Pašreizējā adrese: Ķelne 50931, Vācija, Ķelnes Izcilības klasteris Šūnu stresa reakcijas izpētei ar novecošanos saistītās slimībās (CECAD).
Mitohondriju slimību neirodeģenerācija tiek uzskatīta par neatgriezenisku, jo neironu vielmaiņas plastiskums ir ierobežots, bet mitohondriju disfunkcijas ietekme uz neironu metabolisma šūnu autonomiju organismā ir vāji izprasta. Šeit mēs iepazīstinām ar Purkinje neironu ar progresējošu OXPHOS deficītu, ko izraisa traucēta mitohondriju saplūšanas dinamika, šūnām specifisko proteomu. Mēs atklājām, ka mitohondriju disfunkcija izraisīja dziļas pārmaiņas proteomikas jomā, kas galu galā noveda pie precīzu vielmaiņas programmu secīgas aktivizēšanas pirms šūnu nāves. Negaidīti mēs noteicām acīmredzamu piruvātkarboksilāzes (PCx) un citu pretnovecošanās enzīmu indukciju, kas papildina TCA cikla starpproduktus. PCx inhibīcija saasināja oksidatīvo stresu un neirodeģenerāciju, norādot, ka aterosklerozei ir aizsargājoša iedarbība neironos, kuriem trūkst OXPHOS. Mitohondriju saplūšanas atjaunošana termināli deģenerētos neironos pilnībā maina šīs vielmaiņas īpašības, tādējādi novēršot šūnu nāvi. Mūsu atklājumi identificē iepriekš nezināmus ceļus, kas nodrošina noturību pret mitohondriju disfunkciju, un parāda, ka neirodeģenerāciju var mainīt pat slimības vēlīnās stadijās.
Mitohondriju centrālo lomu neironu enerģijas metabolisma uzturēšanā uzsver plašie neiroloģiskie simptomi, kas saistīti ar cilvēka mitohondriju slimībām. Lielāko daļu šo slimību izraisa gēnu mutācijas, kas regulē mitohondriju gēnu ekspresiju (1, 2), vai gēnu destrukcijas, kas saistītas ar mitohondriju dinamiku, kas netieši ietekmē mitohondriju DNS (mtDNS) stabilitāti (3, 4). Pētījumi ar dzīvnieku modeļiem ir parādījuši, ka, reaģējot uz mitohondriju disfunkciju apkārtējos audos, var tikt aktivizēti konservatīvi vielmaiņas ceļi (5–7), kas sniedz svarīgu informāciju padziļinātai šo sarežģīto slimību patogenēzes izpratnei. Turpretī mūsu izpratne par specifisku šūnu tipu vielmaiņas izmaiņām, ko izraisa vispārēja smadzeņu mitohondriju adenozīna trifosfāta (ATF) ražošanas mazspēja, ir fundamentāla (8), uzsverot nepieciešamību identificēt terapeitiskos mērķus, kurus var izmantot slimību profilaksei vai profilaksei. Neirodeģenerācijas novēršanai (9). Informācijas trūkums ir fakts, ka nervu šūnas tiek plaši uzskatītas par ļoti ierobežotām vielmaiņas elastībām, salīdzinot ar apkārtējo audu šūnu tipiem (10). Ņemot vērā, ka šīm šūnām ir galvenā loma metabolītu piegādes koordinēšanā neironiem, lai veicinātu sinaptisko pārnešanu un reaģētu uz traumām un slimībām, spēja pielāgot šūnu metabolismu sarežģītiem smadzeņu audu apstākļiem ir gandrīz tikai gliālajām šūnām (11–14). Turklāt smadzeņu audu raksturīgā šūnu heterogenitāte lielā mērā kavē vielmaiņas izmaiņu izpēti, kas notiek specifiskās neironu apakšgrupās. Tā rezultātā ir maz zināms par precīzām mitohondriju disfunkcijas šūnu un vielmaiņas sekām neironos.
Lai izprastu mitohondriju disfunkcijas vielmaiņas sekas, mēs izolējām Purkinje neironus (PN) dažādās neirodeģenerācijas stadijās, ko izraisa mitohondriju ārējās membrānas saplūšanas (Mfn2) bojāeja. Lai gan Mfn2 mutācijas cilvēkiem ir saistītas ar iedzimtas motorās sensorās neiropātijas formu, kas pazīstama kā Šarko-Marijas-Toota 2A tips (15), Mfn2 nosacīta bojāeja pelēm ir labi atpazīstama oksidācijas fosforilācijas indukcijas (OXPHOS) disfunkcijas metode. Dažādie neironu apakštipi (16–19) un iegūtais neirodeģeneratīvais fenotips ir saistīti ar progresējošiem neiroloģiskiem simptomiem, piemēram, kustību traucējumiem (18, 19) vai cerebellāru ataksiju (16). Izmantojot kvantitatīvas bezmarķēšanas (LFQ) proteomikas, metabolomikas, attēlveidošanas un virusoloģisko metožu kombināciju, mēs parādām, ka progresējoša neirodeģenerācija spēcīgi inducē piruvātkarboksilāzi (PCx) un citus faktorus, kas iesaistīti PN arteriosklerozē in vivo, enzīmu ekspresiju. Lai pārbaudītu šī atklājuma atbilstību, mēs specifiski samazinājām PCx ekspresiju Mfn2 deficīta PN šūnās un atklājām, ka šī darbība saasināja oksidatīvo stresu un paātrināja neirodeģenerāciju, tādējādi pierādot, ka azoospermija nodrošina šūnu nāvei vielmaiņas adaptāciju. Smaga MFN2 ekspresija var pilnībā glābt terminālas deģenerācijas PN ar smagu OXPHOS deficītu, milzīgu mitohondriju DNS patēriņu un acīmredzami bojātu mitohondriju tīklu, kas vēl vairāk uzsver, ka šī neirodeģenerācijas forma var atgūties pat slimības progresēšanas stadijā pirms šūnu nāves.
Lai vizualizētu mitohondrijus Mfn2 izslēgšanas PN šūnās, mēs izmantojām peļu celmu, kas ļauj Cre atkarīgiem mitohondrijiem mērķēt uz dzeltenā fluorescējošā proteīna (YFP) (mtYFP) (20) Cre ekspresiju, un pārbaudījām mitohondriju morfoloģiju in vivo. Mēs atklājām, ka Mfn2 gēna iznīcināšana PN šūnās noved pie pakāpeniskas mitohondriju tīkla dalīšanās (S1A attēls), un agrākās izmaiņas tika konstatētas 3 nedēļu vecumā. Turpretī PN šūnu slāņa būtiskā deģenerācija, ko apliecina Kalbindīna imūnkrāsojuma zudums, nesākās līdz 12 nedēļu vecumam (1. attēls, A un B). Laika neatbilstība starp agrākajām izmaiņām mitohondriju morfoloģijā un redzamo neironu nāves sākumu pamudināja mūs izpētīt vielmaiņas izmaiņas, ko izraisa mitohondriju disfunkcija pirms šūnu nāves. Mēs izstrādājām uz fluorescences aktivētas šūnu šķirošanas (FACS) balstītu stratēģiju, lai izolētu YFP (YFP+) ekspresējošas PN (1.C attēls), un kontroles pelēs (Mfn2 + / loxP :: mtYFP loxP- stop-loxP: : L7-cre), turpmāk tekstā sauktas par CTRL (S1.B attēls). Vārtēšanas stratēģijas optimizācija, kuras pamatā ir YFP signāla relatīvā intensitāte, ļauj mums attīrīt PN YFP+ ķermeni (YFPhigh) no PN, kas nav PN (YFPneg) (S1.B attēls) vai iespējamiem fluorescējošiem aksona/dendrīta fragmentiem (YFPlow; S1.D attēls, pa kreisi), ko apstiprina ar konfokālo mikroskopiju (S1.D attēls, pa labi). Lai pārbaudītu klasificētās populācijas identitāti, mēs veicām LFQ proteomiku un pēc tam galveno komponentu analīzi, un atklājām, ka pastāv skaidra atšķirība starp YFPhigh un YFPneg šūnām (S1.C attēls). YFPhigh šūnās tika novērota zināmu PN marķieru (t. i., Calb1, Pcp2, Grid2 un Itpr3) neto bagātināšanās (21, 22), bet netika novērota neironos vai citos šūnu tipos parasti ekspresēto proteīnu bagātināšanās (1. attēls, D). Salīdzinot neatkarīgos eksperimentos savākto klasificēto YFPhigh šūnu paraugus, korelācijas koeficients bija > 0,9, kas demonstrēja labu reproducējamību starp bioloģiskajiem atkārtojumiem (1. S1. E attēls). Rezumējot, šie dati apstiprināja mūsu plānu akūtai un specifiskai iespējamu PN izolēšanai. Tā kā izmantotā L7-cre draiveru sistēma pirmajā nedēļā pēc dzemdībām inducē mozaīkas rekombināciju (23), mēs sākām peles atlasīt no CTRL un nosacīti (Mfn2 loxP / loxP :: mtYFP loxP-stop-loxP :: L7-cre) vākt neironus. Pēc rekombinācijas pabeigšanas 4 nedēļu vecumā to sauc par Mfn2cKO. Kā beigu punktu mēs izvēlējāmies 8 nedēļu vecumu, kad PN slānis bija neskarts, neskatoties uz acīmredzamo mitohondriju fragmentāciju (1. attēls, B attēls un 1. S1. A attēls). Kopumā mēs kvantitatīvi noteicām 3013 proteīnus, no kuriem aptuveni 22% bija balstīti uz MitoCarta 2.0 anotācijām, kuru pamatā ir mitohondriju proteoma kā mitohondriji (1.E attēls) (24). 8. nedēļā veiktā diferenciālā gēnu ekspresijas analīze parādīja, ka tikai 10,5% no visiem proteīniem bija būtiskas izmaiņas (1.F attēls un S1.F attēls), no kuriem 195 proteīniem bija samazināta ekspresija un 120 proteīniem bija palielināta ekspresija (1.F attēls). Ir vērts atzīmēt, ka šī datu kopas "inovatīvā ceļa analīze" parāda, ka diferenciāli ekspresētie gēni galvenokārt pieder pie ierobežota specifisku metabolisma ceļu kopuma (1.G attēls). Interesanti, ka, lai gan ar OXPHOS un kalcija signalizāciju saistīto ceļu samazināta regulācija apstiprina mitohondriju disfunkcijas indukciju PN ar saplūšanas deficītu, citas kategorijas, kas galvenokārt ietver aminoskābju metabolismu, ir ievērojami paaugstinātas, kas atbilst metabolismam, kas notiek mitohondriju PN. Pārprogrammēšana ir konsekventa.
(A) CTRL un Mfn2cKO peļu smadzenīšu sekciju reprezentatīvas konfokālās fotogrāfijas, kurās redzama progresējoša PN zuduma (kalbindīns, pelēks); kodoli tika iekrāsoti ar DAPI. (B) (A) kvantitatīvā noteikšana (vienvirziena dispersijas analīze, ***P<0,001; n = 4 līdz 6 apļi no trim pelēm). (C) Eksperimentālā darbplūsma. (D) Purkinje (augšā) un citiem šūnu tipiem (vidū) raksturīgo marķieru siltuma kartes sadalījums. (E) Venna diagramma, kas parāda klasificētajā PN identificēto mitohondriju olbaltumvielu skaitu. (F) Diferenciāli ekspresēto olbaltumvielu vulkāna diagramma Mfn2cKO neironos 8 nedēļu laikā (nozīmīguma robežvērtība 1,3). (G) Radošuma ceļa analīze parāda piecus svarīgākos augšupregulācijas (sarkans) un lejupregulācijas (zils) ceļus Mfn2cKO PN, kas klasificēts kā 8 nedēļu vecs. Parādīts katra noteiktā proteīna vidējais ekspresijas līmenis. Pelēktoņu siltuma karte: koriģēta P vērtība. ns, nav svarīgi.
Proteomikas dati parādīja, ka I, III un IV kompleksu olbaltumvielu ekspresija pakāpeniski samazinājās. I, III un IV kompleksi saturēja būtiskas mtDNS kodētas apakšvienības, savukārt II komplekss, kas bija kodēts tikai kodolā, praktiski nemainījās (2.A attēls un S2.A attēls). Saskaņā ar proteomikas rezultātiem smadzenīšu audu griezumu imūnhistoķīmija parādīja, ka IV kompleksa MTCO1 (mitohondriju citohroma C oksidāzes 1. apakšvienības) apakšvienības līmenis PN pakāpeniski samazinājās (2.B attēls). MtDNS kodētā apakšvienība Mtatp8 bija ievērojami samazināta (S2.A attēls), savukārt kodolā kodētās ATP sintāzes apakšvienības līdzsvara stāvokļa līmenis palika nemainīgs, kas atbilst zināmajam stabilajam ATP sintāzes apakšvienības F1 kompleksam, kad mtDNS ekspresija ir stabila. Veidošanās ir konsekventa. Pārtraukums (7). mtDNS līmeņa novērtēšana sakārtotajos Mfn2cKO PN, izmantojot reālā laika polimerāzes ķēdes reakciju (qPCR), apstiprināja pakāpenisku mtDNS kopiju skaita samazināšanos. Salīdzinot ar kontroles grupu, 8 nedēļu vecumā tika saglabāti tikai aptuveni 20% no mtDNS līmeņa (2.C attēls). Saskaņā ar šiem rezultātiem DNS noteikšanai tika izmantota Mfn2cKO PN konfokālās mikroskopijas krāsošana, kas parāda laika atkarīgu mitohondriju nukleotīdu patēriņu (2.D attēls). Mēs atklājām, ka tikai daži kandidāti, kas iesaistīti mitohondriju olbaltumvielu degradācijā un stresa reakcijā, bija paaugstināti, tostarp Lonp1, Afg3l2 un Clpx, kā arī OXPHOS kompleksa montāžas faktori. Apoptozē iesaistīto olbaltumvielu līmeņos netika konstatētas būtiskas izmaiņas (S2.B attēls). Līdzīgi mēs atklājām, ka mitohondrijiem un endoplazmatiskā retikuluma kanāliem, kas iesaistīti kalcija transportā, ir tikai nelielas izmaiņas (S2.C attēls). Turklāt, novērtējot ar autofāgiju saistītos proteīnus, netika konstatētas būtiskas izmaiņas, kas atbilst redzamai autofagosomu indukcijai, kas novērota in vivo ar imūnhistoķīmiju un elektronmikroskopiju (S3 attēls). Tomēr progresējošo OXPHOS disfunkciju PN pavada acīmredzamas ultrastrukturālas mitohondriju izmaiņas. Mitohondriju klasterus var redzēt Mfn2cKO PN šūnu ķermeņos un dendrītkokos 5 un 8 nedēļu vecumā, un iekšējās membrānas struktūra ir piedzīvojusi būtiskas izmaiņas (S4., A un B attēls). Saskaņā ar šīm ultrastrukturālajām izmaiņām un ievērojamu mtDNS samazināšanos, akūtu smadzeņu smadzenīšu šķēļu analīze ar tetrametilrodamīna metilesteri (TMRM) parādīja, ka mitohondriju membrānas potenciāls Mfn2cKO PN bija ievērojami samazinājies (S4.C attēls).
