Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūsu izmantotajai pārlūkprogrammas versijai ir ierobežots CSS atbalsts. Lai iegūtu labākos rezultātus, iesakām izmantot jaunāku pārlūkprogrammas versiju (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Tikmēr, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stila vai JavaScript.
Propionskābe (PPA) tiek izmantota, lai pētītu mitohondriju disfunkcijas lomu neiroattīstības traucējumos, piemēram, autisma spektra traucējumos. Ir zināms, ka PPA traucē mitohondriju bioģenēzi, metabolismu un apgrozījumu. Tomēr PPA ietekme uz mitohondriju dinamiku, dalīšanos un saplūšanu joprojām ir problemātiska šo mehānismu sarežģītā laika rakstura dēļ. Šeit mēs izmantojam komplementāras kvantitatīvās attēlveidošanas metodes, lai izpētītu, kā PPA ietekmē mitohondriju ultrastruktūru, morfoloģiju un dinamiku neironiem līdzīgās SH-SY5Y šūnās. PPA (5 mM) izraisīja ievērojamu mitohondriju laukuma (p < 0,01), Fereta diametra un apkārtmēra (p < 0,05) un 2. laukuma (p < 0,01) samazināšanos. Mitohondriju notikumu lokatora analīze uzrādīja ievērojamu dalīšanās un saplūšanas notikumu pieaugumu (p < 0,05), tādējādi saglabājot mitohondriju tīkla integritāti stresa apstākļos. Turklāt cMYC (p < 0,0001), NRF1 (p < 0,01), TFAM (p < 0,05), STOML2 (p < 0,0001) un OPA1 (p < 0,05) mRNS ekspresija bija ievērojami samazināta. 01). Tas ilustrē mitohondriju morfoloģijas, bioģenēzes un dinamikas pārveidošanos, lai saglabātu funkciju stresa apstākļos. Mūsu dati sniedz jaunu ieskatu PPA ietekmē uz mitohondriju dinamiku un izceļ attēlveidošanas metožu lietderību mitohondriju stresa reakcijās iesaistīto sarežģīto regulēšanas mehānismu pētīšanā.
Mitohondriji ir neatņemami dalībnieki dažādās šūnu funkcijās, kas pārsniedz to tipiskās lomas enerģijas ražošanā un biosintēzē. Mitohondriju metabolisms ir galvenais kalcija signālvadīšanas, vielmaiņas un redoksa homeostāzes, iekaisuma signālvadīšanas, epigenetisko modifikāciju, šūnu proliferācijas, diferenciācijas un ieprogrammētas šūnu nāves regulators1. Jo īpaši mitohondriju metabolisms ir kritiski svarīgs neironu attīstībai, izdzīvošanai un funkcijai, un tas ir plaši iesaistīts dažādās neiropatoloģijas izpausmēs2,3,4.
Pēdējās desmitgades laikā vielmaiņas statuss ir parādījies kā neiroģenēzes, diferenciācijas, nobriešanas un plastiskuma centrālais regulators5,6. Nesen mitohondriju morfoloģija un dinamika ir kļuvusi par īpaši svarīgām mitozes sastāvdaļām – dinamiska procesa, kas uztur veselīgu mitohondriju kopumu šūnās. Mitohondriju dinamiku regulē sarežģīti savstarpēji atkarīgi ceļi, sākot no mitohondriju bioģenēzes un bioenerģētikas līdz mitohondriju dalīšanai, saplūšanai, transportēšanai un klīrensam7,8. Jebkura no šiem integrācijas mehānismiem traucējumi pasliktina veselīgu mitohondriju tīklu uzturēšanu un rada dziļas funkcionālas sekas neiroattīstībai9,10. Patiešām, mitohondriju dinamikas disregulācija ir novērota daudzos psihiskos, neirodeģeneratīvos un neiroattīstības traucējumos, tostarp autisma spektra traucējumos (AST)11,12.
ASD ir heterogēns neiroattīstības traucējums ar sarežģītu ģenētisku un epigenetisku arhitektūru. ASD pārmantojamība ir neapstrīdama, taču pamatā esošā molekulārā etioloģija joprojām ir vāji izprasta. Uzkrātie dati no preklīniskajiem modeļiem, klīniskajiem pētījumiem un multi-omikas molekulārajiem datu kopumiem sniedz arvien vairāk pierādījumu par mitohondriju disfunkciju ASD gadījumā13,14. Iepriekš mēs veicām genoma mēroga DNS metilēšanas skrīningu pacientu ar ASD kohortā un identificējām diferenciāli metilētus gēnus, kas ir grupēti gar mitohondriju metabolisma ceļiem15. Pēc tam mēs ziņojām par mitohondriju bioģenēzes un dinamikas centrālo regulatoru diferenciālo metilēšanu, kas bija saistīta ar palielinātu mtDNS kopiju skaitu un izmainītu urīna metabolisma profilu ASD gadījumā16. Mūsu dati sniedz arvien vairāk pierādījumu tam, ka mitohondriju dinamikai un homeostāzei ir galvenā loma ASD patofizioloģijā. Tāpēc mehāniskās izpratnes uzlabošana par saistību starp mitohondriju dinamiku, morfoloģiju un funkciju ir galvenais mērķis notiekošajos pētījumos par neiroloģiskajām slimībām, kurām raksturīga sekundāra mitohondriju disfunkcija.
Molekulārās metodes bieži izmanto, lai pētītu specifisku gēnu lomu mitohondriju stresa reakcijās. Tomēr šo pieeju var ierobežot mitotisko kontroles mehānismu daudzšķautņainais un laika ziņā nozīmīgais raksturs. Turklāt mitohondriju gēnu atšķirīgā ekspresija ir netiešs funkcionālo izmaiņu indikators, jo īpaši tāpēc, ka parasti tiek analizēts tikai ierobežots skaits gēnu. Tāpēc ir ierosinātas tiešākas metodes mitohondriju funkcijas un bioenerģētikas pētīšanai17. Mitohondriju morfoloģija ir cieši saistīta ar mitohondriju dinamiku. Mitohondriju forma, savienojamība un struktūra ir kritiski svarīgas enerģijas ražošanai un mitohondriju un šūnu izdzīvošanai5,18. Turklāt dažādās mitozes sastāvdaļas koncentrējas uz izmaiņām mitohondriju morfoloģijā, kas var kalpot kā noderīgi mitohondriju disfunkcijas galapunkti un nodrošināt pamatu turpmākiem mehānistiskiem pētījumiem.
Mitohondriju morfoloģiju var tieši novērot, izmantojot transmisijas elektronu mikroskopiju (TEM), kas ļauj detalizēti pētīt šūnu ultrastruktūru. TEM tieši vizualizē mitohondriju kristu morfoloģiju, formu un struktūru atsevišķu mitohondriju izšķirtspējā, nevis paļaujas tikai uz gēnu transkripciju, olbaltumvielu ekspresiju vai mitohondriju funkcionālajiem parametriem šūnu populācijās17,19,20. Turklāt TEM atvieglo mijiedarbības izpēti starp mitohondrijiem un citām organellām, piemēram, endoplazmatisko retikulu un autofagosomām, kurām ir galvenā loma mitohondriju funkcijā un homeostāzē21,22. Tādējādi tas padara TEM par labu sākumpunktu mitohondriju disfunkcijas pētīšanai, pirms koncentrēties uz konkrētiem ceļiem vai gēniem. Tā kā mitohondriju funkcija kļūst arvien nozīmīgāka neiropatoloģijā, pastāv skaidra nepieciešamība pēc iespējas tieši un kvantitatīvi pētīt mitohondriju morfoloģiju un dinamiku in vitro neironu modeļos.
