cilvēka hepatocelulārās karcinomas šūnu līnijas HepG2 šūnas tika audzētas 60 mm diametra trauciņos, izmantojot Dulbeko modificēto Īgla barotni (DMEM), kas satur 10% fetāla liellopa seruma, 100 SV/ml penicilīna un 100 μg/ml streptomicīna29. Kultūras tika uzturētas 37°C temperatūrā, 95% relatīvajā mitrumā un 5% CO2 atmosfērā. Uzņemšanas testiem HepG2 šūnas tika iesētas ar koncentrāciju 1 × 105 šūnas/ml uz 8 iedobju Nunc Lab-Tek kameras slaidu sistēmas (Thermo Fisher, NY, ASV). Citotoksicitātes testiem tās tika iesētas 96 iedobju plāksnēs (Corning, NY, ASV) ar blīvumu 5 × 104 šūnas/ml.
MTT tests tika izmantots, lai novērtētu svaigi pagatavotu un dehidrētu insulīna NP citotoksicitāti30. HepG2 šūnas tika iesētas 96 iedobju plāksnēs ar blīvumu 5 × 104 šūnas/ml un kultivētas 7 dienas pirms testēšanas. Insulīna NP tika atšķaidītas dažādās koncentrācijās (no 50 līdz 500 μg/ml) barotnē un pēc tam ievadītas šūnām. Pēc 24 stundu inkubācijas šūnas 3 reizes mazgāja ar PBS un inkubēja ar barotni, kas satur 0,5 mg/ml MTT, vēl 4 stundas. Citotoksicitāte tika novērtēta, mērot dzeltenā tetrazolija MTT fermentatīvo reducēšanos līdz violetam formazānam pie 570 nm, izmantojot Tecan infinite M200 pro spektrofotometra plākšņu lasītāju (Tecan, Männedorf, Šveice).
Šūnu NP uzņemšanas efektivitāte tika pārbaudīta, izmantojot konfokālo lāzera skenēšanas mikroskopiju un plūsmas citometrijas analīzi. Katra Nunc Lab-Tek kameras slaidu sistēmas iedobe tika apstrādāta ar brīvu FITC-insulīnu, ar FITC-insulīnu piesātinātām NP un rekonstituētām 25 μg/ml dehidrētām FITC-insulīna NP tādā pašā koncentrācijā un inkubēta 4 stundas. Šūnas tika mazgātas 3 reizes ar PBS un fiksētas ar 4% paraformaldehīdu. Kodoli tika iekrāsoti ar 4',6-diamidino-2-fenilindolu (DAPI). Insulīna lokalizācija tika novērota, izmantojot Olympus FV1000 lāzera skenēšanas/divu fotonu konfokālo mikroskopu (Olympus, Šindžuku pilsēta, Tokija, Japāna). Plūsmas citometrijas analīzei 96 iedobju plāksnēm, kas bija iesētas ar HepG2 šūnām, tika pievienotas tādas pašas 10 μg/ml brīva FITC-insulīna, ar FITC-insulīnu piesātinātu NP un atkārtoti izšķīdinātu dehidrētu FITC-insulīna NP koncentrācijas un inkubētas 4 stundas. Pēc 4 stundām Inkubācijas laikā šūnas tika izņemtas un 3 reizes mazgātas ar FBS. 5 × 104 šūnas no katra parauga tika analizētas ar BD LSR II plūsmas citometru (BD, Franklin Lakes, Ņūdžersija, Amerikas Savienotās Valstis).
Visas vērtības ir izteiktas kā vidējais rādītājs ± standartnovirze. Salīdzinājumi starp visām grupām tika novērtēti, izmantojot vienvirziena ANOVA vai t-testu ar IBM SPSS Statistics 26 for Mac (IBM, Endicott, Ņujorka, ASV), un p < 0,05 tika uzskatīts par statistiski nozīmīgu.
Šis pētījums demonstrē izsmidzināšanas žāvēšanas elastību un spēju dehidrēt savstarpēji saistītas hitīna/TPP/insulīna nanodaļiņas ar labāku rekonstitūciju, salīdzinot ar standarta saldēšanas žāvēšanas metodēm, izmantojot pildvielas vai krioprotektantus, kapacitāti un lielāku slodzes izturību. Optimizētās insulīna nanodaļiņas ieguva vidējo daļiņu izmēru 318 nm un iekapsulēšanas efektivitāti 99,4%. SEM un FTIR rezultāti pēc dehidratācijas parādīja, ka sfēriskā struktūra saglabājās tikai izsmidzināšanas žāvētās NP ar un bez mannīta un liofilizētās ar mannītu, bet liofilizētās NP bez mannīta dehidratācijas laikā sadalījās. Rekonstitūcijas spējas testā bez mannīta izsmidzināšanas žāvētās insulīna nanodaļiņas uzrādīja mazāko vidējo daļiņu izmēru un vislielāko slodzi pēc rekonstitūcijas. Visu šo dehidrēto NP izdalīšanās uzvedība parādīja, ka tās ātri atbrīvojās šķīdumos ar pH = 2,5 un pH = 7 un ļoti stabilas šķīdumā ar pH = 6,5. Salīdzinot ar citām atkārtoti izšķīdinātām dehidrētām NP, bez mannīta izsmidzināšanas žāvētās NP uzrādīja visātrāko izdalīšanos. Šis rezultāts atbilst tam, kas novērots šūnu... uzņemšanas testā, jo ar izsmidzināšanas žāvēšanu bez mannīta gandrīz pilnībā saglabāja svaigi pagatavotu NP šūnu uzņemšanas efektivitāti. Šie rezultāti liecina, ka sausās insulīna nanodaļiņas, kas sagatavotas ar izsmidzināšanas žāvēšanu bez mannīta, ir vispiemērotākās tālākai pārstrādei citās bezūdens zāļu formās, piemēram, iekšķīgi lietojamās tabletēs vai bioadhezīvās plēvēs.
Intelektuālā īpašuma jautājumu dēļ pašreizējā pētījuma laikā ģenerētie un/vai analizētie datu kopumi nav publiski pieejami, bet ir pieejami no attiecīgajiem autoriem pēc saprātīga pieprasījuma.
Kagans, A. 2. tipa diabēts: sociālā un zinātniskā izcelsme, medicīniskās komplikācijas un ietekme uz pacientiem un citiem. (McFarlane, 2009).
Singh, AP, Guo, Y., Singh, A., Xie, W. un Jiang, P. Insulīna iekapsulēšanas attīstība: vai tagad ir iespējama iekšķīga lietošana? J. Pharmacy.bio-pharmacy.reservoir.1, 74–92 (2019).
Wong, CY, Al-Salami, H. un Dass, CR. Jaunākie sasniegumi perorālo insulīnu saturošo liposomu piegādes sistēmu jomā diabēta ārstēšanai. Interpretation. J. Pharmacy.549, 201–217 (2018).