(A) OXPHOS kompleksa ekspresijas līmeņa laika gaitas analīze. Ņemiet vērā tikai olbaltumvielas ar P < 0,05 8 nedēļu laikā (divvirzienu ANOVA). Punktētā līnija: Bez korekcijas salīdzinājumā ar CTRL. (B) Pa kreisi: Smadzenīšu griezuma piemērs, kas marķēts ar anti-MTCO1 antivielu (skalas josla, 20 μm). Purkinje šūnu ķermeņu aizņemtā platība ir pārklāta ar dzeltenu krāsu. Pa labi: MTCO1 līmeņu kvantitatīva noteikšana (vienvirziena dispersijas analīze; n = 7 līdz 20 šūnas, analizētas no trim pelēm). (C) mtDNS kopiju skaita qPCR analīze sakārtotajā PN (vienvirziena dispersijas analīze; n = 3 līdz 7 peles). (D) Pa kreisi: Smadzenīšu griezuma piemērs, kas marķēts ar anti-DNS antivielu (skalas josla, 20 μm). Purkinje šūnu ķermeņu aizņemtā platība ir pārklāta ar dzeltenu krāsu. Pa labi: mtDNS bojājumu kvantitatīva noteikšana (vienvirziena dispersijas analīze; n = 5 līdz 9 šūnas no trim pelēm). (E) Akūta smadzenīšu griezuma piemērs, kurā redzamas mitoYFP + Purkinje šūnas (bultiņa) veselu šūnu plākstera skavas ierakstā. (F) IV līknes kvantitatīva noteikšana. (G) Depolarizējošās strāvas injekcijas reprezentatīvie ieraksti CTRL un Mfn2cKO Purkinje šūnās. Augšējā līkne: pirmais impulss, kas izraisīja AP. Apakšējā līkne: maksimālā AP frekvence. (H) Postsinaptisko spontāno ieeju (sPSP) kvantitatīva noteikšana. Reprezentatīvā ieraksta līkne un tās tālummaiņas koeficients ir parādīti (I). Vienvirziena dispersijas analīze analizēja n = 5 līdz 20 šūnas no trim pelēm. Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM; *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001. (J) Spontānas AP reprezentatīvās līknes, kas reģistrētas, izmantojot perforētā plākstera skavas režīmu. Augšējā līkne: maksimālā AP frekvence. Apakšējā līkne: atsevišķas AP tālummaiņa. (K) Kvantitatīvi nosakiet vidējo un maksimālo AP frekvenci saskaņā ar (J). Manna-Vitnija tests; n = 5 šūnas tika analizētas no četrām pelēm. Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM; nav svarīgi.
8 nedēļas vecam Mfn2cKO PN tika konstatēti acīmredzami OXPHOS bojājumi, kas norāda, ka neironu fizioloģiskā funkcija ir smagi patoloģiska. Tāpēc mēs analizējām OXPHOS deficītu neironu pasīvās elektriskās īpašības 4 līdz 5 nedēļu un 7 līdz 8 nedēļu vecumā, veicot veselu šūnu plāksteru skavu ierakstus akūtās smadzenīšu šķēlītēs (2.E attēls). Negaidīti Mfn2cKO neironu vidējais miera membrānas potenciāls un ieejas pretestība bija līdzīga kontrolei, lai gan starp šūnām bija nelielas atšķirības (1. tabula). Līdzīgi 4 līdz 5 nedēļu vecumā netika konstatētas būtiskas izmaiņas strāvas-sprieguma attiecībās (IV līkne) (2.F attēls). Tomēr neviens Mfn2cKO neirons 7 līdz 8 nedēļu vecumā neizdzīvoja IV režīmu (hiperpolarizācijas posmu), kas norāda, ka šajā vēlīnā stadijā pastāv skaidra jutība pret hiperpolarizācijas potenciālu. Turpretī Mfn2cKO neironos depolarizējošās strāvas, kas izraisa atkārtotus darbības potenciāla (AP) izlādes, ir labi panesamas, kas norāda, ka to kopējie izlādes modeļi būtiski neatšķiras no 8 nedēļas vecu kontroles neironu modeļiem (1. tabula un 2.G attēls). Līdzīgi spontāno postsinaptisko strāvu (sPSC) frekvence un amplitūda bija salīdzināma ar kontroles grupas rādītājiem, un notikumu biežums palielinājās no 4 nedēļām līdz 5 nedēļām, no 7 nedēļām līdz 8 nedēļām ar līdzīgu pieaugumu (2. attēls, H un I). Sinaptiskās nobriešanas periods PN neironos (25). Līdzīgi rezultāti tika iegūti pēc perforētiem PN plāksteriem. Šī konfigurācija novērš iespējamo šūnu ATP defektu kompensāciju, kā tas varētu notikt veselu šūnu plāksteru skavu ierakstīšanā. Jo īpaši Mfn2cKO neironu miera membrānas potenciāls un spontānās aktivācijas frekvence netika ietekmēta (2. attēls, J un K). Rezumējot, šie rezultāti liecina, ka PN ar acīmredzamu OXPHOS disfunkciju var labi tikt galā ar augstfrekvences izlādes modeļiem, norādot, ka pastāv kompensācijas mehānisms, kas ļauj tiem uzturēt gandrīz normālas elektrofizioloģiskās reakcijas.
Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM (vienvirziena dispersijas analīze, Holma-Sidaka daudzkārtējo salīdzināšanas tests; *P<0,05). Vienības numurs ir norādīts iekavās.
Mēs nolēmām izpētīt, vai kāda no proteomikas datu kopas kategorijām (1.G attēls) ietver ceļus, kas var neitralizēt smagu OXPHOS deficītu, tādējādi izskaidrojot, kāpēc skartā PN var saglabāt gandrīz normālu elektrofizioloģiju (2. attēls, E līdz K). . Proteomikas analīze parādīja, ka sazarotās ķēdes aminoskābju (BCAA) katabolismā iesaistīto enzīmu līmenis bija ievērojami paaugstināts (3.A attēls un S5.A attēls), un gala produkts acetil-CoA (CoA) vai sukcinil-CoA var papildināt trikarboksilātus arteriosklerozes skābes (TCA) ciklā. Mēs atklājām, ka gan BCAA transamināzes 1 (BCAT1), gan BCAT2 saturs bija palielināts. Tie katalizē BCAA katabolisma pirmo soli, ģenerējot glutamātu no α-ketoglutarāta (26). Visas apakšvienības, kas veido sazarotās ķēdes keto skābes dehidrogenāzes (BCKD) kompleksu, ir paaugstinātas (komplekss katalizē iegūtā BCAA oglekļa skeleta sekojošo un neatgriezenisko dekarboksilēšanu) (3.A attēls un S5.A attēls). Tomēr šķirotajās PN netika konstatētas acīmredzamas izmaiņas pašā BCAA, kas varētu būt saistīts ar šo neaizvietojamo aminoskābju palielinātu uzņemšanu šūnās vai citu avotu (glikozes vai pienskābes) izmantošanu TCA cikla papildināšanai (S5B attēls). PN, kurām trūkst OXPHOS, 8 nedēļu vecumā arī uzrādīja palielinātu glutamīna sadalīšanos un transaminācijas aktivitāti, ko var atspoguļot mitohondriju enzīmu glutamināzes (GLS) un glutamīna piruvāttransamināzes 2 (GPT2) augšupregulācijā (3. attēls, A un C). Jāatzīmē, ka GLS augšupregulācija aprobežojas ar splicēto izoformu glutamināzi C (GLS-GAC) (Mfn2cKO/CTRL izmaiņas ir aptuveni 4,5 reizes, P = 0,05), un tās specifiskā augšupregulācija vēža audos var atbalstīt mitohondriju bioenerģiju. (27).
(A) Karstuma karte parāda olbaltumvielu līmeņa izmaiņas reizes pēc norādītā ceļa 8 nedēļās. (B) Ar anti-PCx antivielām marķētas smadzenīšu šķēles piemērs (mēroga josla, 20 μm). Dzeltenā bultiņa norāda uz Purkinje šūnu ķermeni. (C) Laika gaitā veikta olbaltumvielu ekspresijas analīze, kas identificēta kā svarīgs aterosklerozes kandidāts (vairākkārtējs t-tests, *FDR <5%; n = 3-5 peles). (D) Augšpusē: shematiska diagramma, kurā parādīti dažādi veidi, kā ievadīt [1-13C]piruvāta marķierī esošo marķēto oglekli (t.i., pa PDH vai transarteriālu ceļu). Apakšā: Vijoles diagramma parāda atsevišķi marķētās oglekļa (M1) procentuālo daudzumu, kas pārvērsts asparagīnskābē, citronskābē un ābolskābē pēc akūtu smadzenīšu šķēļu marķēšanas ar [1-13C]piruvātu (pāru t-tests; ** P <0,01). (E) Visaptveroša norādītā ceļa laika gaitā veikta analīze. Ņemiet vērā tikai olbaltumvielas ar P < 0,05 8 nedēļās. Pārtrauktā līnija: nav korekcijas vērtības (divvirzienu dispersijas analīze; * P < 0,05; *** P < 0,001). Dati ir izteikti kā vidējais rādītājs ± SEM.
Mūsu analīzē BCAA katabolisms ir kļuvis par vienu no galvenajiem augšupregulācijas ceļiem. Šis fakts stingri norāda, ka ventilācijas tilpums, kas nonāk TCA ciklā, var būt mainīts PN bez OXPHOS. Tas varētu būt galvenais neironu metabolisma pārstrukturēšanas veids, kam var būt tieša ietekme uz neironu fizioloģiju un izdzīvošanu smagas OXPHOS disfunkcijas laikā. Saskaņā ar šo hipotēzi mēs atklājām, ka galvenā antiaterosklerotiskā enzīma PCx ekspresija ir augšupregulēta (Mfn2cKO/CTRL mainās aptuveni 1,5 reizes; 3.A attēls), kas katalizē piruvāta pārvēršanu oksaloacetātā (28), kas, domājams, atrodas smadzeņu audos. Ekspresija ir ierobežota ar astrocītiem (29, 30). Saskaņā ar proteomikas rezultātiem konfokālā mikroskopija parādīja, ka PCx ekspresija bija specifiski un ievērojami palielināta PN ar OXPHOS deficītu, savukārt PCx reaktivitāte galvenokārt bija ierobežota ar blakus esošajām Bergmana glijas šūnām kontroles grupā (3.B attēls). Lai funkcionāli pārbaudītu novēroto PCx augšupregulāciju, akūtas smadzenīšu šķēles apstrādājām ar [1-13C]piruvāta marķieri. Kad piruvātu oksidēja piruvāta dehidrogenāze (PDH), tā izotopu marķieris pazuda, bet tas tiek iekļauts TCA cikla starpproduktos, kad piruvāts tiek metabolizēts asinsvadu reakciju rezultātā (3D attēls). Atbalstot mūsu proteomikas datus, mēs novērojām lielu skaitu marķieru no šī marķiera Mfn2cKO šķēļu asparagīnskābē, savukārt citronskābei un ābolskābei bija arī mērena tendence, lai gan ne nozīmīga (3D attēls).
MitoPark peļu dopamīna neironos ar mitohondriju disfunkciju, ko izraisa dopamīna neironu specifiska iznīcināšana mitohondriju transkripcijas faktora A gēnam (Tfam) (S6B attēls), arī PCx ekspresija bija ievērojami paaugstināta (31), kas norāda uz acetonskābes arteriosklerozi. Slimības rašanās tiek regulēta neironu OXPHOS disfunkcijas laikā organismā. Jāatzīmē, ka ir atklāts, ka unikāli enzīmi (32–34), kas var tikt ekspresēti neironos, kuri var būt saistīti ar arteriosklerozi, ir ievērojami paaugstināti PN, kuriem trūkst OXPHOS, piemēram, propionil-CoA karboksilāze (PCC-A), malonil-CoA pārvērš propionil-CoA par sukcinil-CoA, un mitohondriju ābolskābes enzīms 3 (ME3), kura galvenā loma ir piruvāta atgūšana no malāta (3. attēls, A un C) (33, 35). Turklāt mēs atklājām ievērojamu Pdk3 enzīma, kas fosforilē un tādējādi inaktivē PDH, līmeņa paaugstināšanos (36), savukārt Pdp1 enzīmā, kas aktivizē PDH, vai pašā PDH enzīmu kompleksā izmaiņas netika konstatētas (3.A attēls). Atbilstoši tam Mern2cKO PN šūnās bija pastiprināta PDH kompleksa piruvātdehidrogenāzes E1 komponenta α1 apakšvienības α (PDHE1α) apakšvienības fosforilēšanās Ser293 vietā (zināms, ka tas inhibē PDH enzīmu aktivitāti) (S6C attēls) (S6C attēls). Piruvātam nav piekļuves asinsvadiem.
