Raksts ir daļa no pētījuma tēmas “Uzlabotas bioremediācijas tehnoloģijas un sintētisko organisko savienojumu (SOC) pārstrādes procesi”. Skatīt visus 14 rakstus.
Zemas molekulmasas policikliskie aromātiskie ogļūdeņraži (PAO), piemēram, naftalīns un aizvietotie naftalīni (metilnaftalīns, naftoīnskābe, 1-naftil-N-metilkarbamāts utt.), tiek plaši izmantoti dažādās nozarēs un ir genotoksiski, mutagēni un/vai kancerogēni organismiem. Šie sintētiskie organiskie savienojumi (SOC) jeb ksenobiotiskās vielas tiek uzskatītas par prioritāriem piesārņotājiem un rada nopietnus draudus globālajai videi un sabiedrības veselībai. Cilvēku darbības intensitāte (piemēram, ogļu gazifikācija, naftas pārstrāde, transportlīdzekļu emisijas un lauksaimniecības pielietojumi) nosaka šo visuresošo un noturīgo savienojumu koncentrāciju, likteni un transportu. Papildus fizikālām un ķīmiskām apstrādes/noņemšanas metodēm kā droša, rentabla un daudzsološa alternatīva ir parādījušās zaļas un videi draudzīgas tehnoloģijas, piemēram, bioremediācija, kurās tiek izmantoti mikroorganismi, kas spēj pilnībā noārdīt POC vai pārvērst tos netoksiskos blakusproduktos. Dažādas baktēriju sugas, kas pieder pie proteobaktēriju (Pseudomonas, Pseudomonas, Comamonas, Burkholderia un Neosphingobacterium), firmikutu (Bacillus un Paenibacillus) un aktinobaktēriju (Rhodococcus un Arthrobacter) filām augsnes mikrobiotā, ir pierādījušas spēju noārdīt dažādus organiskos savienojumus. Metabolisma pētījumi, genomika un metagenomikas analīze palīdz mums izprast katabolisko sarežģītību un daudzveidību, kas piemīt šīm vienkāršajām dzīvības formām, ko var tālāk izmantot efektīvai biodegradācijai. PAO ilgtermiņa pastāvēšana ir novedusi pie jaunu noārdīšanās fenotipu rašanās, izmantojot horizontālu gēnu pārnesi, piemēram, plazmīdas, transpozonus, bakteriofāgus, genoma salas un integratīvos konjugatīvos elementus. Sistēmu bioloģija un specifisku izolātu vai modeļu kopienu (konsorciju) ģenētiskā inženierija var nodrošināt visaptverošu, ātru un efektīvu šo PAO bioremediāciju, izmantojot sinerģisku efektu. Šajā pārskatā mēs koncentrējamies uz naftalīna un aizvietoto naftalīnu noārdošo baktēriju dažādajiem metabolisma ceļiem un daudzveidību, ģenētisko sastāvu un daudzveidību, kā arī šūnu reakcijām/adaptācijām. Tas sniegs ekoloģisku informāciju lauka pielietojumam un celmu optimizācijai efektīvai bioremediācijai.