Šajā rakstā mēs pētām mitohondriju dinamiku mitohondriju disfunkcijas neironu modelī autisma spektra traucējumu gadījumā. Iepriekš mēs ziņojām par propionil-CoA karboksilāzes beta (PCCB) diferenciālo metilēšanu ASD15, kas ir mitohondriju propionil-CoA karboksilāzes enzīma PCC apakšvienība. Ir zināms, ka PCC disregulācija izraisa propionila atvasinājumu, tostarp propionskābes (PPA), toksisku uzkrāšanos23,24,25. Ir pierādīts, ka PPA traucē neironu metabolismu un maina uzvedību in vivo, un tas ir atzīts dzīvnieku modelis ASD iesaistīto neiroloģiskās attīstības mehānismu izpētei26,27,28. Turklāt ir ziņots, ka PPA in vitro traucē mitohondriju membrānas potenciālu, bioģenēzi un elpošanu, un to plaši izmanto mitohondriju disfunkcijas modelēšanai neironos29,30. Tomēr PPA izraisītas mitohondriju disfunkcijas ietekme uz mitohondriju morfoloģiju un dinamiku joprojām ir vāji izprasta.
Šajā pētījumā tiek izmantotas papildinošas attēlveidošanas metodes, lai kvantitatīvi noteiktu PPA ietekmi uz mitohondriju morfoloģiju, dinamiku un funkciju SH-SY5Y šūnās. Vispirms mēs izstrādājām TEM metodi, lai vizualizētu izmaiņas mitohondriju morfoloģijā un ultrastruktūrā17,31,32. Ņemot vērā mitohondriju dinamisko raksturu33, mēs izmantojām arī mitohondriju notikumu lokalizatora (MEL) analīzi, lai kvantitatīvi noteiktu izmaiņas dalīšanās un saplūšanas notikumu līdzsvarā, mitohondriju skaitā un tilpumā PPA stresa apstākļos. Visbeidzot, mēs pārbaudījām, vai mitohondriju morfoloģija un dinamika ir saistīta ar izmaiņām bioģenēzē, dalīšanās un saplūšanas procesā iesaistīto gēnu ekspresijā. Kopumā mūsu dati ilustrē izaicinājumu noskaidrot mitohondriju dinamiku regulējošo mehānismu sarežģītību. Mēs izceļam TEM lietderību mitohondriju morfoloģijas pētīšanā kā izmērāmu konverģentu mitozes galapunktu SH-SY5Y šūnās. Turklāt mēs izceļam, ka TEM dati sniedz visbagātīgāko informāciju, apvienojumā ar attēlveidošanas metodēm, kas arī uztver dinamiskus notikumus, reaģējot uz vielmaiņas stresu. Turpmāka neironu šūnu mitozi atbalstošo molekulāro regulēšanas mehānismu raksturošana var sniegt svarīgu ieskatu nervu sistēmas un neirodeģeneratīvo slimību mitohondriju komponentē.
Lai izraisītu mitohondriju stresu, SH-SY5Y šūnas tika apstrādātas ar PPA, izmantojot 3 mM un 5 mM nātrija propionātu (NaP). Pirms TEM paraugi tika pakļauti kriogēnai paraugu sagatavošanai, izmantojot augstspiediena sasaldēšanu un sasaldēšanu (1.a att.). Mēs izstrādājām automatizētu mitohondriju attēlu analīzes plūsmu, lai izmērītu astoņus mitohondriju populāciju morfoloģiskos parametrus trīs bioloģiskajos atkārtojumos. Mēs atklājām, ka PPA apstrāde būtiski mainīja četrus parametrus: laukumu 2, laukumu, perimetru un Fere diametru (1.b–e att.). Laukums 2 būtiski samazinājās gan ar 3 mM, gan 5 mM PPA apstrādi (attiecīgi p = 0,0183 un p = 0,002) (1.b att.), savukārt laukums (p = 0,003), perimetrs (p = 0,0106) un Fere diametrs ievērojami samazinājās. 5 mM apstrādes grupā bija ievērojama samazināšanās (p = 0,0172), salīdzinot ar kontroles grupu (1.c–e att.). Ievērojams laukuma un apkārtmēra samazinājums parādīja, ka šūnām, kas apstrādātas ar 5 mM PPA, bija mazāki, noapaļotāki mitohondriji, un ka šie mitohondriji bija mazāk pagarināti nekā kontroles šūnās. Tas atbilst arī ievērojamam Fereta diametra samazinājumam, kas ir neatkarīgs parametrs, kas norāda uz lielākā attāluma starp daļiņu malām samazināšanos. Tika novērotas izmaiņas kristu ultrastruktūrā: PPA stresa ietekmē kristas kļuva mazāk izteiktas (1.a att., B panelis). Tomēr ne visi attēli skaidri atspoguļoja kristu ultrastruktūru, tāpēc šo izmaiņu kvantitatīva analīze netika veikta. Šie TEM dati var atspoguļot trīs iespējamos scenārijus: (1) PPA veicina dalīšanos vai kavē saplūšanu, izraisot esošo mitohondriju saraušanos; (2) pastiprināta bioģenēze rada jaunus, mazākus mitohondrijus vai (3) vienlaikus inducē abus mehānismus. Lai gan šos apstākļus nevar atšķirt ar TEM, būtiskas morfoloģiskas izmaiņas norāda uz izmaiņām mitohondriju homeostāzē un dinamikā PPA stresa ietekmē. Pēc tam mēs izpētījām papildu parametrus, lai sīkāk raksturotu šo dinamiku un tās pamatā esošos potenciālos mehānismus.
Propionskābe (PPA) pārveido mitohondriju morfoloģiju. (a) Reprezentatīvi transmisijas elektronu mikroskopijas (TEM) attēli, kas parāda, ka, palielinot PPA apstrādi, mitohondriju izmērs samazinās un mitohondriji kļūst mazāki un apaļāki; attiecīgi 0 mM (neapstrādāti), 3 mM un 5 mM. Sarkanās bultiņas norāda mitohondrijus. (b–e) SH-SY5Y šūnas, kas 24 stundas tika apstrādātas ar PPA, tika sagatavotas TEM, un rezultāti tika analizēti, izmantojot Fiji/ImageJ. Četri no astoņiem parametriem uzrādīja būtiskas atšķirības starp kontroles (neapstrādātas, 0 mM PPA) un apstrādātajām (3 mM un 5 mM PPA) šūnām. (b) 2. reģions, (c) Laukums, (d) Perimetrs, (e) Fereta diametrs. Lai noteiktu būtiskas atšķirības (p < 0,05), tika izmantota vienvirziena dispersijas analīze (kontrole pret apstrādi) un Daneta daudzkārtējo salīdzināšanas tests. Datu punkti atspoguļo katras atsevišķās šūnas vidējo mitohondriju vērtību, un kļūdu joslas atspoguļo vidējo vērtību ± SEM. Parādītie dati atspoguļo n = 3, vismaz 24 šūnas katrā atkārtojumā; kopumā tika analizēti 266 attēli; * norāda p < 0,05, ** norāda p < 0,01.