Visbeidzot, mēs atklājām, ka serīna un glicīna biosintēzes superceļš, saistītais mitohondriju folātu (1C) cikls un prolīna biosintēze (1.G attēls un S5.C attēls) visi ir ievērojami pastiprināti aktivācijas procesa laikā. Apkārtējie audi ir aktivizēti ar mitohondriju disfunkciju (5–7). Konfokālā analīze, kas apstiprina šos proteomikas datus, parādīja, ka PN gadījumā ar OXPHOS trūkumu 8 nedēļas vecu peļu smadzenīšu šķēles tika pakļautas serīna hidroksimetiltransferāzei 2 (SHMT2), kas ir galvenais mitohondriju folātu cikla enzīms. Nozīmīga imūnreakcija (S5.D attēls). 13 CU-glikozes inkubētās akūtās smadzenīšu šķēlēs vielmaiņas izsekošanas eksperimenti vēlreiz apstiprināja serīna un prolīna biosintēzes pastiprinātu regulāciju, norādot, ka oglekļa izoformu plūsma serīnā un prolīnā palielinājās (S5.E attēls). Tā kā GLS un GPT2 veicinātās reakcijas ir atbildīgas par glutamāta sintēzi no glutamīna un transamināciju starp glutamātu un α-ketoglutarātu, to regulācijas pieaugums norāda, ka neironiem ar OXPHOS deficītu ir palielināts glutamāta pieprasījums. Tas varētu būt vērsts uz prolīna biosintēzes palielināšanos (S5C attēls). Pretstatā šīm izmaiņām, PN specifisku Mfn2cKO peļu cerebellāro astrocītu proteomikas analīze parādīja, ka šo ceļu (ieskaitot visas antiperoksidāzes) ekspresija būtiski nemainījās, tādējādi pierādot, ka šī vielmaiņas pārorientācija ir selektīva pret degradētu PN (S6. attēls, D līdz G).
Rezumējot, šīs analīzes atklāja ievērojami atšķirīgus specifisku metabolisma ceļu laika aktivācijas modeļus PN. Lai gan patoloģiska neironu mitohondriju funkcija var izraisīt agrīnu aterosklerozi un 1C remodelāciju (3.E attēls un S5.C attēls) un pat paredzamas izmaiņas I un IV kompleksu ekspresijā, serīna de novo sintēzes izmaiņas ir tikai OXPHOS disfunkcija (3.E attēls un S5.C attēls). Tās kļuva acīmredzamas tikai vēlīnās stadijās. Šie atklājumi nosaka secīgu procesu, kurā stresa izraisītā mitohondriālā (1C cikls) un citoplazmatiskā (serīna biosintēze) reaģē sinerģiski ar aterosklerozes pieaugumu TCA ciklā, lai pārveidotu neironu metabolismu.
8 nedēļas veci OXPHOS deficīta PN var uzturēt augstfrekvences ierosmes aktivitāti un veikt ievērojamu vielmaiņas atjaunošanos, lai kompensētu mitohondriju disfunkciju. Šis atklājums rada interesantu iespēju, ka pat šajā brīdī šīs šūnas var saņemt arī terapeitisku iejaukšanos, lai aizkavētu vai novērstu neirodeģenerāciju. Vēlāk mēs atrisinājām šo iespēju, izmantojot divas neatkarīgas intervences. Pirmajā metodē mēs izstrādājām Cre-atkarīgu adeno-asociētā vīrusa (AAV) vektoru, lai MFN2 varētu selektīvi ekspresēt OXPHOS deficīta PN in vivo (S7A attēls). AAV, kas kodē MFN2, un fluorescējošais reportiera gēns mCherry (Mfn2-AAV) tika pārbaudīti primāro neironu kultūrās in vitro, kas izraisīja MFN2 ekspresiju Cre-atkarīgā veidā un atjaunoja mitohondriju morfoloģiju, tādējādi novēršot neiromutāciju Mfn2cKO neironos (S7, B, D un E attēls). Pēc tam mēs veicām in vivo eksperimentus, lai stereotaktiski ievadītu 8 nedēļas vecu Mfn2-AAV Mfn2cKO un kontroles peļu smadzenīšu garozā, un analizējām 12 nedēļas vecas peles (4.A attēls). Apstrādātās Mfn2cKO peles nomira (1., A un B attēls) (16). Vīrusu transdukcija in vivo izraisīja selektīvu PN ekspresiju dažos smadzenīšu apļos (S7., G un H attēls). Kontroles AAV injekcija, kas ekspresē tikai mCherry (Ctrl-AAV), būtiski neietekmēja neirodeģenerācijas pakāpi Mfn2cKO dzīvniekiem. Turpretī ar Mfn2-AAV transducēto Mfn2cKO analīze parādīja ievērojamu PN šūnu slāņa aizsargājošo efektu (4., B un C attēls). Jo īpaši neironu blīvums šķiet gandrīz neatšķirams no kontroles dzīvniekiem (4., B un C attēls un S7., H un I attēls). MFN1, bet ne MFN2, ekspresija ir vienlīdz efektīva neironu nāves novēršanā (4.C attēls un S7., C un F attēls), kas norāda, ka ektopiskā MFN1 ekspresija var efektīvi kompensēt MFN2 trūkumu. Turpmāka analīze atsevišķu PN līmenī parādīja, ka Mfn2-AAV lielā mērā atjaunoja mitohondriju ultrastruktūru, normalizēja mtDNS līmeni un mainīja antiangioģenēzes marķiera PCx ​​augsto ekspresiju (4. attēls, C līdz E). Atgūto Mfn2cKO peļu vizuāla pārbaude miera stāvoklī parādīja, ka to stāja un motoriskie simptomi (kustība S1 līdz S3) bija uzlabojušies. Noslēgumā jāsaka, ka šie eksperimenti parāda, ka aizkavēta MFN2 atkārtota ievadīšana PN, kurās ir izteikts OXPHOS deficīts, ir pietiekama, lai mainītu mtDNS patēriņu un izraisītu aterosklerozi, tādējādi novēršot aksonu deģenerāciju un neironu nāvi in ​​vivo.
(A) Shēma, kurā parādīts eksperimentālais grafiks AAV, kas kodē MFN2, injicēšanai, kad norādītais vielmaiņas ceļš ir aktivizēts. (B) 12 nedēļas vecu smadzenīšu šķēļu reprezentatīvi konfokālie attēli, kas transducēti 8 nedēļu vecumā Mfn2cKO pelēm un marķēti ar anti-Calbindin antivielām. Labajā pusē: aksona šķiedru mērogošana. Aksonu tālummaiņas mērogs ir 450 un 75 μm. (C) Kreisajā pusē: Purkinje šūnu blīvuma kvantitatīva noteikšana AAV transdukcijas cilpā (AAV+) (vienvirziena dispersijas analīze; n = 3 peles). Labajā pusē: mtDNS fokusa analīze transducētā PN 12. nedēļā (nepāra t-tests; n = 6 šūnas no trim pelēm). * P <0,05; ** P <0,01. (D) Mfn2cKO smadzenīšu sekciju PN reprezentatīvi transmisijas elektronu mikroattēli, kas transducēti ar norādītajiem vīrusu vektoriem. Rozā maska ​​ilustrē dendrītu aizņemto laukumu, un dzeltenais punktētais kvadrāts ilustrē labajā pusē redzamo tālummaiņu; n apzīmē kodolu. Mēroga josla, 1 μm. (E) parāda PCx iekrāsošanas piemēru PN, kas transducēts 12 nedēļās. Mēroga josla, 20 μm. OE, pārekspresija; FC, krokas izmaiņas.
Visbeidzot, mēs pētījām peroksidāzes inducētās šūnu izdzīvošanas nozīmi PN, kurām ir bijusi OXPHOS disfunkcija. Mēs ģenerējām mCherry, kas kodē AAV-shRNS (īsas matadatas RNS), īpaši mērķējot uz peles PCx mRNS (AAV-shPCx), un injicējām vīrusu vai tā sajaukto kontroli (AAV-scr) Mfn2cKO peļu smadzenītēs. Injekcija tika veikta ceturtajā dzīves nedēļā (5.A attēls), lai panāktu efektīvu PCx nomākšanu periodā, kad PCx ekspresija palielinājās (3.C attēls) un PN šūnu slānis joprojām bija neskarts (1.A attēls). Ir vērts atzīmēt, ka PCx nomākšana (S8.A attēls) ievērojami paātrinās PN nāvi, kas aprobežojas ar inficēto gredzenu (5., B un C attēls). Lai izprastu PCx augšupregulācijas izraisīto vielmaiņas efektu mehānismu, mēs pētījām PN redoksa statusu pēc PCx ​​noklusēšanas, un vienlaikus tika ekspresēts AAV mediēts optiskais biosensors Grx1-roGFP2 (S8. attēls, B līdz D), lai novērtētu glutationa peptīdu redoksa potenciāla relatīvās izmaiņas (38). Pēc tam mēs veicām divu fotonu fluorescences mūža attēlveidošanas mikroskopiju (FLIM) 7 nedēļu vecu Mfn2cKO vai kontroles metiena akūtās smadzeņu šķēlēs, lai noteiktu iespējamās citoplazmas redoksa statusa izmaiņas pēc FLIM apstākļu pārbaudes (S8. attēls, E līdz G). Analīze parādīja ievērojamu oksidācijas stāvokļa pieaugumu atsevišķām Mfn2cKO PN, kurām trūkst PCx ekspresijas, kas atšķiras no kontroles neironiem vai Mfn2cKO PN, kas ekspresē tikai kodētu shRNS (5. attēls, D un E). Kad PCx ekspresija tika samazināta, Mfn2cKO PN procentuālais daudzums, kas uzrāda ļoti oksidētu stāvokli, palielinājās vairāk nekā trīs reizes (5.E attēls), norādot, ka PCx augšupregulācija saglabāja deģenerēto neironu redoksspēju.
(A) Shēma, kurā parādīts eksperimentālais grafiks AAV, kas kodē shPCx, injicēšanai, kad norādītais metabolisma ceļš ir aktivizēts. (B) Reprezentatīvas konfokālās fotogrāfijas ar 8 nedēļas veciem Mfn2cKO pelēm, kas transducētas un marķētas ar anti-kalcineurīna antivielām 4 nedēļu vecumā. Mēroga josla, 450 μm. (C) Purkinje šūnu blīvuma kvantitatīva noteikšana AAV transducētās cilpās (vienvirziena dispersijas analīze; n = 3 līdz 4 peles). Dati ir izteikti kā vidējais ± SEM; ***P<0,001. (D) Reprezentatīvs FLIM attēls parāda 7 nedēļas vecu PN, kas ekspresē glutationa redoksa sensoru Grx1-roGFP2, vidējo dzīves ilgumu noteiktos eksperimentālos apstākļos. LUT (uzmeklēšanas tabulas) attiecība: izdzīvošanas laika intervāls (pikosekundēs). Mēroga josla, 25 μm. (E) Histogramma parāda Grx1-roGFP2 dzīves ilguma vērtību sadalījumu no (D) (n = 158 līdz 368 šūnas divās pelēs katrā stāvoklī). Sektordiagramma virs katras histogrammas: parāda šūnu skaitu ar ievērojami garākām (sarkanām, oksidētām) vai īsākām (zilām, samazinātām) dzīves ilguma vērtībām, kas pārsniedz 1 SD no vidējās dzīves ilguma vērtības CTRL-AAV-scr. (F) Piedāvātais modelis parāda neironu PCx augšupregulācijas aizsargājošo efektu.
Kopumā šeit sniegtie dati liecina, ka MFN2 atkārtota ekspresija var pilnībā glābt progresējošu PN ar smagu OXPHOS deficītu, smagu mtDNS noplicināšanos un ārkārtīgi patoloģisku ista līdzīgu morfoloģiju, tādējādi nodrošinot nepārtrauktu progresu pat progresējošu slimību gadījumā. Neirodeģenerācija sniedz atgriezeniskus pierādījumus par stadiju pirms šūnu nāves. Šo vielmaiņas elastības pakāpi vēl vairāk uzsver neironu spēja izraisīt aterosklerozi (TCA cikla pārprogrammēšana), kas kavē PCx ekspresiju PN, kurām trūkst OXPHOS, un veicina šūnu nāvi, tādējādi spēlējot aizsargājošu lomu (5.F attēls).
Šajā pētījumā mēs sniedzām pierādījumus tam, ka PN reakcija uz OXPHOS disfunkciju ir pakāpeniski konverģēt uz TCA cikla aterosklerozi, izmantojot diferenciālās aktivācijas ceļu, ko aktivizē vielmaiņas programmas. Mēs apstiprinājām proteomikas analīzi ar daudzām papildinošām metodēm un atklājām, ka, saskaroties ar smagu mitohondriju disfunkciju, neironiem piemīt iepriekš nezināma vielmaiņas elastības forma. Par mūsu pārsteigumu viss pārprogrammēšanas process ne vienmēr iezīmē terminālo vielmaiņas stāvokli, kas pakāpeniski un neatgriezeniski pavada neirodeģenerāciju, taču mūsu dati liecina, ka tas var veidot uzturēšanas neironu pat stadijā pirms šūnu nāves (funkcionālās kompensācijas mehānisms). Šis atklājums norāda, ka neironiem organismā ir ievērojama vielmaiņas plastiskuma pakāpe. Šis fakts pierāda, ka vēlāka MFN2 atkārtota ieviešana var mainīt galveno vielmaiņas marķieru ekspresiju un novērst PN deģenerāciju. Gluži pretēji, tas kavē aterosklerozi un paātrina nervus. transseksuālis.