Straujā nozaru attīstība (naftas ķīmija, lauksaimniecība, farmācija, tekstilizstrādājumu krāsas, kosmētika utt.) ir veicinājusi globālo ekonomisko labklājību un dzīves līmeņa uzlabošanos. Šī eksponenciālā attīstība ir novedusi pie liela skaita sintētisko organisko savienojumu (SOC) ražošanas, ko izmanto dažādu produktu ražošanā. Šie svešie savienojumi jeb SOC ietver policikliskos aromātiskos ogļūdeņražus (PAO), pesticīdus, herbicīdus, plastifikatorus, krāsvielas, farmaceitiskos līdzekļus, organofosfātus, liesmas slāpētājus, gaistošos organiskos šķīdinātājus utt. Tie nonāk atmosfērā, ūdens un sauszemes ekosistēmās, kur tiem ir daudzdimensionāla ietekme, radot kaitīgu ietekmi uz dažādām bioformām, mainot fizikāli ķīmiskās īpašības un kopienas struktūru (Petrie et al., 2015; Bernhardt et al., 2017; Sarkar et al., 2020). Daudziem aromātiskajiem piesārņotājiem ir spēcīga un destruktīva ietekme uz daudzām neskartām ekosistēmām/bioloģiskās daudzveidības karstajiem punktiem (piemēram, koraļļu rifiem, Arktikas/Antarktikas ledus segumiem, augstkalnu ezeriem, dziļjūras nogulumiem utt.) (Jones 2010; Beyer et al. 2020; Nordborg et al. 2020). Jaunākie ģeomikrobioloģiskie pētījumi liecina, ka sintētisku organisko vielu (piemēram, aromātisko piesārņotāju) un to atvasinājumu nogulsnēšanās uz mākslīgu konstrukciju (apbūvētas vides) virsmām (piemēram, kultūras mantojuma vietām un pieminekļiem, kas izgatavoti no granīta, akmens, koka un metāla) paātrina to degradāciju (Gadd 2017; Liu et al. 2018). Cilvēka darbība var pastiprināt un pasliktināt pieminekļu un ēku bioloģisko degradāciju, izraisot gaisa piesārņojumu un klimata pārmaiņas (Liu et al. 2020). Šie organiskie piesārņotāji reaģē ar atmosfērā esošajiem ūdens tvaikiem un nosēžas uz konstrukcijas, izraisot materiāla fizikālu un ķīmisku degradāciju. Biodegradācija ir plaši atzīta par nevēlamām izmaiņām materiālu izskatā un īpašībās, ko izraisa dzīvi organismi un kas ietekmē to saglabāšanu (Pochon un Jaton, 1967). Šo savienojumu turpmāka mikrobiālā darbība (metabolisms) var samazināt strukturālo integritāti, saglabāšanas efektivitāti un kultūras vērtību (Gadd, 2017; Liu et al., 2018). No otras puses, dažos gadījumos ir konstatēts, ka mikrobu adaptācija un reakcija uz šīm struktūrām ir labvēlīga, jo tās veido bioplēves un citas aizsargājošas garozas, kas samazina sabrukšanas/sadalīšanās ātrumu (Martino, 2016). Tāpēc efektīvu ilgtermiņa ilgtspējīgu akmens, metāla un koka pieminekļu saglabāšanas stratēģiju izstrāde prasa rūpīgu izpratni par galvenajiem procesiem, kas iesaistīti šajā procesā. Salīdzinot ar dabiskajiem procesiem (ģeoloģiskiem procesiem, meža ugunsgrēkiem, vulkānu izvirdumiem, augu un baktēriju reakcijām), cilvēka darbības rezultātā ekosistēmās nonāk liels daudzums policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (PAO) un cita organiskā oglekļa (OC). Daudzi PAO, ko izmanto lauksaimniecībā (insekticīdi un pesticīdi, piemēram, DDT, atrazīns, karbarils, pentahlorfenols utt.), rūpniecībā (jēlnafta, naftas dūņas/atkritumi, no naftas iegūta plastmasa, PCB, plastifikatori, mazgāšanas līdzekļi, dezinfekcijas līdzekļi, fumiganti, smaržvielas un konservanti), personīgās higiēnas līdzekļi (saules aizsargkrēmi, dezinfekcijas līdzekļi, kukaiņu atbaidīšanas līdzekļi un policikliskie muskusa savienojumi) un munīcija (sprāgstvielas, piemēram, 2,4,6-TNT), ir potenciāli ksenobiotiski līdzekļi, kas var ietekmēt planētas veselību (Srogi, 2007; Vamsee-Krishna un Phale, 2008; Petrie et al., 2015). Šo sarakstu var paplašināt, iekļaujot no naftas iegūtus savienojumus (degvieleļļas, smērvielas, asfaltēnus), augstas molekulmasas bioplastmasu un jonu šķidrumus (Amde et al., 2015). 