Lai vēl vairāk raksturotu mitohondriju dinamikas reakciju uz PPA, mēs iekrāsojām mitohondrijus ar tetrametilrodamīna etilesteri (TMRE) un izmantojām laika ritējuma mikroskopiju un MEL analīzi, lai lokalizētu un kvantitatīvi noteiktu mitohondrijus pēc 24 stundām pie 3 un 5 mM PPA. Dalīšanās un saplūšanas notikumu apstrāde. (2.a att.). Pēc MEL analīzes mitohondriji tika tālāk analizēti, lai kvantitatīvi noteiktu mitohondriju struktūru skaitu un to vidējo tilpumu. Mēs novērojām nelielu, bet nozīmīgu dalīšanās notikumu skaita pieaugumu pie 3 mM [4,9 ± 0,3 (p < 0,05)], salīdzinot ar dalīšanās [5,6 ± 0,3 (p < 0,05)] un saplūšanas [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] un saplūšanas [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] un saplūšanas [5,4 ± 0,5 (p < 0,05)] (0,05)] (<0,05)] notikumiem, kas bija ievērojami vairāk pie 5 mM, salīdzinot ar kontroli (3.b att.). Mitohondriju skaits būtiski palielinājās gan pie 3 [32,6 ± 2,1 (p < 0,05)], gan pie 5 mM [34,1 ± 2,2 (p < 0,05)] (3.c att.), savukārt katras mitohondriju struktūras vidējais tilpums palika nemainīgs (3.c att.). 3.d). Kopumā tas liecina, ka mitohondriju dinamikas pārveidošana kalpo kā kompensējoša reakcija, kas veiksmīgi uztur mitohondriju tīkla integritāti. Dalīšanās notikumu skaita palielināšanās pie 3 mM PPA liecina, ka mitohondriju skaita palielināšanās daļēji ir saistīta ar mitohondriju dalīšanos, bet, ņemot vērā, ka vidējais mitohondriju tilpums praktiski nemainās, nevar izslēgt bioģenēzi kā papildu kompensējošu reakciju. Tomēr šie dati saskan ar mazākām, apaļām mitohondriju struktūrām, ko novēroja TEM, un arī parāda būtiskas izmaiņas mitohondriju dinamikā, ko izraisa PPA.
Propionskābe (PPA) izraisa dinamisku mitohondriju remodelāciju, lai saglabātu tīkla integritāti. SH-SY5Y šūnas tika kultivētas, apstrādātas ar 3 un 5 mM PPA 24 stundas un iekrāsotas ar TMRE un Hoechst 33342, kam sekoja MEL analīze. (a) Reprezentatīvi laika ritējuma mikroskopijas attēli, kas attēlo krāsu un binārās maksimālās intensitātes projekcijas 2. laikā (t2) katram nosacījumam. Katrā binārajā attēlā norādītie atlasītie reģioni tiek pastiprināti un attēloti 3D formātā trīs dažādos laika posmos (t1-t3), lai ilustrētu dinamiku laika gaitā; saplūšanas notikumi ir iezīmēti zaļā krāsā; dalīšanās notikumi ir iezīmēti zaļā krāsā. Attēlots sarkanā krāsā. (b) Vidējais dinamisko notikumu skaits katrā nosacījumā. (c) Vidējais mitohondriju struktūru skaits vienā šūnā. (d) Katras mitohondriju struktūras vidējais tilpums (µm3) vienā šūnā. Parādītie dati reprezentē n = 15 šūnas katrā apstrādes grupā. Parādītās kļūdu joslas apzīmē vidējo vērtību ± SEM, mēroga josla = 10 μm, * p < 0,05.
Propionskābe (PPA) izraisa ar mitohondriju dinamiku saistīto gēnu transkripcijas nomākšanu. SH-SY5Y šūnas 24 stundas tika apstrādātas ar 3 un 5 mM PPA. Relatīvā gēnu kvantifikācija tika veikta, izmantojot RT-qPCR, un normalizēta pret B2M. Mitohondriju bioģenēzes gēni (a) cMYC, (b) TFAM, (c) NRF1 un (d) NFE2L2. Mitohondriju saplūšanas un dalīšanās gēni (e) STOML2, (f) OPA1, (g) MFN1, (h) MFN2 un (i) DRP1. Būtiskas atšķirības (p < 0,05) tika pārbaudītas, izmantojot vienvirziena ANOVA (kontrole pret apstrādi) un Daneta daudzkārtējo salīdzināšanas testu: * norāda p < 0,05, ** norāda p < 0,01 un **** norāda p < 0,0001. Stieņi apzīmē vidējo ekspresiju ± SEM. Parādītie dati atspoguļo n = 3 (STOML2, OPA1, TFAM), n = 4 (cMYC, NRF1, NFE2L2) un n = 5 (MFN1, MFN2, DRP1) bioloģiskos atkārtojumus.
TEM un MEL analīžu dati kopā norāda, ka PPA maina mitohondriju morfoloģiju un dinamiku. Tomēr šīs attēlveidošanas metodes nesniedz ieskatu pamatā esošajos mehānismos, kas virza šos procesus. Tāpēc mēs pētījām deviņu galveno mitohondriju dinamikas, bioģenēzes un mitozes regulatoru mRNS ekspresiju, reaģējot uz PPA terapiju. Pēc 24 stundu ilgas apstrādes ar 3 mM un 5 mM PPA mēs kvantitatīvi noteicām šūnu mielomas onkogēnu (cMYC), kodola elpošanas faktoru (NRF1), mitohondriju transkripcijas faktoru 1 (TFAM), NFE2 līdzīgo transkripcijas faktoru BZIP (NFE2L2), gastrīnam līdzīgo proteīnu 2 (STOML2), redzes nerva atrofiju 1 (OPA1), mitofuzīnu 1 (MFN1), mitofuzīnu 2 (MFN2) un dinamīnam saistīto proteīnu 1 (DRP1). Mēs novērojām 3 mM (attiecīgi p = 0,0053, p = 0,0415 un p < 0,0001) un 5 mM (p = 0,0031, p = 0,0233, p < 0,0001) PPA apstrādi. (3.a–c att.). mRNS ekspresijas samazināšanās bija atkarīga no devas: cMYC, NRF1 un TFAM ekspresija samazinājās attiecīgi 5,7, 2,6 un 1,9 reizes pie 3 mM un 11,2, 3 un 2,2 reizes pie 5 mM. Turpretī centrālā redoksa bioģenēzes gēna NFE2L2 darbība nemainījās nevienā PPA koncentrācijā, lai gan tika novērota līdzīga no devas atkarīga samazinātas ekspresijas tendence (3.d att.).
Mēs pētījām arī klasisko gēnu ekspresiju, kas iesaistīti dalīšanās un saplūšanas regulēšanā. Tiek uzskatīts, ka STOML2 ir iesaistīts saplūšanā, mitofāgijā un bioģenēzē, un tā ekspresija bija ievērojami samazināta (p < 0,0001) pie 3 mM (2,4 reizes lielākas izmaiņas) un 5 mM (2,8 reizes lielākas izmaiņas) PPA (1. att.). Līdzīgi OPA1 saplūšanas gēna ekspresija bija samazināta pie 3 mM (1,6 reizes lielākas izmaiņas) un 5 mM (1,9 reizes lielākas izmaiņas) PPA (attiecīgi p = 0,006 un p = 0,0024) (3. att. f). Tomēr mēs neatradām būtiskas atšķirības saplūšanas gēnu MFN1, MFN2 vai dalīšanās gēna DRP1 ekspresijā 24 stundu PPA stresa apstākļos (3. att. g–i). Turklāt mēs atklājām, ka četru saplūšanas un dalīšanās olbaltumvielu (OPA1, MFN1, MFN2 un DRP1) līmeņi nemainījās vienādos apstākļos (4.a–d att.). Ir svarīgi atzīmēt, ka šie dati atspoguļo vienu laika punktu un var neatspoguļot olbaltumvielu ekspresijas vai aktivitātes līmeņa izmaiņas PPA stresa agrīnajās stadijās. Tomēr ievērojama cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 un OPA1 ekspresijas samazināšanās norāda uz ievērojamu mitohondriju metabolisma, bioģenēzes un dinamikas transkripcijas disregulāciju. Turklāt šie dati uzsver attēlveidošanas metožu lietderību, lai tieši pētītu mitohondriju funkcijas beigu stāvokļa izmaiņas.