Viens no aizraujošākajiem atklājumiem mūsu pētījumā ir tas, ka perifērās neironu šūnas (PN), kurām trūkst OXPHOS, var modificēt TCA cikla metabolismu, palielinot enzīmu līmeni, kas specifiski stimulē arteriosklerozi. Metabolisma pārkārtošanās ir vēža šūnu kopīga iezīme, un dažas no tām izmanto glutamīnu, lai papildinātu TCA cikla starpproduktus, lai ražotu reducējošos ekvivalentus, kas vada elpošanas ķēdi un uztur lipīdu un nukleotīdu biosintēzes prekursoru ražošanu (39, 40). Nesen veikts pētījums parādīja, ka perifērajos audos, kuros ir OXPHOS disfunkcija, glutamīna/glutamāta metabolisma atjaunošana ir arī ievērojama iezīme (5, 41), kur glutamīna iekļūšanas virziens TCA ciklā ir atkarīgs no OXPHOS bojājuma smaguma pakāpes (41). Tomēr trūkst skaidru pierādījumu par neironu metabolisma plastiskuma līdzību organismā un tā iespējamo nozīmi slimības kontekstā. Nesenā in vitro pētījumā tika pierādīts, ka primārie kortikālie neironi mobilizē glutamāta krājumus neirotransmisijai, tādējādi veicinot oksidatīvo metabolismu un aterosklerozi vielmaiņas stresa apstākļos (42). Jāatzīmē, ka TCA cikla enzīma sukcināta dehidrogenāzes farmakoloģiskās inhibīcijas ietekmē tiek uzskatīts, ka piruvāta karboksilēšana uztur oksalacetāta sintēzi kultivētās smadzenīšu granulu neironos (34). Tomēr šo mehānismu fizioloģiskā nozīme smadzeņu audos (kur tiek uzskatīts, ka ateroskleroze galvenokārt aprobežojas ar astrocītiem) joprojām ir svarīga (43). Šajā gadījumā mūsu dati liecina, ka OXPHOS bojātie neironu neironu neironukleotīdi (PN) var tikt pārslēgti uz BCAA degradāciju un piruvāta karboksilēšanu, kas ir divi galvenie TCA starpproduktu papildināšanas avoti. Lai gan ir ierosināta BCAA katabolisma iespējamā ietekme uz neironu enerģijas metabolismu, papildus glutamāta un GABA lomai neirotransmisijā (44), joprojām nav pierādījumu par šiem mehānismiem in vivo. Tāpēc ir viegli spekulēt, ka disfunkcionāli PN var automātiski kompensēt asimilācijas procesa izraisīto TCA starpproduktu patēriņu, palielinot aterosklerozi. Jo īpaši PCx regulācijas paaugstināšana var būt nepieciešama, lai uzturētu paaugstinātu asparagīnskābes pieprasījumu, kas tiek ieteikts proliferējošās šūnās ar mitohondriju disfunkciju (45). Tomēr mūsu metabolomikas analīze neatklāja būtiskas izmaiņas asparagīnskābes līdzsvara stāvoklī Mfn2cKO PN (S6A. attēls), kas, iespējams, atspoguļo atšķirīgo asparagīnskābes metabolisma izmantošanu starp proliferējošām šūnām un postmitotiskiem neironiem. Lai gan precīzs PCx regulācijas paaugstināšanas mehānisms disfunkcionālos neironos in vivo vēl nav raksturots, mēs pierādījām, ka šai priekšlaicīgajai reakcijai ir svarīga loma neironu redoksa stāvokļa uzturēšanā, kas tika pierādīts FLIM eksperimentos ar smadzenīšu šķēlītēm. Jo īpaši PN PCx regulācijas paaugstināšanas novēršana var izraisīt oksidētāku stāvokli un paātrināt šūnu nāvi. BCAA degradācijas aktivācija un piruvāta karboksilēšana nav veidi, kā raksturot mitohondriju disfunkcijas perifēros audus (7). Tāpēc tās šķiet OXPHOS deficīta neironu prioritāra iezīme, pat ja ne vienīgā iezīme, kas ir svarīga neirodeģenerācijai.
Smadzeņu slimība ir heterogēns neirodeģeneratīvas slimības veids, kas parasti izpaužas kā ataksija un bieži bojā perifērās neironiskās šūnas (PN) (46). Šī neironu populācija ir īpaši neaizsargāta pret mitohondriju disfunkciju, jo to selektīvā deģenerācija pelēm ir pietiekama, lai reproducētu daudzus motoriskos simptomus, kas raksturo cilvēka spinocerebelāro ataksiju (16, 47, 48). Saskaņā ar ziņojumiem transgēnas peles modelis ar mutantu gēnu ir saistīts ar cilvēka spinocerebelāro ataksiju un tam ir mitohondriju disfunkcija (49, 50), uzsverot OXPHOS deficīta seku izpētes nozīmi PNPH. Tāpēc tas ir īpaši piemērots, lai efektīvi izolētu un pētītu šo unikālo neironu populāciju. Tomēr, ņemot vērā, ka PN ir ļoti jutīgas pret spiedienu un veido nelielu daļu no visas smadzenīšu šūnu populācijas, daudzos uz omiku balstītos pētījumos to selektīva atdalīšana kā veselas šūnas joprojām ir sarežģīts aspekts. Lai gan gandrīz neiespējami panākt absolūtu citu šūnu tipu (īpaši pieaugušo audu) piesārņojuma neesamību, mēs apvienojām efektīvu disociācijas soli ar FACS, lai iegūtu pietiekamu skaitu dzīvotspējīgu neironu tālākai proteomikas analīzei un iegūtu diezgan augstu olbaltumvielu pārklājumu (aptuveni 3000 olbaltumvielu), salīdzinot ar esošo datu kopu par visu smadzenītēm (51). Saglabājot visu šūnu dzīvotspēju, šeit piedāvātā metode ļauj mums ne tikai pārbaudīt vielmaiņas ceļu izmaiņas mitohondrijos, bet arī pārbaudīt izmaiņas to citoplazmatiskajos analogos, kas papildina mitohondriju membrānas marķieru izmantošanu, lai bagātinātu šūnu tipu. Jaunā metode mitohondriju skaita noteikšanai sarežģītos audos (52, 53). Mūsu aprakstītā metode ir saistīta ne tikai ar Purkinje šūnu pētījumiem, bet to var viegli pielietot jebkura veida šūnām, lai risinātu vielmaiņas izmaiņas slimās smadzenēs, tostarp citos mitohondriju disfunkcijas modeļos.
Visbeidzot, mēs esam identificējuši terapeitisko logu šajā vielmaiņas pārkārtošanās procesā, kas var pilnībā novērst galvenās šūnu stresa pazīmes un novērst neironu deģenerāciju. Tādēļ šeit aprakstītās pārstrukturēšanas funkcionālo seku izpratne var sniegt fundamentālu ieskatu iespējamās neironu dzīvotspējas saglabāšanas ārstēšanas metodēs mitohondriju disfunkcijas laikā. Lai pilnībā atklātu šī principa piemērojamību citām neiroloģiskām slimībām, ir nepieciešami turpmāki pētījumi, kuru mērķis ir analizēt enerģijas metabolisma izmaiņas citos smadzeņu šūnu tipos.
MitoPark peles ir aprakstītas iepriekš (31). C57BL/6N peles ar loxP flanking Mfn2 gēniem ir aprakstītas iepriekš (18) un krustotas ar L7-Cre pelēm (23). Iegūtie dubultheterozigoti pēcnācēji pēc tam tika krustoti ar homozigotām Mfn2loxP/Mfn2loxP pelēm, lai ģenerētu Purkinje specifiskus gēnu izslēgšanas variantus Mfn2 (Mfn2loxP/Mfn2loxP; L7-cre). Pārošanās apakškopā Gt (ROSA26) SorStop-mito-YFP alēle (stop-mtYFP) tika ievadīta, veicot papildu krustojumus (20). Visas dzīvnieku procedūras tika veiktas saskaņā ar Eiropas, nacionālajām un iestāžu vadlīnijām un apstiprinātas LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Ziemeļreinā-Vestfālenē, Vācijā. Darbs ar dzīvniekiem atbilst arī Eiropas Laboratorijas dzīvnieku zinātņu asociāciju federācijas vadlīnijām.
Pēc grūtnieces kakla dislokācijas anestēzijas peles embrijs tiek izolēts (E13). Kortekss tiek sadalīts Hanksa līdzsvarotā sāls šķīdumā (HBSS), kas papildināts ar 10 mM Hepes, un tiek kultivēts Dulbeko modificētā Īgla vidē, kas satur papaīnu (20 U/ml) un cisteīnu (1 μg/ml). Audus inkubē DMEM vidē (Ml) un disociē ar fermentatīvu gremošanu 37°C temperatūrā 20 minūtes, pēc tam mehāniski samaļ DMEM vidē, kas papildināta ar 10% fetāla liellopa seruma. Šūnas tiek iesētas uz stikla segstikliņiem, kas pārklāti ar polilizīnu, ar blīvumu 2×106 uz 6 cm kultūras trauku vai ar blīvumu 0,5×105 šūnas/cm2 attēlveidošanas analīzei. Pēc 4 stundām barotne tiek aizstāta ar neirobasālu seruma nesaturošu barotni, kas satur 1% B27 piedevu un 0,5 mM GlutaMax. Pēc tam neironi visa eksperimenta laikā tika turēti 37°C temperatūrā un 5% CO2 atmosfērā, un tos baroja reizi nedēļā. Lai in vitro inducētu rekombināciju, otrajā dienā in vitro neironu apstrādei tika izmantoti 3 μl (24 iedobju kultūras trauciņš) vai 0,5 μl (24 iedobju plate) šāda AAV9 vīrusa vektora: AAV9.CMV.PI.eGFP.WPRE.bGH (Addgene, kataloga numurs 105530-AAV9) un AAV9.CMV.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 (Addgene, kataloga numurs 105545-AAV9).
Peles Mfn1 un Mfn2 komplementārā DNS (iegūta attiecīgi no Addgene plazmīdām #23212 un #23213) ir marķēta ar V5 secību (GKPIPNPLLGLDST) C galā un ir sapludināta ar mCherry ietvarā, izmantojot T2A secību. Grx1-roGFP2 ir dāvana no Heidelberg TP Dick DFKZ (Deutsches Krebsforschungszentrum). Aizvietojot tdTomato kaseti, izmantojot parastās klonēšanas metodes, kasete tika subklonēta pAAV-CAG-FLEX-tdTomato mugurkaulā (Addgene atsauces numurs 28306), lai ģenerētu pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5, pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN1-V5 un pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 vektorus. Līdzīga stratēģija tika izmantota, lai ģenerētu kontroles vektoru pAAV-CAG-FLEX-mCherry. Lai ģenerētu AAV-shPCx konstrukciju, ir nepieciešams plazmīdas AAV vektors (VectorBuilder, pAAV [shRNA] -CMV-mCherry-U6-mPcx- [shRNA#1]), kas satur DNS sekvenci, kas kodē shRNS, kas mērķē uz peles PCx (5′CTTTCGCTCTAAGGTGCTAAACTCGAGTTTAGCACCTTAGAGCGAAAG 3′). U6 promotera kontrolē mCherry tiek izmantots CMV promotera kontrolē. Palīgvektoru AAV iegūšana tika veikta saskaņā ar ražotāja norādījumiem (Cell Biolabs). Īsāk sakot, izmantojiet pārneses plazmīdu, kas satur mCherry-T2A-MFN2-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5), mCherry-T2A-MFN1-V5 (pAAV-CAG-FLEX-mCherry), lai īslaicīgi transfektētu 293AAV šūnas-T2A-MFN1-V5), mCherry (pAAV-CAG-FLEX-mCherry) vai Grx-roGFP2 (pAAV-CAG-FLEX-Grx-roGFP2) kodējošo gēnu, kā arī kodējošo AAV1 kapsīda proteīnu un aksesuārā proteīna iepakošanas plazmīdas plazmīdu, izmantojot kalcija fosfāta metodi. Neattīrīts vīrusa supernatants tika iegūts, izmantojot sasaldēšanas-atkausēšanas ciklus sausā ledus/etanola vannā, un šūnas lizēja fosfātu buferētā fizioloģiskā šķīdumā (PBS). AAV vektors tika attīrīts ar pārtrauktu jodiksanola gradienta ultracentrifugēšanu (24 stundas pie 32 000 apgr./min un 4 °C temperatūrā) un koncentrēts, izmantojot Amicon ultra-15 centrbēdzes filtru. AAV1-CAG-FLEX-mCherry-T2A-MFN2-V5 genoma titrs [2,9 × 1013 genoma kopija (GC)/ml], AAV1-CAG-FLEX-mCherry (6,1 × 1012 GC/ml), AAV1-CAG-FLEX genoma titrs bija tāds, kā aprakstīts iepriekš (54), mērīts ar reālā laika kvantitatīvo PCR (qPCR) -MFN1-V5 (1,9 × 1013 GC/ml) un AAV1-CAG-FLEX-Grx-roGFP2 (8,9 × 1012 GC/ml).