1. tabulā ir uzskaitīti dažādi aromātiskie piesārņotāji un to pielietojums dažādās nozarēs. Pēdējos gados ir sākušas pieaugt antropogēnās gaistošo organisko savienojumu, kā arī oglekļa dioksīda un citu siltumnīcefekta gāzu emisijas (Dvorak et al., 2017). Tomēr antropogēnā ietekme ievērojami pārsniedz dabisko ietekmi. Turklāt mēs atklājām, ka vairākas organiskās organiskās vielas (SOC) saglabājas daudzās vides vidēs un ir identificētas kā jauni piesārņotāji ar nelabvēlīgu ietekmi uz biomām (1. attēls). Vides aģentūras, piemēram, Amerikas Savienoto Valstu Vides aizsardzības aģentūra (USEPA), ir iekļāvušas daudzus no šiem piesārņotājiem savā prioritāšu sarakstā to citotoksisko, genotoksisko, mutagēno un kancerogēno īpašību dēļ. Tāpēc ir nepieciešami stingri atkritumu apglabāšanas noteikumi un efektīvas stratēģijas atkritumu apstrādei/izvešanai no piesārņotām ekosistēmām. Dažādas fizikālās un ķīmiskās apstrādes metodes, piemēram, pirolīze, oksidatīvā termiskā apstrāde, gaisa aerācija, apglabāšana poligonos, sadedzināšana utt., ir neefektīvas un dārgas, un rada kodīgus, toksiskus un grūti apstrādājamus blakusproduktus. Pieaugot globālajai vides izpratnei, arvien lielāku uzmanību piesaista mikroorganismi, kas spēj noārdīt šos piesārņotājus un to atvasinājumus (piemēram, halogenētos, nitro, alkil un/vai metil) (Fennell et al., 2004; Haritash un Kaushik, 2009; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020; Schwanemann et al., 2020). Šo vietējo kandidātu mikroorganismu izmantošana atsevišķi vai jauktās kultūrās (kolonijās) aromātisko piesārņotāju atdalīšanai sniedz priekšrocības vides drošības, izmaksu, efektivitātes, lietderības un ilgtspējības ziņā. Pētnieki arī pēta mikrobu procesu integrāciju ar elektroķīmiskām redoksa metodēm, proti, bioelektroķīmiskām sistēmām (BES), kā daudzsološu tehnoloģiju piesārņotāju apstrādei/atdalīšanai (Huang et al., 2011). BES tehnoloģija ir piesaistījusi arvien lielāku uzmanību, pateicoties tās augstajai efektivitātei, zemajām izmaksām, vides drošībai, darbībai istabas temperatūrā, bioloģiski saderīgiem materiāliem un spējai atgūt vērtīgus blakusproduktus (piemēram, elektrību, degvielu un ķīmiskās vielas) (Pant et al., 2012; Nazari et al., 2020). Augstas caurlaidības genoma sekvencēšanas un omikas rīku/metožu parādīšanās ir sniegusi daudz jaunas informācijas par dažādu noārdītāju mikroorganismu reakciju ģenētisko regulāciju, proteomiku un fluksomiku. Šo rīku apvienošana ar sistēmu bioloģiju ir vēl vairāk uzlabojusi mūsu izpratni par mērķa katabolisko ceļu izvēli un precizēšanu mikroorganismos (t. i., vielmaiņas dizainu), lai panāktu efektīvu un lietderīgu biodegradāciju. Lai izstrādātu efektīvas bioremediācijas stratēģijas, izmantojot piemērotus kandidātu mikroorganismus, mums ir jāsaprot mikroorganismu bioķīmiskais potenciāls, vielmaiņas daudzveidība, ģenētiskais sastāvs un ekoloģija (autoekoloģija/sinekoloģija).
1. att. Zemmolekulāro PAO avoti un ceļi dažādās vides vidēs un dažādi faktori, kas ietekmē biotu. Pārtrauktās līnijas attēlo mijiedarbību starp ekosistēmas elementiem.
Šajā pārskatā mēs esam mēģinājuši apkopot datus par vienkāršu PAO, piemēram, naftalīna un aizvietotu naftalīnu, noārdīšanos, ko veic dažādi baktēriju izolāti, aptverot vielmaiņas ceļus un daudzveidību, noārdīšanā iesaistītos enzīmus, gēnu sastāvu/saturu un daudzveidību, šūnu atbildes reakcijas un dažādus bioremediācijas aspektus. Izpratne par bioķīmisko un molekulāro līmeni palīdzēs identificēt piemērotus saimniekorganismu celmus un to tālāku ģenētisko inženieriju šādu prioritāro piesārņotāju efektīvai bioremediācijai. Tas palīdzēs izstrādāt stratēģijas vietnei specifisku baktēriju konsorciju izveidei efektīvai bioremediācijai.