Pēc propionskābes (PPA) apstrādes saplūšanas un dalīšanās faktoru olbaltumvielu līmenis nemainījās. SH-SY5Y šūnas 24 stundas tika apstrādātas ar 3 un 5 mM PPA. Olbaltumvielu līmenis tika kvantitatīvi noteikts ar Western blot analīzi, un ekspresijas līmeņi tika normalizēti attiecībā pret kopējo olbaltumvielu daudzumu. Parādīta vidējā olbaltumvielu ekspresija un reprezentatīvie mērķa un kopējā olbaltumvielu Western bloti. a – OPA1, b – MFN1, c – MFN2, d – DRP1. Stieņi apzīmē vidējo vērtību ± SEM, un parādītie dati reprezentē n = 3 bioloģiskos atkārtojumus. Vairāki salīdzinājumi (p < 0,05) tika veikti, izmantojot vienvirziena dispersijas analīzi un Daneta testu. Sākotnējais gēls un blots ir parādīti S1. attēlā.
Mitohondriju disfunkcija ir saistīta ar daudzsistēmu slimībām, sākot no vielmaiņas, sirds un asinsvadu un muskuļu slimībām līdz neiroloģiskām slimībām1,10. Daudzas neirodeģeneratīvas un neirodeģeneratīvas slimības ir saistītas ar mitohondriju disfunkciju, uzsverot šo organellu nozīmi visā smadzeņu dzīves laikā. Šīs slimības ietver Parkinsona slimību, Alcheimera slimību un autisma spektra traucējumus3,4,18. Tomēr piekļuve smadzeņu audiem šo slimību pētīšanai ir sarežģīta, īpaši mehānistiskā līmenī, padarot šūnu modeļu sistēmas par nepieciešamu alternatīvu. Šajā pētījumā mēs izmantojam šūnu modeļa sistēmu, izmantojot ar PPA apstrādātas SH-SY5Y šūnas, lai atkārtotu mitohondriju disfunkciju, kas novērota neironu slimībās, īpaši autisma spektra traucējumos. Šī PPA modeļa izmantošana mitohondriju dinamikas pētīšanai neironos var sniegt ieskatu autisma spektra traucējumu etioloģijā.
Mēs pētījām iespēju izmantot TEM, lai novērotu izmaiņas mitohondriju morfoloģijā. Ir svarīgi atzīmēt, ka TEM ir jāizmanto pareizi, lai maksimāli palielinātu tā efektivitāti. Krioparaugu sagatavošana ļauj labāk saglabāt neironu struktūras, vienlaikus fiksējot šūnu komponentus un samazinot artefaktu veidošanos34. Saskaņā ar to mēs novērojām, ka neironiem līdzīgajām SH-SY5Y šūnām bija neskartas subcelulāras organellas un pagarināti mitohondriji (1.a att.). Tas uzsver kriogēno sagatavošanas metožu lietderību mitohondriju morfoloģijas pētīšanā neironu šūnu modeļos. Lai gan kvantitatīvi mērījumi ir kritiski svarīgi TEM datu objektīvai analīzei, joprojām nav vienprātības par to, kādi konkrēti parametri būtu jāmēra, lai apstiprinātu mitohondriju morfoloģiskās izmaiņas. Pamatojoties uz lielu skaitu pētījumu, kuros kvantitatīvi ir pētīta mitohondriju morfoloģija17,31,32, mēs izstrādājām automatizētu mitohondriju attēlu analīzes kanālu, kas mēra astoņus morfoloģiskos parametrus, proti: laukumu, laukumu2, malu attiecību, perimetru, apaļumu, pakāpi, Fere diametru un apaļumu.
Starp tiem PPA ievērojami samazināja laukumu 2, laukumu, perimetru un Fereta diametru (1.b–e att.). Tas parādīja, ka mitohondriji kļuva mazāki un apaļāki, kas atbilst iepriekšējiem pētījumiem, kuros tika konstatēta mitohondriju laukuma samazināšanās pēc 72 stundām PPA30 izraisīta mitohondriju stresa. Šīs morfoloģiskās pazīmes var liecināt par mitohondriju dalīšanos – nepieciešamu procesu, lai atdalītu bojātos komponentus no mitohondriju tīkla, lai veicinātu to degradāciju caur mitofāgiju35,36,37. No otras puses, vidējā mitohondriju izmēra samazināšanās var būt saistīta ar palielinātu bioģenēzi, kā rezultātā veidojas mazi nascenti mitohondriji. Palielināta dalīšanās vai bioģenēze ir kompensējoša reakcija, lai uzturētu mitozi pret mitohondriju stresu. Tomēr nevar izslēgt samazinātu mitohondriju augšanu, traucētu saplūšanu vai citus apstākļus.
Lai gan ar TEM izveidotie augstas izšķirtspējas attēli ļauj noteikt morfoloģiskās īpašības atsevišķu mitohondriju līmenī, šī metode rada divdimensiju momentuzņēmumus vienā laika punktā. Lai pētītu dinamiskās reakcijas uz vielmaiņas stresu, mēs iekrāsojām mitohondrijus ar TMRE un izmantojām laika ritējuma mikroskopiju ar MEL analīzi, kas ļauj augstas caurlaidības 3D vizualizēt izmaiņas mitohondriju tīklā laika gaitā33,38. Mēs novērojām nelielas, bet nozīmīgas izmaiņas mitohondriju dinamikā PPA stresa apstākļos (2. att.). Pie 3 mM dalīšanās notikumu skaits ievērojami palielinājās, savukārt saplūšanas notikumi palika tādi paši kā kontrolē. Gan dalīšanās, gan saplūšanas notikumu skaita pieaugums tika novērots pie 5 mM PPA, taču šīs izmaiņas bija aptuveni proporcionālas, kas liecina, ka dalīšanās un saplūšanas kinētika sasniedz līdzsvaru augstākās koncentrācijās (2.b att.). Vidējais mitohondriju tilpums nemainījās gan pie 3, gan 5 mM PPA, norādot, ka mitohondriju tīkla integritāte ir saglabāta (2.d att.). Tas atspoguļo dinamisko mitohondriju tīklu spēju reaģēt uz vieglu vielmaiņas stresu, lai efektīvi uzturētu homeostāzi, neizraisot tīkla fragmentāciju. Pie 3 mM PPA dalīšanās pieaugums ir pietiekams, lai veicinātu pāreju uz jaunu līdzsvaru, bet, reaģējot uz stresu, ko izraisa augstākas PPA koncentrācijas, ir nepieciešama dziļāka kinētiskā pārveidošana.