Primārie neironi tika nokasīti ledusaukstā 1x PBS, sagrauzdēti un pēc tam homogenizēti 0,5% Triton X-100 / 0,5% nātrija deoksiholāta/PBS līzes buferšķīdumā, kas satur fosfatāzi un proteāzes inhibitoru (Roche). Olbaltumvielu kvantitatīvā noteikšana tika veikta, izmantojot bicinhonīnskābes testu (Thermo Fisher Scientific). Pēc tam olbaltumvielas tika atdalītas ar SDS-poliakrilamīda gela elektroforēzi un pēc tam blotētas uz polivinilidēnfluorīda membrānas (GE Healthcare). Bloķējiet nespecifiskas vietas un inkubējiet ar primāro antivielu (sīkāku informāciju skatīt S1 tabulā) 5% pienā TBST (Tris buferēts sāls šķīdums ar Tween), veicot mazgāšanas darbības un sekundāro antivielu TBST inkubatorā. Inkubējiet ar primāro antivielu nakti +4°C temperatūrā. Pēc mazgāšanas uzklājiet sekundāro antivielu 2 stundas istabas temperatūrā. Pēc tam, inkubējot to pašu blotu ar anti-β-aktīna antivielu, tika apstiprināta tā pati slodze. Detekcija, pārveidojot par ķīmisko luminiscenci un pastiprinot ķīmisko luminiscenci (GE Healthcare).
Neironi, kas iepriekš bija iesēti uz stikla segstikliem, tika fiksēti ar 4% paraformaldehīdu (PFA)/PBS norādītajā laika punktā istabas temperatūrā 10 minūtes. Segstikliņus vispirms 5 minūtes istabas temperatūrā caurlaidināja ar 0,1% Triton X-100/PBS un pēc tam bloķējošā buferšķīdumā [3% liellopu seruma albumīns (BSA)/PBS]. Otrajā dienā segstikliņus mazgāja ar bloķējošo buferšķīdumu un 2 stundas istabas temperatūrā inkubēja ar atbilstošu fluorofora konjugētu sekundāro antivielu; visbeidzot, paraugus rūpīgi mazgāja PBS ar 4',6-diamidino-2-fenilindolu (DAPI), iekrāsoja ar pretkrāsu un pēc tam fiksēja uz mikroskopa stikliņa ar Aqua-Poly/Mount.
Pelēm (tēviņiem un mātītēm) tika veikta anestēzija, intraperitoneāli injicējot ketamīnu (130 mg/kg) un ksilazīnu (10 mg/kg), un subkutāni ievadot karprofēna pretsāpju līdzekli (5 mg/kg), un ievietotas stereotaksiskā instrumentā (Kopf), kas aprīkots ar siltu spilventiņu. Atsegtu galvaskausu un ar zobu urbi retinātu smadzenīšu garozas daļu, kas atbilst mis kaulam (no lambda: aste 1,8, laterālā 1, kas atbilst lobulām IV un V). Ar izliektu šļirces adatu uzmanīgi izveidotu nelielu caurumu galvaskausā, lai nepārtraucētu zemāk esošo asinsvadu sistēmu. Pēc tam mikrocaurumā (no -1,3 līdz -1 cietā smadzeņu apvalka ventrālajā pusē) lēnām ievietotu plānu izvilktu stikla kapilāru, un mikroinjektorā (Narishige) ar manuālām šļircēm (Narishige) vairākas reizes zemā spiedienā 10 līdz 20 minūšu laikā injicētu 200 līdz 300 nl AAV. Pēc infūzijas kapilāru ievieto vēl uz 10 minūtēm, lai vīruss varētu pilnībā izplatīties. Pēc kapilāru izvilkšanas āda tiek rūpīgi sašūta, lai mazinātu brūces iekaisumu un ļautu dzīvniekam atveseļoties. Dzīvnieki pēc operācijas vairākas dienas tika ārstēti ar pretsāpju līdzekļiem (kaspofēnu), kuru laikā tika rūpīgi uzraudzīts viņu fiziskais stāvoklis, un pēc tam norādītajā laikā viņi tika eitanizēti. Visas procedūras tika veiktas saskaņā ar Eiropas, nacionālajām un iestāžu vadlīnijām, un tās bija apstiprinājusi LandesamtfürNatur of Umwelt and Verbraucherschutz, Ziemeļreinā-Vestfālenē, Vācijā.
Dzīvniekiem tika veikta anestēzija ar ketamīnu (100 mg/kg) un ksilazīnu (10 mg/kg), un sirds vispirms tika perfuzēta ar 0,1 M PBS un pēc tam ar 4% PFA PBS. Audi tika preparēti un fiksēti 4% PFA/PBS nakti 4°C temperatūrā. Sagitālu griezumu (50 μm biezumu) sagatavošanai no fiksētajām smadzenēm PBS tika izmantots vibrācijas nazis (Leica Microsystems GmbH, Vīne, Austrija). Ja vien nav norādīts citādi, brīvi peldošo griezumu krāsošana tika veikta, kā aprakstīts iepriekš (13), istabas temperatūrā un maisot. Īsāk sakot, vispirms iegūtās šķēles tika permeabilizētas ar 0,5% Triton X-100/PBS 15 minūtes istabas temperatūrā; dažu epitopu (Pcx un Shmt2) gadījumā, izmantojot tris-EDTA buferšķīdumu 80°C temperatūrā (pH 9), šķēles tika karsētas 25 minūtes šīs darbības vietā. Pēc tam griezumi tika inkubēti ar primāro antivielu (sk. S1 tabulu) bloķējošā buferšķīdumā (3% BSA/PBS) 4°C temperatūrā nakti, maisot. Nākamajā dienā griezumi tika mazgāti ar bloķējošo buferšķīdumu un inkubēti ar atbilstošu fluorofora konjugētu sekundāro antivielu 2 stundas istabas temperatūrā; visbeidzot, griezumi tika rūpīgi mazgāti PBS, iekrāsoti ar DAPI un pēc tam fiksēti ar AquaPolymount uz mikroskopa stikliņa.
Parauga attēlveidošanai tika izmantots lāzera skenēšanas konfokālais mikroskops (TCS SP8-X vai TCS Digital Light Sheet, Leica Microsystems), kas aprīkots ar baltās gaismas lāzeru un 405 diodes ultravioleto lāzeru. Ierosinot fluoroforu un savācot signālu ar hibrīddetektoru (HyDs), tika izmantota LAS-X programmatūra, lai secīgā režīmā apkopotu sakrautus attēlus, kas atbilst Nyquist paraugu ņemšanai: nekvantitatīvām paneļiem tie ir ļoti dinamiski signāli (piemēram, somatiskajās šūnās un dendritos (mtYFP). Izmantojiet HyD, lai noteiktu PN skaitu BrightR režīmā. Lai samazinātu fonu, tiek izmantota sinhronizācija no 0,3 līdz 6 ns.
Šķiroto šūnu attēlveidošana reāllaikā. Pēc šķirošanas Neurobasal-A vidē, kas satur 1% B27 piedevu un 0,5 mM GlutaMax, šūnas nekavējoties tika iesētas uz ar poli-L-lizīnu pārklātiem stikla slaidiem (μ-Slide8 Well, Ibidi, kataloga numurs 80826) un pēc tam 1 stundu turētas 37°C temperatūrā un 5% CO2 atmosfērā, lai šūnas varētu nosēsties. Reāllaika attēlveidošana tika veikta ar Leica SP8 lāzera skenēšanas konfokālo mikroskopu, kas aprīkots ar baltu lāzeru, HyD, 63×[1,4 skaitliskās apertūras (NA)] eļļas objektīvu un sildīšanas paliktni.
Pele tika ātri anestēta ar oglekļa dioksīdu un dekapitēta, smadzenes tika ātri atdalītas no galvaskausa un sagrieztas 200 μm biezā (13C marķēšanas eksperimentam) vai 275 μm biezā (diviem fotonu eksperimentiem) sagitālā griezumā, kas piepildīts ar šādiem materiāliem. Saldējums (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Vācija) ir piepildīts ar šādām vielām: 125 mM ledusauksts, ar oglekli piesātināts (95% O2 un 5% CO2) mākslīgais cerebrospinālais šķidrums (ACSF) NaCl ar zemu Ca2 saturu, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 25 mM NaHCO3, 25 mM glikoze, 0,5 mM CaCl2 un 3,5 mM MgCl2 (osmotiskais spiediens no 310 līdz 330 mmol). Iegūtās smadzeņu šķēles pārvietojiet uz iepriekšinkubācijas kameru, kas satur augstāku Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 1,0 mM CaCl2 un 2,0 mM MgCl2) barotni, pH 7,4 un 310 līdz 320 mmol).
Attēlveidošanas procesa laikā šķēles tika pārvietotas uz speciālu attēlveidošanas telpu, un eksperiments tika veikts nepārtrauktas ACSF perfūzijas apstākļos nemainīgā temperatūrā no 32° līdz 33°C. Šķēļu attēlveidošanai tika izmantots daudzfotonu lāzera skenēšanas mikroskops (TCS SP8 MP-OPO, Leica Microsystems), kas aprīkots ar Leica 25x objektīvu (NA 0,95, ūdens) un titāna: safīra lāzeru (Chameleon Vision II, Coherent). FLIM modulis (PicoHarp300, PicoQuant).
Grx1-roGFP2 FLIM. Izmaiņas PN citoplazmatiskā redoksa stāvoklī tika mērītas ar divu fotonu FLIM sagitālās smadzeņu šķēlēs, kur Grx1-roGFP2 biosensors bija vērsts uz PN. PN slānī iegūšanas lauks tiek izvēlēts aptuveni 50 līdz 80 μm zem šķēles virsmas, lai nodrošinātu dzīvotspējīgu PN (tas ir, pērlīšu struktūras vai neironu morfoloģisko izmaiņu trūkumu gar dendritiem), un dubultpozitīvo roGFP2 sensoru un AAV, kas kodē shRNA PCx vai tās kontroles secību (katrs koekspresē mCherry). Savāciet vienas kaudzes attēlus ar 2x digitālo tālummaiņu [ierosmes viļņa garums: 890 nm; 512 nm 512 pikseļi]. Detekcija: iekšējais HyD, fluoresceīna izotiocianāta (FITC) filtra grupa] un attēlu vidējās vērtības aprēķināšana 2 līdz 3 minūšu laikā tiek izmantota, lai nodrošinātu, ka tiek savākts pietiekami daudz fotonu (kopā 1000 fotonu) līknes pielāgošanai. Grx1-roGFP2 zondes jutība un FLIM apstākļu pārbaude tika veikta, uzraugot roGFP2 dzīves ilguma vērtību, pievienojot eksogēnu 10 mM H2O2 perfūzijas ACSF (lai maksimāli palielinātu oksidāciju, kā rezultātā palielinās dzīves ilgums), un pēc tam pievienojot 2 mM ditiotreitolu (samazina redukcijas pakāpi, kā rezultātā samazinās dzīves ilgums) (S8. attēls, D līdz G). Izmantojiet FLIMfit 5.1.1 programmatūru, lai analizētu iegūtos rezultātus, pielāgojiet visa attēla vienīgo eksponenciālo sabrukšanas līkni izmērītajai IRF (instrumenta atbildes funkcijai), un χ2 ir aptuveni 1. Lai aprēķinātu viena PN dzīves ilgumu, maska ​​ap nerva ķermeni tika manuāli uzzīmēta, un kvantitatīvai noteikšanai tika izmantots vidējais dzīves ilgums katrā maskā.
Mitohondriju potenciāla analīze. Pēc tam, kad akūtā sekcija 30 minūtes tika inkubēta ar 100 nM TMRM, kas tieši pievienots perfūzētajam ACSF, PN mitohondriju potenciāla izmaiņas tika mērītas ar divu fotonu mikroskopu. TMRM attēlveidošana tika veikta, ierosinot zondi pie 920 nm un izmantojot iekšējo HyD (tetrametilrodamīna izotiocianātu: 585/40 nm), lai savāktu signālus; izmantojot to pašu ierosmes viļņa garumu, bet izmantojot citu iekšējo HyD (FITC: 525/50), lai attēlotu mtYFP. Izmantojiet ImageJ Image Calculator spraudni, lai novērtētu mitohondriju potenciālu atsevišķu šūnu līmenī. Īsāk sakot, spraudņa vienādojums: signāls = min (mtYFP, TMRM) tiek izmantots, lai identificētu mitohondriju reģionu, kas parāda TMRM signālu Purkinje somāļu valodā atbilstošā kanāla vienkaudzes konfokālajā attēlā. Pēc tam pikseļu laukums iegūtajā maskā tiek kvantificēts un pēc tam normalizēts atbilstošajā mtYFP kanāla sliekšņa vienkaudzes attēlā, lai iegūtu mitohondriju frakciju, kas parāda mitohondriju potenciālu.
Attēls tika dekonvolucionēts, izmantojot Huygens Pro (Scientific Volume Imaging) programmatūru. Skenētajiem flīžu attēliem atsevišķas flīzes montāža tiek veikta, izmantojot LAS-X programmatūras nodrošināto automātisko salikšanas algoritmu. Pēc attēla kalibrēšanas attēla tālākai apstrādei un spilgtuma un kontrasta vienmērīgai pielāgošanai izmantojiet ImageJ un Adobe Photoshop. Grafikas sagatavošanai izmantojiet Adobe Illustrator.
mtDNS fokusa analīze. mtDNS bojājumu skaits tika kvantitatīvi noteikts smadzenīšu griezumos, kas marķēti ar antivielām pret DNS, izmantojot konfokālo mikroskopu. Katrs mērķa apgabals tika izveidots katras šūnas ķermenim un kodolam, un attiecīgais laukums tika aprēķināts, izmantojot Multi Measure spraudni (ImageJ programmatūra). Lai iegūtu citoplazmas laukumu, no šūnas ķermeņa laukuma atņemiet kodola laukumu. Visbeidzot, spraudnis Analyze Particles (ImageJ programmatūra) tika izmantots, lai automātiski kvantitatīvi noteiktu citoplazmas DNS punktus, kas norāda mtDNS sliekšņa attēlā, un iegūtie rezultāti tika normalizēti attiecībā pret CTRL peļu PN vidējo vērtību. Rezultāti tiek izteikti kā vidējais nukleozīdu skaits vienā šūnā.