Liela skaita toksisku un bīstamu aromātisku savienojumu klātbūtne (kas atbilst Huckel noteikumam 4n + 2π elektroni, n = 1, 2, 3, …) rada nopietnus draudus dažādiem vides elementiem, piemēram, gaisam, augsnei, nogulumiem, kā arī virszemes un gruntsūdeņiem (Puglisi et al., 2007). Šiem savienojumiem ir viens benzola gredzens (monociklisks) vai vairāki benzola gredzeni (policiklisks), kas izvietoti lineārā, leņķiskā vai klasteru formā, un tiem piemīt stabilitāte (stabilitāte/nestabilitāte) vidē, pateicoties augstai negatīvajai rezonanses enerģijai un inercei (inercei), ko var izskaidrot ar to hidrofobitāti un reducēto stāvokli. Kad aromātisko gredzenu tālāk aizstāj ar metilgrupām (-CH3), karboksilgrupām (-COOH), hidroksilgrupām (-OH) vai sulfonātu grupām (-HSO3), tas kļūst stabilāks, tam ir spēcīgāka afinitāte pret makromolekulām un tas ir bioakumulatīvs bioloģiskajās sistēmās (Seo et al., 2009; Phale et al., 2020). Daži mazas molekulmasas policikliskie aromātiskie ogļūdeņraži (ZMVAH), piemēram, naftalīns un tā atvasinājumi [metilnaftalīns, naftoskābe, naftalīnsulfonāts un 1-naftil-N-metilkarbamāts (karbarils)], ASV Vides aizsardzības aģentūras prioritāro organisko piesārņotāju sarakstā ir iekļāvuši tos kā genotoksiskus, mutagēnus un/vai kancerogēnus (Cerniglia, 1984). Šīs NM-PAH klases izdalīšanās vidē var izraisīt šo savienojumu bioakumulāciju visos barības ķēdes līmeņos, tādējādi ietekmējot ekosistēmu veselību (Binkova et al., 2000; Srogi, 2007; Quinn et al., 2009).
PAO avoti un ceļi biotā galvenokārt ir migrācijas un mijiedarbības ceļā starp dažādiem ekosistēmas komponentiem, piemēram, augsni, gruntsūdeņiem, virszemes ūdeņiem, kultūraugiem un atmosfēru (Arey un Atkinson, 2003). 1. attēlā parādīta dažādu zemas molekulmasas PAO mijiedarbība un izplatība ekosistēmās un to ceļi uz biotu/cilvēku iedarbību. PAO nogulsnējas uz virsmām gaisa piesārņojuma rezultātā un transportlīdzekļu emisiju, rūpniecisko izplūdes gāzu (ogļu gazifikācijas, sadedzināšanas un koksa ražošanas) migrācijas (dreifa) un to nogulsnēšanās rezultātā. Rūpnieciskās darbības, piemēram, sintētisko tekstilizstrādājumu, krāsvielu un krāsu ražošana; koksnes konservēšana; gumijas apstrāde; cementa ražošanas darbības; pesticīdu ražošana; un lauksaimnieciskā izmantošana, ir galvenie PAO avoti sauszemes un ūdens sistēmās (Bamforth un Singleton, 2005; Wick et al., 2011). Pētījumi liecina, ka augsne piepilsētu un pilsētu teritorijās, automaģistrāļu tuvumā un lielās pilsētās ir jutīgāka pret policikliskajiem aromātiskajiem ogļūdeņražiem (PAO) elektrostaciju emisiju, dzīvojamo māju apkures, gaisa un ceļu satiksmes slodzes un būvniecības darbību dēļ (Suman et al., 2016). (2008) pētījumā tika konstatēts, ka PAO līmenis augsnē ceļu tuvumā Ņūorleānā, Luiziānas štatā, ASV, sasniedza pat 7189 μg/kg, savukārt atklātā vietā tas bija tikai 2404 μg/kg. Līdzīgi vairākās