Mitohondriju skaits palielinājās pie abām PPA stresa koncentrācijām, bet vidējais mitohondriju tilpums būtiski nemainījās (2.c att.). Tas var būt saistīts ar palielinātu bioģenēzi vai palielinātu dalīšanos; tomēr, ja vidējais mitohondriju tilpums būtiski nesamazinās, visticamāk, ka palielinās biosintēze. Tomēr 2. attēlā redzamie dati apstiprina divu kompensējošu mehānismu esamību: dalīšanās notikumu skaita palielināšanos, kas atbilst mitohondriju dalīšanās augšupregulācijai, un notikumu skaita palielināšanos, kas atbilst mitohondriju bioģenēzei. Galu galā dinamiskā kompensācija viegla stresa gadījumā var sastāvēt no vienlaicīgiem procesiem, kas ietver dalīšanos, saplūšanu, bioģenēzi un mitofāgiju. Lai gan iepriekšējie autori ir pierādījuši, ka PPA veicina mitozi30,39 un mitofāgiju29, mēs sniedzam pierādījumus par mitohondriju dalīšanās un saplūšanas dinamikas pārveidošanos, reaģējot uz PPA. Šie dati apstiprina TEM novērotās morfoloģiskās izmaiņas un sniedz papildu ieskatu mehānismos, kas saistīti ar PPA izraisītu mitohondriju disfunkciju.
Tā kā ne TEM, ne MEL analīze nesniedza tiešus pierādījumus par gēnu regulēšanas mehānismiem, kas ir novēroto morfoloģisko izmaiņu pamatā, mēs pētījām mitohondriju metabolismā, bioģenēzē un dinamikā iesaistīto gēnu RNS ekspresiju. cMYC protoonkogēns ir transkripcijas faktors, kas iesaistīts mitohondriju, glikolīzes, aminoskābju un taukskābju metabolisma regulēšanā40. Turklāt ir zināms, ka cMYC regulē gandrīz 600 mitohondriju gēnu ekspresiju, kas iesaistīti mitohondriju transkripcijā, translācijā un kompleksu montāžā, tostarp NRF1 un TFAM41. NRF1 un TFAM ir divi centrālie mitozes regulatori, kas darbojas lejpus PGC-1α, lai aktivizētu mtDNS replikāciju. Šo ceļu aktivizē cAMP un AMPK signalizācija, un tas ir jutīgs pret enerģijas patēriņu un vielmaiņas stresu. Mēs arī pētījām NFE2L2, mitohondriju bioģenēzes redoksregulatoru, lai noteiktu, vai PPA ietekmi varētu mediēt oksidatīvais stress.
Lai gan NFE2L2 ekspresija nemainījās, mēs atklājām pastāvīgu, no devas atkarīgu cMYC, NRF1 un TFAM ekspresijas samazināšanos pēc 24 stundu ilgas apstrādes ar 3 mM un 5 mM PPA (3.a–c. att.). Iepriekš ir ziņots, ka cMYC ekspresijas pazemināšanās ir atbilde uz mitohondriju stresu42, un otrādi, cMYC ekspresijas pazemināšanās var izraisīt mitohondriju disfunkciju, pārveidojot mitohondriju metabolismu, tīkla savienojamību un membrānas polarizāciju43. Interesanti, ka cMYC ir iesaistīts arī mitohondriju dalīšanās un saplūšanas regulēšanā42,43, un ir zināms, ka tas palielina DRP1 fosforilēšanos un mitohondriju lokalizāciju šūnu dalīšanās laikā44, kā arī mediē mitohondriju morfoloģisko pārveidošanos neironu cilmes šūnās45. Patiešām, cMYC deficīta fibroblastiem ir samazināts mitohondriju izmērs, kas atbilst PPA43 stresa izraisītajām izmaiņām. Šie dati ilustrē interesantu, bet pagaidām neskaidru saistību starp cMYC un mitohondriju dinamiku, nodrošinot interesantu mērķi turpmākiem PPA stresa izraisītas pārveidošanās pētījumiem.
NRF1 un TFAM samazināšanās atbilst cMYC lomai kā svarīgam transkripcijas aktivatoram. Šie dati atbilst arī iepriekšējiem pētījumiem ar cilvēka resnās zarnas vēža šūnām, kas parādīja, ka PPA samazināja NRF1 mRNS ekspresiju 22 stundu laikā, kas bija saistīts ar ATP samazināšanos un ROS46 palielināšanos. Šie autori arī ziņoja, ka TFAM ekspresija palielinājās pēc 8,5 stundām, bet atgriezās sākotnējā līmenī pēc 22 stundām. Turpretī Kim et al. (2019) parādīja, ka TFAM mRNS ekspresija bija ievērojami samazinājusies pēc 4 stundu PPA stresa SH-SY5Y šūnās; tomēr pēc 72 stundām TFAM olbaltumvielu ekspresija bija ievērojami palielinājusies un mtDNS kopiju skaits bija ievērojami palielinājies. Tādējādi mitohondriju bioģenēzes gēnu skaita samazināšanās, ko novērojām pēc 24 stundām, neizslēdz iespēju, ka mitohondriju skaita palielināšanās ir saistīta ar bioģenēzes aktivāciju agrākos laika punktos. Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka PPA būtiski palielina PGC-1α mRNS un proteīna līmeni SH-SY5Y šūnās 4 stundu 30 minūšu laikā, savukārt propionskābe, izmantojot PGC-1α, 12 stundu 39 minūšu laikā pastiprina mitohondriju bioģenēzi teļu hepatocītos. Interesanti, ka PGC-1α ir ne tikai tiešs NRF1 un TFAM transkripcijas regulators, bet arī ir pierādīts, ka tas regulē MFN2 un DRP1 aktivitāti, regulējot dalīšanos un saplūšanu47. Kopumā tas izceļ ciešo saistību starp mehānismiem, kas regulē PPA izraisītās mitohondriju kompensācijas atbildes. Turklāt mūsu dati atspoguļo ievērojamu bioģenēzes un metabolisma transkripcijas regulācijas disregulāciju PPA stresa apstākļos.
STOML2, OPA1, MFN1, MFN2 un DRP1 gēni ir vieni no mitohondriju dalīšanās, saplūšanas un dinamikas centrālajiem regulatoriem37,48,49. Mitohondriju dinamikā ir iesaistīti daudzi citi gēni, tomēr iepriekš ir atklāts, ka STOML2, OPA1 un MFN2 ir atšķirīgi metilēti ASD kohortās,16 un vairākos neatkarīgos pētījumos ir ziņots par izmaiņām šajos transkripcijas faktoros, reaģējot uz mitohondriju stresu50,51.52. Gan OPA1, gan STOML2 ekspresija tika ievērojami samazināta, apstrādājot ar 3 mM un 5 mM PPA (3.e, f att.). OPA1 ir viens no klasiskajiem mitohondriju saplūšanas regulatoriem, tieši mijiedarbojoties ar MFN1 un 2, un tam ir nozīme kristu pārveidošanā un mitohondriju morfoloģijā53. Precīza STOML2 loma mitohondriju dinamikā joprojām nav skaidra, taču pierādījumi liecina, ka tam ir nozīme mitohondriju saplūšanā, bioģenēzē un mitofāgijā.