Olbaltumvielu ekspresijas analīze. Izmantojiet ImageJ Image Calculator spraudni, lai novērtētu olbaltumvielu ekspresiju PN atsevišķās šūnās. Īsāk sakot, atbilstošā kanāla viena slāņa konfokālajā attēlā, izmantojot vienādojumu: signāls = min (mtYFP, antiviela), tiek identificēts mitohondriju reģions, kas uzrāda imunoreaktivitāti pret noteiktu antivielu Purkina tehnikā. Pēc tam iegūtās maskas pikseļu laukums tiek kvantificēts un pēc tam normalizēts atbilstošajā mtYFP kanāla sliekšņa viena steka attēlā, lai iegūtu attēlotā proteīna mitohondriju frakciju.
Purkinje šūnu blīvuma analīze. Purkinje blīvuma novērtēšanai tika izmantots ImageJ spraudnis Cell Counter, dalot saskaitīto Purkinje šūnu skaitu ar smadzenīšu gredzena garumu, ko aizņem saskaitītās šūnas.
Paraugu sagatavošana un savākšana. Kontroles grupas un Mfn2cKO peļu smadzenes tika fiksētas 2% PFA/2,5% glutaraldehīda šķīdumā 0,1 M fosfātu buferšķīdumā (PB), un pēc tam, izmantojot ciliātus (Leica Mikrosysteme GmbH, Vīne, Austrija) (biezums 50 līdz 60 μm), tika sagatavoti koronālie griezumi. Pēc tam griezumi tika fiksēti PB buferšķīdumā 1% os tetraoksīdā un 1,5% kālija ferocianīdā istabas temperatūrā 1 stundu. Griezumus trīs reizes mazgāja ar destilētu ūdeni un pēc tam 20 minūtes iekrāsoja ar 70% etanolu, kas satur 1% uranilacetātu. Pēc tam griezumi tika dehidrēti gradētā spirtā un ievietoti Durcupan ACM (Araldite liešanas sveķi M) epoksīdsveķos (Electron Microscopy Sciences, kataloga numurs 14040) starp silikona pārklājumiem pārklātiem stikla slaidiem un visbeidzot polimerizēti krāsnī 60°C temperatūrā 48 stundas. Tika atlasīts smadzenīšu garozas apgabals, un ar Leica Ultracut (Leica Mikrosysteme GmbH, Vīne, Austrija) tika sagriezti 50 nm īpaši plāni griezumi, kas tika paņemti uz 2 × 1 mm vara spraugu režģa, kas pārklāts ar polistirola plēvi. Griezumus 10 minūtes iekrāsoja ar 4% uranilacetāta šķīdumu ūdenī, vairākas reizes mazgāja ar ūdeni, pēc tam 10 minūtes ar Reinoldsa svina citrātu ūdenī un pēc tam vairākas reizes mazgāja ar ūdeni. Mikrouzņēmumi tika uzņemti ar transmisijas elektronu mikroskopu Philips CM100 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ASV), izmantojot TVIPS (Tietz Video and Image Processing System) TemCam-F416 digitālo kameru (TVIPS GmbH, Gauting, ASV). Vācija.
Ar AAV inficētām pelēm smadzenes tika atdalītas un sagrieztas 1 mm biezā sagitālā griezumā, un smadzenītes tika pārbaudītas, izmantojot fluorescences mikroskopu, lai identificētu ar AAV inficēto gredzenu (tas ir, ar mCherry ekspresiju). Tiek izmantoti tikai tie eksperimenti, kuros AAV injekcija nodrošina ļoti augstu Purkinje šūnu slāņa (t.i., gandrīz visa slāņa) transdukcijas efektivitāti vismaz divos secīgos smadzenīšu gredzenos. Ar AAV transducētā cilpa tika mikrodisekēta, lai pēc fiksācijas veiktu nakti (4% PFA un 2,5% glutaraldehīda 0,1 M kokoāta buferšķīdumā) un tālāk apstrādātu. EPON iestrādāšanai fiksētie audi tika mazgāti ar 0,1 M nātrija kokoāta buferšķīdumu (Applichem) un inkubēti ar 2% OsO4 (os, Science Services; Caco) 0,1 M nātrija kokoāta buferšķīdumā (Applichem) 4 stundas, pēc tam mazgāti 2 stundas. Atkārtojiet 3 reizes ar 0,1 M kokamīda buferšķīdumu. Pēc tam, lai dehidrētu audus, katru etanola šķīdumu 15 minūtes inkubēja 4°C temperatūrā, izmantojot etanola augšupejošo sēriju. Audi tika pārvietoti uz propilēnoksīdu un inkubēti nakti EPON (Sigma-Aldrich) 4°C temperatūrā. Audus uz 2 stundām ievietoja svaigā EPON istabas temperatūrā un pēc tam 72 stundas iestrādāja 62°C temperatūrā. Izmantojot ultramikrotomu (Leica Microsystems, UC6) un dimanta nazi (Diatome, Biel, Šveice), izgrieza 70 nm īpaši plānas sekcijas un 15 minūtes 37°C temperatūrā iekrāsoja ar 1,5% uranilacetātu un 4 minūtes krāsoja ar svina citrāta šķīdumu. Elektronmikroskopijas tika uzņemtas, izmantojot JEM-2100 Plus transmisijas elektronmikroskopu (JEOL), kas aprīkots ar Camera OneView 4K 16 bitu (Gatan) un DigitalMicrograph programmatūru (Gatan). Analīzei elektronmikroskopijas tika iegūtas ar 5000× vai 10 000× digitālo tālummaiņu.
Mitohondriju morfoloģiskā analīze. Visām analīzēm atsevišķu mitohondriju kontūras tika manuāli iezīmētas digitālos attēlos, izmantojot ImageJ programmatūru. Tiek analizēti dažādi morfoloģiskie parametri. Mitohondriju blīvums tiek izteikts procentos, kas iegūts, dalot katras šūnas kopējo mitohondriju laukumu ar citoplazmas laukumu (citoplazmas laukums = šūnas laukums - šūnas kodola laukums) × 100. Mitohondriju apaļumu aprēķina pēc formulas [4π∙(laukums/perimetrs 2)]. Mitohondriju morfoloģija tika analizēta un sadalīta divās kategorijās (“cauruļveida” un “pūšļaina”) atbilstoši to galvenajām formām.
Autofagosomu/lizosomu skaita un blīvuma analīze. Izmantojiet ImageJ programmatūru, lai manuāli iezīmētu katras autofagosomas/lizosomas kontūras digitālajā attēlā. Autofagosomu/lizosomu laukums tiek izteikts procentos, kas aprēķināts, dalot katras šūnas kopējo autofagosomu/lizosomu struktūras laukumu ar citoplazmas laukumu (citoplazmas laukums = šūnas laukums - kodola laukums) × 100. Autofagosomu/lizosomu blīvums tiek aprēķināts, dalot kopējo skaitu ar autofagosomu/lizosomu struktūru skaitu uz vienu šūnu (citoplazmas laukuma izteiksmē) (citoplazmas laukums = šūnas laukums - kodola laukums).
Marķēšana akūtai griezumam un paraugu sagatavošanai. Eksperimentiem, kuros nepieciešama glikozes marķēšana, akūtās smadzeņu šķēles jāpārnes uz pirmsinkubācijas kameru, kas satur piesātinātu ogli (95% O2 un 5% CO2), augstu Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdumu, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikozi, 1,0 mM CaCl2 un 2,0 mM MgCl2, pH noregulēts uz 7,4 un 310 līdz 320 mOsm), kurā glikoze tiek aizvietota ar 13C6-glikozi (Eurisotop, kataloga numurs CLM-1396). Eksperimentiem, kuros nepieciešama piruvāta marķēšana, akūtās smadzeņu šķēles jāpārnes uz ACSF ar augstāku Ca2 + saturu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 1,0 mM CaCl2 un jāpievieno 2,0 mM MgCl2, jāpielāgo pH 7,4 un 310 līdz 320 mOsm), un jāpievieno 1 mM 1-[1-13C]piruvāts (Eurisotop, kataloga numurs CLM-1082). Griezumus inkubē 90 minūtes 37°C temperatūrā. Eksperimenta beigās griezumus ātri mazgā ar ūdens šķīdumu (pH 7,4), kas satur 75 mM amonija karbonātu, un pēc tam homogenizē 40:40:20 (v:v:v) acetonitrila (ACN):metanola:ūdens maisījumā. Pēc tam, kad griezumi bija inkubēti uz ledus 30 minūtes, paraugi tika centrifugēti ar 21 000 g 10 minūtes 4 °C temperatūrā, un dzidrais supernatants tika žāvēts SpeedVac koncentratorā. Iegūtās žāvētās metabolīta nogulsnes tika uzglabātas -80 °C temperatūrā līdz analīzei.
13C iezīmētu aminoskābju šķidruma hromatogrāfijas un masas spektrometrijas analīze. Šķidruma hromatogrāfijas un masas spektrometrijas (LC-MS) analīzei metabolītu nogulsnes tika atkārtoti suspendētas 75 μl LC-MS kvalitātes ūdenī (Honeywell). Pēc centrifugēšanas ar ātrumu 21 000 g 5 minūtes 4°C temperatūrā 20 μl dzidrinātā supernatanta tika izmantoti aminoskābju plūsmas analīzei, bet pārējais ekstrakts nekavējoties tika izmantots anjonu analīzei (skatīt zemāk). Aminoskābju analīze tika veikta, izmantojot iepriekš aprakstīto benzoilhlorīda derivatizācijas protokolu (55, 56). Pirmajā posmā 20 μl metabolīta ekstrakta pievienoja 10 μl 100 mM nātrija karbonāta (Sigma-Aldrich), un pēc tam LC kvalitātes ACN pievienoja 10 μl 2% benzoilhlorīda (Sigma-Aldrich). Paraugu īsi kratīja vorteksā un pēc tam centrifugēja ar ātrumu 21 000 g 5 minūtes 20°C temperatūrā. Pārnesiet attīrīto supernatantu uz 2 ml automātiskā parauga ņēmēja flakonu ar konisku stikla ieliktni (200 μl tilpums). Paraugi tika analizēti, izmantojot Acquity iClass īpaši augstas veiktspējas LC sistēmu (Waters), kas savienota ar Q-Exactive (QE)-HF (Ultra High Field Orbitrap) augstas izšķirtspējas precīzijas masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific). Analīzei 2 μl derivatizētā parauga tika ievadīti 100 × 1,0 mm augstas stiprības silīcija dioksīda T3 kolonnā (Waters), kas satur 1,8 μm daļiņas. Plūsmas ātrums ir 100 μl/min, un buferu sistēma sastāv no A bufera (10 mM amonija formiāts un 0,15% skudrskābe ūdenī) un B bufera (ACN). Gradients ir šāds: 0%B 0 minūtēs; 0%B. 0 līdz 15% B 0 līdz 0,1 minūtē; 15 līdz 17% B 0,1 līdz 0,5 minūtēs; B pie 17 līdz 55 % 0,5 līdz 14 minūtēs; B pie 55 līdz 70 % 14 līdz 14,5 minūtēs; pie 14,5 līdz 70 līdz 100 % B pēc 18 minūtēm; 100 % B pēc 18 līdz 19 minūtēm; 100 līdz 0 % B pēc 19 līdz 19,1 minūtēm; 0 % B pēc 19,1 līdz 28 minūtēm (55, 56). QE-HF masas spektrometrs darbojas pozitīvās jonizācijas režīmā ar masas diapazonu m/z (masas/lādiņa attiecība) no 50 līdz 750. Pielietotā izšķirtspēja ir 60 000, iegūtais pastiprinājuma kontroles (AGC) jonu mērķis ir 3×106, un maksimālais jonu laiks ir 100 milisekundes. Apsildāmā elektroizsmidzināšanas jonizācijas (ESI) avots darbojas ar 3,5 kV izsmidzināšanas spriegumu, 250 °C kapilārā temperatūru, 60 AU apvalka gaisa plūsmu (patvaļīgas vienības) un 20 AU palīggaisa plūsmu. 250 °C. S lēca ir iestatīta uz 60 AU.
Ar 13C iezīmētu organisko skābju anjonu hromatogrāfijas-MS analīze. Atlikušās metabolītu nogulsnes (55 μl) tika analizētas, izmantojot Dionex jonu hromatogrāfijas sistēmu (ICS 5000+, Thermo Fisher Scientific), kas savienota ar QE-HF masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific). Īsāk sakot, 5 μl metabolītu ekstrakta tika ievadīti Dionex IonPac AS11-HC kolonnā, kas aprīkota ar HPLC (2 mm × 250 mm, daļiņu izmērs 4 μm, Thermo Fisher Scientific) daļējas cilpas režīmā ar uzpildes attiecību 1. Dionex IonPac AG11-HC aizsargkolonna (2 mm x 50 mm, 4 μm, Thermo Fisher Scientific). Kolonnas temperatūra tiek uzturēta 30 °C, un automātiskais paraugu ņēmējs ir iestatīts uz 6 °C. Izmantojiet kālija hidroksīda kārtridžu, kas piegādāts ar dejonizētu ūdeni, lai ģenerētu kālija hidroksīda gradientu caur eluenta ģeneratoru. Metabolītu atdalīšana ar plūsmas ātrumu 380 μl/min, izmantojot šādu gradientu: 0 līdz 3 minūtes, 10 mM KOH; 3 līdz 12 minūtes, 10 līdz 50 mM KOH; 12 līdz 19 minūtes, 50 līdz 100 mM KOH; 19 līdz 21 minūte, 100 mM KOH; 21 līdz 21,5 minūtes, 100 līdz 10 mM KOH. Kolonna tika atkārtoti līdzsvarota 10 mM KOH atmosfērā 8,5 minūtes.
Eluētie metabolīti pēc kolonnas tiek apvienoti ar 150 μl/min izopropanola piedevas plūsmu un pēc tam novirzīti uz augstas izšķirtspējas masas spektrometru, kas darbojas negatīvās jonizācijas režīmā. MS uzrauga masas diapazonu no m/z 50 līdz 750 ar izšķirtspēju 60 000. AGC ir iestatīts uz 1×106, un maksimālais jonu laiks tiek uzturēts 100 ms. Apsildāmais ESI avots tika darbināts ar izsmidzināšanas spriegumu 3,5 kV. Pārējie jonu avota iestatījumi ir šādi: kapilāra temperatūra 275 °C; apvalka gāzes plūsma, 60 AU; palīggāzes plūsma, 20 AU pie 300 °C un S lēcas iestatījums uz 60 AU.
Ar 13C iezīmēto metabolītu datu analīze. Izotopu attiecības datu analīzei izmantojiet TraceFinder programmatūru (4.2. versija, Thermo Fisher Scientific). Katra savienojuma identitāte tika pārbaudīta ar uzticamu atsauces savienojumu un analizēta neatkarīgi. Lai veiktu izotopu bagātināšanas analīzi, katra 13C izotopa (Mn) ekstrahētās jonu hromatogrammas (XIC) laukums tika ekstrahēts no [M + H]+, kur n ir mērķa savienojuma oglekļa atomu skaits, ko izmanto aminoskābju analīzei, vai [MH]+, ko izmanto anjonu analīzei. XIC masas precizitāte ir mazāka par piecām miljonajām daļām, un RT precizitāte ir 0,05 minūtes. Bagātināšanas analīze tiek veikta, aprēķinot katra noteiktā izotopa attiecību pret visu atbilstošā savienojuma izotopu summu. Šīs attiecības ir norādītas kā procentuālās vērtības katram izotopam, un rezultāti tiek izteikti kā molārā bagātināšanas procenti (MPE), kā aprakstīts iepriekš (42).
Saldēto neironu nogulsnes homogenizēja ledusaukstā 80% metanolā (v/v), kratīja vorteksā un inkubēja -20°C temperatūrā 30 minūtes. Paraugu vēlreiz kratīja vorteksā un maisīja +4°C temperatūrā 30 minūtes. Paraugu centrifugēja ar 21 000 g 5 minūtes 4°C temperatūrā, un pēc tam iegūto supernatantu savāca un žāvēja, izmantojot SpeedVac koncentratoru 25°C temperatūrā turpmākai analīzei. Kā aprakstīts iepriekš, šķiroto šūnu aminoskābēm tika veikta LC-MS analīze. Izmantojot TraceFinder (4.2. versija, Thermo Fisher Scientific), datu analīze tika veikta, izmantojot katra savienojuma monoizotopisko masu. Metabolītu datu kvantitatīvā normalizācija tika veikta, izmantojot preprocessCore programmatūras pakotni (57).
Šķēļu sagatavošana. Pele tika ātri anestēta ar oglekļa dioksīdu un dekapitēta, smadzenes tika ātri atdalītas no galvaskausa, un ar ledu pildīts vibrācijas nazis (HM-650 V, Thermo Fisher Scientific, Walldorf, Vācija) tika sagriezts 300 līdz 375 μm sagitālos griezumos. Aukstā oglekļa gazifikācija (95% O2 un 5% CO2). Zems Ca2 + ACSF (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 1,0 mM CaCl2 un 6,0 mM MgCl2. Pielāgots pH 7,4 un 310 līdz 330 mOsm). Iegūtās smadzeņu šķēles pārvietojiet kamerā, kas satur ACSF ar augstāku Ca2 + saturu (125,0 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM nātrija fosfāta buferšķīdums, 25,0 mM NaHCO3, 25,0 mM d-glikoze, 4,0 mM CaCl2 un mM 3,5 MgCl2), pH 7,4 un 310 līdz 320 mOsm. Uzglabājiet šķēles 20 līdz 30 minūtes, lai tās varētu atjaunot pirms reģistrēšanas.
Ieraksts. Visiem ierakstiem tika izmantots mikroskopa paliktnis, kas aprīkots ar fiksētu reģistrācijas kameru un 20x ūdens imersijas objektīvu (Scientifica). Iespējamās Purkinje šūnas tika identificētas pēc (i) ķermeņa izmēra, (ii) smadzenīšu anatomiskās atrašanās vietas un (iii) fluorescējošā mtYFP reportiera gēna ekspresijas. Pipete ar uzgaļa pretestību no 5 līdz 11 megaomiem tiek izvilkta ar borsilikāta stikla kapilāru (GB150-10, 0,86 mm × 1,5 mm × 100 mm, Science Products, Hofheim, Vācija) un horizontālu pipeti Instruments (P-1000, Sutter), Novato, Kalifornija). Visi ieraksti tika veikti ar ELC-03XS npi plāksteru skavu pastiprinātāju (npi electronic GmbH, Tama, Vācija), ko kontrolēja programmatūra Signal (6.0 versija, Cambridge Electronic, Kembridža, Apvienotā Karaliste). Eksperiments tika reģistrēts ar 12,5 kHz paraugu ņemšanas frekvenci. Signāls tiek filtrēts ar diviem īscaurlaides Besela filtriem ar robežfrekvencēm attiecīgi 1,3 un 10 kHz. Membrānas un pipetes kapacitāti kompensē kompensācijas ķēde, izmantojot pastiprinātāju. Visi eksperimenti tika veikti Orca-Flash 4.0 kameras (Hamamatsu, Gerden, Vācija) vadībā, kuru vadīja Hokawo programmatūra (2.8. versija, Hamamatsu, Gerden, Vācija).
Rutīnas pilnšūnu konfigurācija un analīze. Tieši pirms reģistrēšanas pipeti piepildiet ar iekšējo šķīdumu, kas satur šādas vielas: 4,0 mM KCl, 2,0 mM NaCl, 0,2 mM EGTA, 135,0 mM kālija glikonāts, 10,0 mM Hepes, 4,0 mM ATP (Mg₂), 0,5 mM guanozīna trifosfāts (GTP) (Na₂) un 10,0 mM kreatinīna fosfāts, pH tika noregulēts līdz 7,25, un osmotiskais spiediens bija 290 mOsm (saharoze). Tūlīt pēc 0 pA spēka pielietošanas membrānas pārraušanai tika mērīts miera stāvokļa membrānas potenciāls. Ieejas pretestību mēra, pielietojot hiperpolarizētas strāvas -40, -30, -20 un -10 pA. Izmēriet sprieguma atbildes lielumu un, izmantojot Oma likumu, aprēķinājiet ieejas pretestību. Spontāna aktivitāte tika reģistrēta sprieguma skavas 5 minūtes, un sPSC tika identificēta un mērīta programmā Igor Pro (32. versija 7.01, WaveMetrics, Lake Oswego, Oregon, ASV), izmantojot pusautomātisko atpazīšanas skriptu. IV līkne un līdzsvara stāvokļa strāva tiek mērītas, nostiprinot akumulatoru dažādos potenciālos (sākot no -110 mV) un palielinot spriegumu ar 5 mV soli. AP veidošanās tika pārbaudīta, pielietojot depolarizējošu strāvu. Nostipriniet šūnu pie -70 mV, vienlaikus pielietojot depolarizējošu strāvas impulsu. Pielāgojiet katras ierakstīšanas vienības soļa lielumu atsevišķi (no 10 līdz 60 pA). Aprēķiniet maksimālo AP frekvenci, manuāli saskaitot impulsa impulsus, kas izraisa augstāko AP frekvenci. AP slieksnis tiek analizēts, izmantojot depolarizācijas impulsa otro atvasinājumu, kas pirmais iedarbina vienu vai vairākus AP.
Perforēta plākstera konfigurācija un analīze. Veiciet perforēta plākstera reģistrēšanu, izmantojot standarta protokolus. Izmantojiet ATP un GTP nesaturošu pipeti, kas nesatur šādas sastāvdaļas: 128 mM glikonāts K, 10 mM KCl, 10 mM Hepes, 0,1 mM EGTA un 2 mM MgCl2, un noregulējiet pH līdz 7,2 (izmantojot KOH). ATP un GTP tiek izlaisti no intracelulārā šķīduma, lai novērstu nekontrolētu šūnu membrānas caurlaidību. Plākstera pipete ir piepildīta ar amfotericīnu saturošu iekšējo šķīdumu (aptuveni 200 līdz 250 μg/ml; G4888, Sigma-Aldrich), lai iegūtu perforēta plākstera ierakstu. Amfotericīns tika izšķīdināts dimetilsulfoksīdā (galīgā koncentrācija: 0,1 līdz 0,3%; DMSO; D8418, Sigma-Aldrich). Izmantotajai DMSO koncentrācijai nebija būtiskas ietekmes uz pētītajiem neironiem. Perforācijas procesa laikā kanāla pretestība (Ra) tika nepārtraukti uzraudzīta, un eksperiments tika uzsākts pēc Ra un AP amplitūdas stabilizēšanās (20–40 minūtes). Spontāna aktivitāte tiek mērīta sprieguma un/vai strāvas skavas 2 līdz 5 minūtes. Datu analīze tika veikta, izmantojot Igor Pro (7.05.2. versija, WaveMetrics, ASV), Excel (2010. gada versija, Microsoft Corporation, Redmond, ASV) un GraphPad Prism (8.1.2. versija, GraphPad Software Inc., La Jolla, CA). Amerikas Savienotās Valstis). Lai identificētu spontānas aktivitātes (AP), tiek izmantots IgorPro NeuroMatic v3.0c spraudnis. AP tiek automātiski identificēti, izmantojot noteiktu slieksni, kas tiek pielāgots katram ierakstam individuāli. Izmantojot impulsa intervālu, nosakiet impulsa frekvenci ar maksimālo momentāno impulsa frekvenci un vidējo impulsa frekvenci.
PN izolācija. Pielāgojoties iepriekš publicētajam protokolam, PN tika attīrīti no peļu smadzenītēm noteiktā stadijā (58). Īsāk sakot, smadzenītes tika sadalītas un sasmalcinātas ledusaukstā disociācijas vidē [bez HBSS Ca2+ un Mg2+, papildinātas ar 20 mM glikozi, penicilīnu (50 V/ml) ​​un streptomicīnu (0,05 mg/ml)], un pēc tam barotne tika sagremota papaīnā [HBSS, papildināta ar 1-cisteīnu·HCl (1 mg/ml), papaīnu (16 V/ml) ​​un dezoksiribonukleāzi I (DNāze I; 0,1 mg/ml)]. Apstrādāt 30 minūtes 30°C temperatūrā. Vispirms audus istabas temperatūrā nomazgā HBSS vidē, kas satur olu gļotas (10 mg/ml), BSA (10 mg/ml) un DNāzi (0,1 mg/ml), lai novērstu fermentatīvu gremošanu, un pēc tam HBSS vidē, kas satur 20 mM glikozi, viegli samaļot HBSS, penicilīnu (50 V/ml), streptomicīnu (0,05 mg/ml) un DNāzi (0,1 mg/ml), atbrīvo atsevišķas šūnas. Iegūto šūnu suspensiju filtrē caur 70 μm šūnu filtru, pēc tam šūnas centrifugējot (1110 apgr./min, 5 minūtes, 4°C) nogulsnē un atkārtoti suspendē šķirošanas vidē [HBSS, papildināts ar 20 mM glikozi, 20% augļa liellopa serumu, penicilīnu (50 V/ml) ​​un streptomicīnu (0,05 mg/ml)]; novērtē šūnu dzīvotspēju ar propīdija jodīdu un pielāgo šūnu blīvumu no 1 × 106 līdz 2 × 106 šūnām/ml. Pirms plūsmas citometrijas suspensija tika filtrēta caur 50 μm šūnu filtru.
Plūsmas citometrs. Šūnu šķirošana tika veikta 4°C temperatūrā, izmantojot FACSAria III iekārtu (BD Biosciences) un FACSDiva programmatūru (BD Biosciences, 8.0.1. versija). Šūnu suspensija tika šķirota, izmantojot 100 μm sprauslu zem 20 psi spiediena ar ātrumu ~2800 notikumi/sekundē. Tā kā tradicionālie vārtēšanas kritēriji (šūnu lielums, bimodālā diskriminācija un izkliedes raksturlielumi) nevar nodrošināt pareizu PN izolāciju no citiem šūnu tipiem, vārtēšanas stratēģija tiek noteikta, pamatojoties uz YFP intensitātes un autofluorescences tiešu salīdzinājumu mitoYFP+ ​​​​un kontroles mitoYFP− pelēm. YFP tiek ierosināts, apstarojot paraugu ar 488 nm lāzera līniju, un signāls tiek uztverts, izmantojot 530/30 nm joslas caurlaides filtru. MitoYFP+ ​​​​pelēm Rosa26-mitoYFP reportiera gēna relatīvais stiprums tiek izmantots arī neironu ķermeņa un aksona fragmentu atšķiršanai. 7-AAD ierosina ar 561 nm dzelteno lāzeru un detektē ar 675/20 nm joslas caurlaidības filtru, lai izslēgtu atmirušās šūnas. Lai vienlaikus atdalītu astrocītus, šūnu suspensija tika iekrāsota ar ACSA-2-APC, pēc tam paraugs tika apstarots ar 640 nm lāzera līniju, un signāla detektēšanai tika izmantots 660/20 nm joslas caurlaidības filtrs.
Savāktās šūnas tika centrifugētas ar granulām (1110 apgr./min, 5 minūtes, 4°C) un uzglabātas -80°C temperatūrā līdz lietošanai. Mfn2cKO peles un to metiena mazuļi tiek klasificēti vienā dienā, lai samazinātu procedūras mainīgumu. FACS datu prezentācija un analīze tika veikta, izmantojot FlowJo programmatūru (FlowJo LLC, Ashland, Oregon, ASV).