STOML2 ir iesaistīts mitohondriju elpošanas savienojuma uzturēšanā un elpošanas ķēdes kompleksu veidošanā54,55, un ir pierādīts, ka tas būtiski maina vēža šūnu vielmaiņas īpašības56. Pētījumi liecina, ka STOML2 veicina mitohondriju membrānas potenciālu un bioģenēzi, mijiedarbojoties ar BAN un kardiolipīnu55, 57, 58. Turklāt neatkarīgi pētījumi ir parādījuši, ka mijiedarbība starp STOML2 un PINK1 regulē mitofagiju59,60. Jāatzīmē, ka ir ziņots, ka STOML2 tieši mijiedarbojas ar MFN2 un stabilizē to, kā arī spēlē svarīgu lomu garo OPA1 izoformu stabilizēšanā, inhibējot proteāzi, kas ir atbildīga par OPA1 degradāciju53,61,62. STOML2 ekspresijas samazināšanās, kas novērota PPA reakcijās, var padarīt šos saplūšanas proteīnus uzņēmīgākus pret degradāciju, izmantojot ubikvitīna un proteasomu atkarīgus ceļus48. Lai gan precīza STOML2 un OPA1 loma dinamiskajā reakcijā uz PPA nav skaidra, šo saplūšanas gēnu samazināta ekspresija (3. attēls) var izjaukt līdzsvaru starp dalīšanos un saplūšanu un izraisīt mitohondriju izmēra samazināšanos (3. attēls). 1).
No otras puses, OPA1 proteīna ekspresija pēc 24 stundām nemainījās, savukārt MFN1, MFN2 vai DRP1 mRNS un proteīna līmenis pēc PPA apstrādes būtiski nemainījās (3.g-i att., 4. att.). Tas var liecināt, ka nav izmaiņu šo mitohondriju saplūšanā un dalīšanās iesaistīto faktoru regulācijā. Tomēr ir vērts atzīmēt, ka katru no šiem četriem gēniem regulē arī pēctranskripcijas modifikācijas (PTM), kas kontrolē proteīnu aktivitāti. OPA1 ir astoņi alternatīvi splaisas varianti, kas mitohondrijos tiek proteolītiski šķelti, veidojot divas atšķirīgas izoformas63. Līdzsvars starp garajām un īsajām izoformām galu galā nosaka OPA1 lomu mitohondriju saplūšanā un mitohondriju tīkla uzturēšanā64. DRP1 aktivitāti regulē kalcija/kalmodulīna atkarīgā proteīnkināzes II (CaMKII) fosforilēšana, savukārt DRP1 degradāciju regulē ubikvitinācija un SUMOilēšana65. Visbeidzot, gan DRP1, gan MFN1/2 ir GTPāzes, tāpēc aktivitāti var ietekmēt GTP ražošanas ātrums mitohondrijos 66. Tādēļ, lai gan šo olbaltumvielu ekspresija paliek nemainīga, tas var neatspoguļot nemainīgu olbaltumvielu aktivitāti vai lokalizāciju 67,68. Patiešām, esošie PTM olbaltumvielu repertuāri bieži kalpo kā pirmā aizsardzības līnija, kas atbild par akūtu stresa reakciju mediāciju. Mūsu modelī, ja ir mērens vielmaiņas stress, ir iespējams, ka PTM veicina saplūšanas un dalīšanās olbaltumvielu aktivitātes palielināšanos, lai pietiekami atjaunotu mitohondriju integritāti, neprasot šo gēnu papildu aktivāciju mRNS vai olbaltumvielu līmenī.
Kopumā iepriekš minētie dati izceļ mitohondriju morfoloģijas sarežģīto un no laika atkarīgo regulāciju un izaicinājumus, kas saistīti ar šo mehānismu noskaidrošanu. Lai pētītu gēnu ekspresiju, vispirms ir jāidentificē specifiski mērķa gēni šajā ceļā. Tomēr mūsu dati liecina, ka gēni vienā ceļā nereaģē vienādi uz vienu un to pašu stresu. Faktiski iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka dažādiem gēniem vienā ceļā var būt atšķirīgi laika reakcijas profili30,46. Turklāt pastāv sarežģīti pēctranskripcijas mehānismi, kas izjauc saistību starp transkripciju un gēnu funkciju. Proteomikas pētījumi var sniegt ieskatu PTM un olbaltumvielu funkcijas ietekmē, taču tie rada arī izaicinājumus, tostarp zemas caurlaidības metodes, augstas signāla un trokšņa attiecības un slikta izšķirtspēja.
Šajā kontekstā mitohondriju morfoloģijas izpētei, izmantojot TEM un MEL, ir liels potenciāls risināt fundamentālus jautājumus par mitohondriju dinamikas un funkcijas saistību un to, kā tā ietekmē slimības. Vissvarīgākais ir tas, ka TEM nodrošina tiešu metodi mitohondriju morfoloģijas mērīšanai kā mitohondriju disfunkcijas un dinamikas konverģentam galapunktam51. MEL nodrošina arī tiešu metodi dalīšanās un saplūšanas notikumu vizualizēšanai trīsdimensiju šūnu vidē, ļaujot kvantitatīvi noteikt dinamisko mitohondriju remodelāciju pat bez izmaiņām gēnu ekspresijā33. Šeit mēs izceļam mitohondriju attēlveidošanas metožu lietderību sekundāru mitohondriju slimību gadījumā. Šīm slimībām parasti raksturīgs hronisks viegls vielmaiņas stress, kam raksturīga smalka mitohondriju tīklu remodelācija, nevis akūti mitohondriju bojājumi. Tomēr mitohondriju kompensācijai, kas nepieciešama, lai uzturētu mitozi hroniska stresa apstākļos, ir dziļas funkcionālas sekas. Neirozinātnes kontekstā labāka šo kompensācijas mehānismu izpratne var sniegt svarīgu informāciju par pleiotropisko neiropatoloģiju, kas saistīta ar mitohondriju disfunkciju.
Galu galā mūsu dati izceļ attēlveidošanas metožu lietderību, lai izprastu sarežģīto mijiedarbību starp gēnu ekspresiju, olbaltumvielu modifikācijām un olbaltumvielu aktivitāti, kas kontrolē neironu mitohondriju dinamiku, funkcionālās sekas. Mēs izmantojām PPA, lai modelētu mitohondriju disfunkciju neironu šūnu modelī, lai iegūtu ieskatu ASD mitohondriju komponentā. Ar PPA apstrādātās SH-SY5Y šūnas uzrādīja izmaiņas mitohondriju morfoloģijā: mitohondriji kļuva mazi un apaļi, un kristas bija slikti definētas, novērojot tās ar TEM. MEL analīze liecina, ka šīs izmaiņas notiek vienlaikus ar dalīšanās un saplūšanas notikumu pieaugumu, lai uzturētu mitohondriju tīklu, reaģējot uz vieglu vielmaiņas stresu. Turklāt PPA būtiski izjauc mitohondriju metabolisma un homeostāzes transkripcijas regulāciju. Mēs identificējām cMYC, NRF1, TFAM, STOML2 un OPA1 kā galvenos mitohondriju regulatorus, ko izjauc PPA stress, un tiem var būt nozīme PPA izraisītu mitohondriju morfoloģijas un funkcijas izmaiņu mediēšanā. Ir nepieciešami turpmāki pētījumi, lai labāk raksturotu PPA izraisītās laika izmaiņas gēnu ekspresijā un olbaltumvielu aktivitātē, lokalizācijā un pēctranslācijas modifikācijās. Mūsu dati izceļ mitohondriju stresa reakcijas starpnieku regulējošo mehānismu sarežģītību un savstarpējo atkarību, kā arī parāda TEM un citu attēlveidošanas metožu lietderību mērķtiecīgākiem mehānisma pētījumiem.