Kā minēts iepriekš (59), reālā laika PCR tiek izmantota, lai izolētu DNS no šķirotajiem neironiem turpmākai mtDNS kvantitatīvai noteikšanai. Linearitāte un sliekšņa jutība sākotnēji tika pārbaudīta, izmantojot kvantitatīvo PĶR dažādam šūnu skaitam. Īsāk sakot, savāciet 300 PN līzes buferšķīdumā, kas sastāv no 50 mM tris-HCl (pH 8,5), 1 mM EDTA, 0,5% Tween 20 un proteināzes K (200 ng/ml), un inkubējiet 55°C temperatūrā 120 minūtes. Šūnas tālāk inkubēja 95°C temperatūrā 10 minūtes, lai nodrošinātu pilnīgu proteināzes K inaktivāciju. Izmantojot mt-Nd1 specifisku TaqMan zondi (Thermo Fisher), mtDNS tika mērīta ar puskvantitatīvu PCR 7900HT reālā laika PCR sistēmā (Thermo Fisher Scientific). Science, kataloga numurs Mm04225274_s1), mt-Nd6 (Thermo Fisher Scientific, kataloga numurs AIVI3E8) un 18S (Thermo Fisher Scientific, kataloga numurs Hs99999901_s1) gēni.
Proteomu parauga sagatavošana. Šķīdumu karsējot 95°C temperatūrā 10 minūtes un apstrādājot ar ultraskaņu, līzes buferšķīdumā [6 M guanidīna hlorīds, 10 mM tris(2-karboksietil)fosfīna hidrohlorīds, 10 mM hloracetamīds un 100 mM tris-Līzes sasaldētas neironu granulas HCl]. Uz Bioruptor (Diagenode) 10 minūtes (30 sekunžu impulss / 30 sekunžu pauzes periods). Paraugs tika atšķaidīts 1:10 ar 20 mM tris-HCl (pH 8,0), sajaukts ar 300 ng tripsīna zelta (Promega) un inkubēts nakti 37°C temperatūrā, lai panāktu pilnīgu gremošanu. Otrajā dienā paraugs tika centrifugēts ar 20 000 g 20 minūtes. Supernatantu atšķaidīja ar 0,1% skudrskābi, un šķīdumu atsāļoja ar paštaisītiem StageTips uzgaļiem. Paraugu žāvēja SpeedVac ierīcē (Eppendorf koncentrators plus 5305) 45°C temperatūrā, un pēc tam peptīdu suspendēja 0,1% skudrskābē. Visus paraugus vienlaikus sagatavoja viena un tā pati persona. Lai analizētu astrocītu paraugus, 4 μg atsāļotu peptīdu marķēja ar tandēma masas marķieri (TMT10plex, kataloga numurs 90110, Thermo Fisher Scientific) ar peptīda un TMT reaģenta attiecību 1:20. TMT marķēšanai 0,8 mg TMT reaģenta atkārtoti suspendēja 70 μl bezūdens ACN, un žāvēto peptīdu atšķaidīja 9 μl 0,1 M TEAB (trietilammonija bikarbonāta), kam pievienoja 7 μl TMT reaģenta ACN. Koncentrācija bija 43,75%. Pēc 60 minūšu inkubācijas reakcija tika apturēta ar 2 μl 5% hidroksilamīna. Iezīmētie peptīdi tika savākti, žāvēti, atkārtoti suspendēti 200 μl 0,1% skudrskābes (FA), sadalīti divās daļās un pēc tam atūdeņoti, izmantojot paštaisītus StageTip uzgaļus. Izmantojot UltiMate 3000 īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfu (UltiMate 3000 īpaši augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfs), viena no divām pusēm tika frakcionēta 1 mm x 150 mm Acquity hromatogrāfijas kolonnā, kas piepildīta ar 130Å1,7μm C18 daļiņām (Waters, kataloga Nr. SKU: 186006935). Thermo Fisher Scientific). Atdaliet peptīdus ar plūsmas ātrumu 30 μl/min, atdaliet no 1% līdz 50% buferšķīduma B 85 minūtes ar pakāpenisku 96 minūšu gradientu, no 50% līdz 95% buferšķīduma B 3 minūtes, pēc tam 8 minūtes 95% buferšķīdumam B; Buferšķīdums A ir 5 % ACN un 10 mM amonija bikarbonāts (ABC), un buferšķīdums B ir 80 % ACN un 10 mM ABC. Frakcijas savāc ik pēc 3 minūtēm un apvieno tās divās grupās (1 + 17, 2 + 18 utt.) un žāvē vakuuma centrifūgā.
LC-MS/MS analīze. Masas spektrometrijai peptīdi (numurs r119.aq) tika atdalīti 25 cm, 75 μm iekšējā diametra PicoFrit analītiskajā kolonnā (jauna objektīva lēca, detaļas numurs PF7508250), kas aprīkota ar 1,9 μm ReproSil-Pur 120 C18-AQ barotni (Dr. Maisch, mat), izmantojiet EASY-nLC 1200 (Thermo Fisher Scientific, Vācija). Kolonna tika uzturēta 50°C temperatūrā. Buferi A un B ir attiecīgi 0,1% skudrskābe ūdenī un 0,1% skudrskābe 80% ACN. Peptīdi tika atdalīti no 6% līdz 31% bufera B 65 minūtes un no 31% līdz 50% bufera B 5 minūtes ar gradientu 200 nl/min. Eluētie peptīdi tika analizēti ar Orbitrap Fusion masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific). Peptīdu prekursora m/z mērījums tiek veikts ar 120 000 izšķirtspēju diapazonā no 350 līdz 1500 m/z. Izmantojot 27% normalizētu sadursmes enerģiju, augstas enerģijas C slazda disociācijas (HCD) šķelšanai tiek izvēlēts spēcīgākais prekursors ar lādiņa stāvokli no 2 līdz 6. Cikla laiks ir iestatīts uz 1 s. Peptīdu fragmenta m/z vērtība tika mērīta jonu slazdā, izmantojot mazāko AGC mērķi 5×104 un maksimālo injekcijas laiku 86 ms. Pēc fragmentācijas prekursors tika ievietots dinamiskajā izslēgšanas sarakstā uz 45 s. Ar TMT iezīmētie peptīdi tika atdalīti 50 cm, 75 μm Acclaim PepMap kolonnā (Thermo Fisher Scientific, kataloga numurs 164942), un migrācijas spektri tika analizēti ar Orbitrap Lumos Tribrid masas spektrometru (Thermo Fisher Scientific), kas aprīkots ar augsta lauka asimetriskas viļņu formas jonu (FAIMS) iekārtu (Thermo Fisher Scientific) un darbojas ar diviem kompensācijas spriegumiem - −50 un −70 V. MS3, kas izvēlēts, pamatojoties uz sinhronizācijas prekursoru, tiek izmantots TMT ziņojuma jonu signāla mērīšanai. Peptīdu atdalīšana tika veikta ar EASY-nLC 1200, izmantojot 90% lineāra gradienta eluēšanu ar bufera koncentrāciju no 6% līdz 31%; buferšķīdums A bija 0,1% FA un buferšķīdums B bija 0,1% FA un 80% ACN. Analītiskā kolonna darbojas 50°C temperatūrā. Izmantojiet FreeStyle (1.6. versija, Thermo Fisher Scientific), lai sadalītu sākotnējo failu atbilstoši FAIMS kompensācijas spriegumam.
Olbaltumvielu identifikācija un kvantitatīvā noteikšana. Izmantojot integrēto Andromeda meklētājprogrammu, sākotnējie dati tika analizēti, izmantojot MaxQuant 1.5.2.8 versiju (https://maxquant.org/). Papildus Cre rekombināzes un YFP sekvencēm, kas iegūtas no Aequorea victoria, peptīdu fragmentu spektros tika meklēta peles atsauces proteoma kanoniskā secība un izoforma secība (proteoma ID UP000000589, lejupielādēts no UniProt 2017. gada maijā). Metionīna oksidēšana un olbaltumvielu N-termināla acetilēšana tika iestatītas kā mainīgas modifikācijas; cisteīna karbamoilmetilēšana tika iestatīta kā fiksētas modifikācijas. Sagremošanas parametri ir iestatīti uz “specifiskums” un “tripsīns/P”. Minimālais peptīdu un asmeņu peptīdu skaits, kas izmantots olbaltumvielu identifikācijai, ir 1; minimālais unikālo peptīdu skaits ir 0. Peptīdu kartes saskaņošanas apstākļos olbaltumvielu identifikācijas ātrums bija 0,01. Ir iespējota opcija “Otrais peptīds”. Izmantojiet opciju “saskaņot starp palaišanas reizēm”, lai pārsūtītu veiksmīgas identifikācijas starp dažādiem oriģinālajiem failiem. Izmantojiet LFQ minimālās attiecības skaitli 1 kvantitatīvai noteikšanai bez etiķetes (LFQ) (60). LFQ intensitāte tiek filtrēta vismaz divām derīgām vērtībām vismaz vienā genotipa grupā katrā laika punktā un tiek ekstrapolēta no normālā sadalījuma ar platumu 0,3 un pārvietota uz leju par 1,8. Izmantojiet Perseus skaitļošanas platformu (https://maxquant.net/perseus/) un R (https://r-project.org/), lai analizētu LFQ rezultātus. Diferenciālās ekspresijas analīzei tika izmantots divvirzienu mērens t tests no limma programmatūras pakotnes (61). Izpētes datu analīze tiek veikta, izmantojot ggplot, FactoMineR, factoextra, GGally un pheatmap. Uz TMT balstītie proteomikas dati tika analizēti, izmantojot MaxQuant 1.6.10.43 versiju. Meklējiet neapstrādātus proteomikas datus UniProt cilvēka proteomikas datubāzē, kas tika lejupielādēta 2018. gada septembrī. Analīzē ir iekļauts ražotāja sniegtais izotopu tīrības korekcijas koeficients. Diferenciālās izteiksmes analīzei izmantojiet limma valodā R. Sākotnējie dati, datubāzes meklēšanas rezultāti, kā arī datu analīzes darbplūsma un rezultāti tiek glabāti ProteomeXchange aliansē, izmantojot PRIDE partnera repozitoriju ar datu kopas identifikatoru PXD019690.
Funkcionālās anotācijas bagātina analīzi. Lai noteiktu datu kopas funkcionālo anotāciju terminu bagātību 8 nedēļu laikā, tika izmantots Ingenuity Pathway Analysis (QIAGEN) rīks (1. attēls). Īsāk sakot, kvantitatīvais olbaltumvielu saraksts, kas iegūts no LC-MS/MS (tandēma masas spektrometrijas) datu analīzes, tiek izmantots ar šādiem filtrēšanas kritērijiem: kā suga un fons ir izvēlēta Mus musculus, un kategorija parāda P vērtību, kas koriģēta ar Benjamini bagātinājumam, ja 0,05 vai zemāka tiek uzskatīta par nozīmīgu. Šajā grafikā ir parādītas piecas galvenās pārpalikuma kategorijas katrā klasterī, pamatojoties uz koriģēto P vērtību. Izmantojot vairāku t-testu, izmantojot Benjamini, Krieger un Yekutieli divpakāpju lineārās pastiprināšanas programmu (Q = 5%), laika gaitā olbaltumvielu ekspresijas analīze tiek veikta katrā kategorijā identificētajiem svarīgajiem kandidātiem, un katra rinda tiek analizēta atsevišķi. Nav nepieciešams pieņemt konsekventu standartnovirzi.
Lai salīdzinātu šī pētījuma rezultātus ar publicētajām datubāzēm un ģenerētu 1. attēlā redzamo Venna diagrammu, mēs apvienojām kvantitatīvo olbaltumvielu sarakstu ar MitoCarta 2.0 anotācijām (24). Diagrammas ģenerēšanai izmantojiet tiešsaistes rīku Draw Venn Diagram (http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/).
Detalizētu informāciju par proteomikas analīzē izmantotajām statistiskajām procedūrām skatiet atbilstošajā sadaļā “Materiāli un metodes”. Visu pārējo eksperimentu detalizētu informāciju var atrast attiecīgajā aprakstā. Ja vien nav norādīts citādi, visi dati ir izteikti kā vidējais ± SEM, un visas statistiskās analīzes tika veiktas, izmantojot programmatūru GraphPad Prism 8.1.2.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/6/35/eaba8271/DC1.
Šis ir brīvas piekļuves raksts, kas izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution-NonCommercial licences noteikumiem, kas atļauj tā izmantošanu, izplatīšanu un reproducēšanu jebkurā vidē, ja vien galīgais pielietojums nav paredzēts komerciālam ieguvumam un ja vien oriģināldarbs ir pareizs. Atsauce.
Piezīme. Lūdzam norādīt savu e-pasta adresi tikai tāpēc, lai persona, kuru iesakāt lapai, zinātu, ka vēlaties, lai tā redzētu e-pastu un ka tas nav surogātpasts. Mēs neiegūsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Autori: E. Motori, I. Atanasovs, SMV Kočans, K. Folcs-Donahue, V. Saktivelu, P. Džavalisko, N. Toni, Dž. Puiāls, N.-G. Larsons
Disfunkcionālu neironu proteomikas analīze atklāja, ka vielmaiņas programmas tiek aktivizētas, lai neitralizētu neirodeģenerāciju.
Autori: E. Motori, I. Atanasovs, SMV Kočans, K. Folcs-Donahue, V. Saktivelu, P. Džavalisko, N. Toni, Dž. Puiāls, N.-G. Larsons
Disfunkcionālu neironu proteomikas analīze atklāja, ka vielmaiņas programmas tiek aktivizētas, lai neitralizētu neirodeģenerāciju.
©2020 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija. visas tiesības paturētas. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.