Šūnu līnija SH-SY5Y (ECACC, 94030304-1VL) tika iegādāta no Sigma-Aldrich. SH-SY5Y šūnas tika audzētas Dulbeko modificētā Īgla barotnes/F-12 barības vielu maisījumā (DMEM/F-12) un L-glutamīnā (SC09411, ScienCell) 25 cm2 kolbās, kas papildinātas ar 20% fetālā liellopa seruma (FBS) (10493106, ThermoFisher Scientific) un 1% penicilīna-streptomicīna (P4333-20ML, Sigma-Aldrich) 37 °C temperatūrā, 5% CO2 atmosfērā. Šūnas tika subkultivētas līdz 80% konfluencei, izmantojot 0,05% tripsīna-EDTA (15400054, ThermoFisher Scientific), centrifugētas ar 300 g un uzklātas ar blīvumu aptuveni 7 × 105 šūnas/ml. Visi eksperimenti tika veikti ar nediferencētām SH-SY5Y šūnām starp 19.–22. pasāžu. PPA tiek ievadīts kā NaP. NaP pulveri (CAS Nr. 137-40-6, ķīmiskā formula C3H5NaO2, P5436-100G, Sigma-Aldrich) izšķīdina siltā MilliQ ūdenī līdz 1 M koncentrācijai un uzglabā 4 °C temperatūrā. Apstrādes dienā šo šķīdumu atšķaida ar 1 M PPA līdz 3 mM un 5 mM PPA seruma nesaturošā vidē (DMEM/F-12 ar L-glutamīnu). Visos eksperimentos apstrādes koncentrācijas bija bez PPA (0 mM, kontrole), 3 mM un 5 mM PPA. Eksperimenti tika veikti vismaz trīs bioloģiskajos atkārtojumos.
SH-SY5Y šūnas tika iesētas 25 cm5 kolbās ar ātrumu 5,5 × 105 šūnas/ml un audzētas 24 stundas. PPA apstrāde tika pievienota kolbai pirms 24 stundu inkubācijas. Šūnu nogulsnes tika savāktas, ievērojot parastos zīdītāju audu subkultivēšanas protokolus (aprakstīts iepriekš). Šūnu nogulsnes atkārtoti suspendēja 100 µl 2,5% glutaraldehīda, 1× PBS šķīdumā un uzglabāja 4 °C temperatūrā līdz apstrādei. SH-SY5Y šūnas tika īslaicīgi centrifugētas, lai iegūtu šūnu nogulsnes un atdalītu 2,5% glutaraldehīda, 1× PBS šķīdumu. Nogulsnes atkārtoti suspendēja 4% agarozes želejā, kas sagatavota destilētā ūdenī (agarozes un nogulšņu tilpuma attiecība ir 1:1). Agarozes gabaliņi tika novietoti uz režģiem uz plakanām plāksnēm un pārklāti ar 1-heksadecēnu pirms sasaldēšanas augstspiedienā. Paraugi tika sasaldēti 100% sausā acetonā -90°C temperatūrā 24 stundas. Pēc tam temperatūra tika paaugstināta līdz -80°C un pievienots 1% osmija tetroksīda un 0,1% glutaraldehīda šķīdums. Paraugi tika uzglabāti -80°C temperatūrā 24 stundas. Pēc tam temperatūra pakāpeniski tika paaugstināta līdz istabas temperatūrai vairāku dienu laikā: no –80°C līdz –50°C uz 24 stundām, līdz –30°C uz 24 stundām, līdz –10°C uz 24 stundām un visbeidzot līdz istabas temperatūrai.
Pēc kriogēnās sagatavošanas paraugi tika piesūcināti ar sveķiem un, izmantojot Leica Reichert UltracutS ultramikrotomu (Leica Microsystems), tika izgatavotas īpaši plānas sekcijas (∼100 nm). Sekcijas tika iekrāsotas ar 2% uranilacetātu un svina citrātu. Paraugi tika novēroti, izmantojot FEI Tecnai 20 transmisijas elektronmikroskopu (ThermoFisher (agrāk FEI), Eindhovena, Nīderlande), kas darbojas ar 200 kV spriegumu (Lab6 raidītājs), un Gatan CCD kameru (Gatan, Apvienotā Karaliste), kas aprīkota ar Tridiem enerģijas filtru.
Katrā tehniskajā atkārtojumā tika iegūti vismaz 24 atsevišķu šūnu attēli, kopā 266 attēli. Visi attēli tika analizēti, izmantojot interesējošā reģiona (ROI) makro un mitohondriju makro. Mitohondriju makro ir balstīta uz publicētām metodēm17,31,32 un ļauj veikt TEM attēlu daļēji automatizētu partijas apstrādi programmā Fiji/ImageJ69. Īsumā: attēls tiek invertēts un apgriezts, izmantojot ritošās bumbas fona atņemšanu (60 pikseļu rādiuss) un FFT joslas caurlaides filtru (izmantojot attiecīgi 60 un 8 pikseļu augšējo un apakšējo robežu) un vertikālo līniju slāpēšanu ar orientācijas pielaidi 5%. Apstrādātajam attēlam automātiski tiek noteikts slieksnis, izmantojot maksimālās entropijas algoritmu, un tiek ģenerēta binārā maska. Attēlu reģioni, kas saistīti ar manuāli atlasītiem ROI neapstrādātos TEM attēlos, tika ekstrahēti, raksturojot mitohondrijus un izslēdzot plazmas membrānu un citus augsta kontrasta reģionus. Katram iegūtajam ROI tika analizētas binārās daļiņas, kas lielākas par 600 pikseļiem, un daļiņu laukums, perimetrs, lielā un mazā ass, Fereta diametrs, apaļums un apļveida forma tika mērīta, izmantojot Fiji/ImageJ iebūvētās mērīšanas funkcijas. Sekojot Merrill, Flippo un Strack (2017) pētījumiem, no šiem datiem tika aprēķināts laukums 2, daļiņu malu attiecība (lielās un mazās ass attiecība) un formas faktors (FF), kur FF = perimetrs 2/4π x laukums. Parametriskās formulas definīciju var atrast Merrill, Flippo un Strack (2017) darbā. Minētās makro ir pieejamas vietnē GitHub (skatiet datu pieejamības paziņojumu). Vidēji katrā PPA apstrādē tika analizētas aptuveni 5600 daļiņas, kopā aptuveni 17 000 daļiņu (dati nav parādīti).
SH-SH5Y šūnas tika ievietotas 8 kameru kultūras traukos (ThermoFisher, #155411), lai nodrošinātu adhēziju, uz nakti, un pēc tam inkubētas ar TMRE 1:1000 (ThermoFisher, #T669) un Hoechst 33342 1:200 (Sigma-Aldrich, H6024). Krāsošana. Attēli tika iegūti, izmantojot 405 nm un 561 nm lāzerus 10 minūšu vidē, un neapstrādāti attēli tika iegūti kā z-kaudzes, kas saturēja 10 attēlu mikroattēlus ar az soli 0,2 μm starp attēlu kadriem 12 secīgos laika punktos. Attēli tika savākti, izmantojot Carl Zeiss LSM780 ELYRA PS.1 superizšķirtspējas platformu (Carl Zeiss, Oberkochen, Vācija) ar LCI Plan Apochromate 100x/1.4 Oil DIC M27 lēcu. Attēli tika analizēti ImageJ, izmantojot iepriekš aprakstītu cauruļvadu un ImageJ spraudni, lai izmērītu saplūšanas un dalīšanās notikumus, vidējo mitohondriju struktūru skaitu un vidējo mitohondriju tilpumu uz šūnu33. MEL makro ir pieejami vietnē GitHub (skatiet datu pieejamības paziņojumu).
SH-SY5Y šūnas tika audzētas sešu iedobju plāksnēs ar blīvumu 0,3 × 106 šūnas/ml 24 stundas pirms apstrādes. RNS tika ekstrahēta, izmantojot Quick-RNA™ Miniprep protokolu (ZR R1055, Zymo Research) ar nelielām izmaiņām: pirms izņemšanas katrā iedobē pievieno 300 μl RNS līzes buferšķīduma un katru paraugu lizē pēdējā solī ar 30 μl DNāzes/RNāzes eluēšanas ūdens. Visu paraugu daudzums un kvalitāte tika pārbaudīta, izmantojot NanoDrop ND-1000 UV-Vis spektrofotometru. Kopējais olbaltumvielu daudzums no šūnu lizātiem tika iegūts, izmantojot 200 μl RIPA līzes buferšķīduma, un olbaltumvielu koncentrācija tika kvantitatīvi noteikta, izmantojot Bredforda olbaltumvielu testu70.
kDNS sintēze tika veikta, izmantojot Tetro™ kDNS sintēzes komplektu (BIO-65043, Meridian Bioscience) saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar dažām modifikācijām. kDNS tika sintezēta 20 μl reakcijās, izmantojot 0,7 līdz 1 μg kopējās RNS. Praimeri tika atlasīti no iepriekš publicētiem rakstiem 42, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78 (S1 tabula), un pievienotās zondes tika izstrādātas, izmantojot PrimerQuest rīku no Integrated DNA Technologies. Visi interesējošie gēni tika normalizēti attiecībā pret kodola B2M gēnu. STOML2, NRF1, NFE2L2, TFAM, cMYC un OPA1 gēnu ekspresija tika mērīta ar RT-qPCR. Galvenais maisījums ietvēra LUNA Taq polimerāzi (M3003L, New England Biolabs), 10 μM tiešos un reversos praimerus, kDNS un PCR kvalitātes ūdeni, lai katrai reakcijai iegūtu galīgo tilpumu 10 μL. Dalīšanās un dalīšanās gēnu (DRP1, MFN1/2) ekspresija tika mērīta, izmantojot TaqMan multipleksa testus. Luna Universal Probe qPCR Master Mix (M3004S, New England Biolabs) tika izmantots saskaņā ar ražotāja norādījumiem ar nelielām izmaiņām. Multipleksais RT-qPCR galvenais maisījums ietver 1X LUNA Taq polimerāzi, 10 μM tiešos un reversos praimerus, 10 μM zondi, kDNS un PCR kvalitātes ūdeni, kā rezultātā katras reakcijas galīgais tilpums ir 20 μL. RT-qPCR tika veikta, izmantojot Rotor-Gene Q 6-plex (QIAGEN RG — sērijas numurs: R0618110). Cikla apstākļi ir parādīti S1 tabulā. Visi kDNS paraugi tika amplificēti trīs reizes, un standarta līkne tika ģenerēta, izmantojot desmitkārtīgu atšķaidījumu sēriju. Triplikātu paraugos ar cikla sliekšņa standartnovirzi (Ct) >0,5 no analīzes tika izņemtas novirzes, lai nodrošinātu datu reproducējamību30,72. Relatīvā gēnu ekspresija tika aprēķināta, izmantojot 2-ΔΔCt79 metodi.
Olbaltumvielu paraugi (60 μg) tika sajaukti ar Laemmli ielādes buferi attiecībā 2:1 un apstrādāti ar 12% bezkrāsainu olbaltumvielu gelu (Bio-Rad #1610184). Olbaltumvielas tika pārnestas uz PVDF (polivinilidēnfluorīda) membrānu (#170-84156, Bio-Rad), izmantojot Trans-Blot Turbo sistēmu (#170-4155, Bio-Rad). Membrāna tika bloķēta un inkubēta ar atbilstošajām primārajām antivielām (OPA1, MFN1, MFN2 un DRP1) (atšķaidītas 1:1000) 48 stundas, pēc tam inkubēta ar sekundārajām antivielām (1:10 000) 1 stundu. Pēc tam membrānas tika attēlotas, izmantojot Clarity Western ECL substrātu (#170-5061, Bio-Rad), un reģistrētas, izmantojot Bio-Rad ChemiDoc MP sistēmu. Western blot analīzei tika izmantota ImageLab 6.1 versija. Sākotnējais gels un blots ir parādīti S1 attēlā. Informācija par antivielām ir sniegta S2 tabulā.
Datu kopas ir attēlotas kā vismaz trīs neatkarīgu izlašu vidējais rādītājs un vidējā rādītāja standartkļūda (SEM). Datu kopu normalitāte tika pārbaudīta, izmantojot Šapiro-Vilksa testu (ja vien nav norādīts citādi), pirms tika pieņemts Gausa sadalījums un vienādas standartnovirzes, un tika turpinātas analīzes. Papildus datu kopas analīzei tika izmantots Fišera MEL LSD (p < 0,05), vienvirziena ANOVA (ārstēšanas un kontroles vidējais rādītājs) un Daneta daudzkārtējo salīdzināšanas tests, lai noteiktu nozīmīgumu (p < 0,05). Nozīmīgās p vērtības grafikā ir parādītas kā *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Visas statistiskās analīzes un grafiki tika veikti un ģenerēti, izmantojot GraphPad Prism 9.4.0.
Fiji/ImageJ makro TEM attēlu analīzei ir publiski pieejami vietnē GitHub: https://github.com/caaja/TEMMitoMacro. Mitohondriju notikumu lokatora (MEL) makro ir publiski pieejams vietnē GitHub: https://github.com/rensutheart/MEL-Fiji-Plugin.
Meiliana A., Devi NM un Vidžaja A. Mitohondriji: metabolisma, homeostāzes, stresa, novecošanās un epigenetikas galvenie regulatori. Indonēziešu. Biomedicīnas zinātne. J. 13, 221–241 (2021).
Ben-Shachar, D. Daudzpusīga mitohondriju disfunkcija šizofrēnijas gadījumā, I komplekss kā iespējamais patoloģiskais mērķis. Šizofrēnija. resurss. 187, 3–10 (2017).
Bose, A. un Beal, MF. Mitohondriju disfunkcija Parkinsona slimības gadījumā. J. Neurochemistry. 139, 216–231 (2016).
Šarma V. K., Sings T. G. un Mehta V. Stresa skartie mitohondriji: invāzijas mērķi Alcheimera slimības gadījumā. Mitohondriji 59, 48–57 (2021).
Belenguer P., Duarte JMN, Shook PF un Ferreira GK Mitohondriji un smadzenes: bioenerģētika un citi aspekti. Neirotoksīni. resurss. 36, 219–238 (2019).
Rangaraju, V. u.c. Pleiotropiskie mitohondriji: mitohondriju ietekme uz neironu attīstību un slimībām. J. Neuroscience. 39, 8200–8208 (2019).
Cardaño-Ramos, C. un Morais, VA Mitohondriju bioģenēze neironos: kā un kur. Internacionālisms. J. Mohr. The Science. 22, 13059 (2021).
Yu, R., Lendahl, U., Nister, M. un Zhao, J. Zīdītāju mitohondriju dinamikas regulēšana: iespējas un izaicinājumi. frontālā endokrīnā sistēma. (Lausanne) 11, 374 (2020).
Khacho, M. un Slack, RS. Mitohondriju dinamika neiroģenēzes regulācijā: no attīstības stadijā esošām smadzenēm līdz pieaugušo smadzenēm. development. dynamic. 247, 47–53 (2018).