ASV pilsētās ogļu gazifikācijas vietu tuvumā ir ziņots par PAO līmeni pat 300 μg/kg (Kanaly un Harayama, 2000; Bamforth un Singleton, 2005). Ir ziņots, ka augsnēs no dažādām Indijas pilsētām, piemēram, Deli (Sharma et al., 2008), Agra (Dubey et al., 2014), Mumbajas (Kulkarni un Venkataraman, 2000) un Visakhapatnamas (Kulkarni et al., 2014), ir augsta PAO koncentrācija. Aromātiskie savienojumi vieglāk adsorbējas uz augsnes daļiņām, organiskajām vielām un māla minerāliem, tādējādi kļūstot par galvenajiem oglekļa piesaistītājiem ekosistēmās (Srogi, 2007; Peng et al., 2008). Galvenie PAO avoti ūdens ekosistēmās ir nokrišņi (mitrie/sausie nokrišņi un ūdens tvaiki), pilsētu notece, notekūdeņu izplūdes, gruntsūdeņu papildināšanās utt. (Srogi, 2007). Tiek lēsts, ka aptuveni 80% PAO jūras ekosistēmās rodas no nokrišņiem, sedimentācijas un atkritumu izplūdes (Motelay-Massei et al., 2006; Srogi, 2007). Augstāka PAO koncentrācija virszemes ūdeņos vai cieto atkritumu apglabāšanas vietu filtrātos galu galā noplūst gruntsūdeņos, radot nopietnus draudus sabiedrības veselībai, jo vairāk nekā 70% Dienvidāzijas un Dienvidaustrumāzijas iedzīvotāju dzer gruntsūdeņus (Duttagupta et al., 2019). Nesenā Duttagupta et al. (2020) pētījumā par upju (32) un gruntsūdeņu (235) analīzēm Rietumbengālē, Indijā, tika konstatēts, ka aptuveni 53% pilsētu iedzīvotāju un 44% lauku iedzīvotāju (kopā 20 miljoni iedzīvotāju) var būt pakļauti naftalīnam (4,9–10,6 μg/l) un tā atvasinājumiem. Atšķirīgie zemes izmantošanas modeļi un palielināta gruntsūdeņu ieguve tiek uzskatīti par galvenajiem faktoriem, kas kontrolē zemas molekulmasas PAO vertikālo transportu (advekciju) zemes dzīlēs. Ir konstatēts, ka PAO upju baseinos un zemes dzīļu nogulumos ietekmē lauksaimniecības noteci, pašvaldību un rūpniecisko notekūdeņu izplūdes un cieto atkritumu/atkritumu izplūdes. Atmosfēras nokrišņi vēl vairāk saasina PAO piesārņojumu. Augstas PAO un to alkilatvasinājumu koncentrācijas (kopā 51) ir konstatētas upēs/ūdensšķirtnēs visā pasaulē, piemēram, Freizeras upē, Luanas upē, Denso upē, Misūri upē, Anacostijas upē, Ebro upē un Delavēras upē (Yunker et al., 2002; Motelay-Massei et al., 2006; Li et al., 2010; Amoako et al., 2011; Kim et al., 2018). Gangas upes baseina nogulumos visnozīmīgākie tika konstatēti naftalīns un fenantrēns (konstatēti 70% paraugu) (Duttagupta et al., 2019). Turklāt pētījumi liecina, ka dzeramā ūdens hlorēšana var izraisīt toksiskāku skābekli saturošu un hlorētu PAO veidošanos (Manoli un Samara, 1999). PAO uzkrājas graudaugos, augļos un dārzeņos, augiem tos uzņemot no piesārņotas augsnes, gruntsūdeņiem un nokrišņiem (Fismes et al., 2002). Daudzi ūdens organismi, piemēram, zivis, mīdijas, gliemenes un garneles, ir piesārņoti ar PAO, patērējot piesārņotu pārtiku un jūras ūdeni, kā arī caur audiem un ādu (Mackay un Fraser, 2000). Gatavošanas/apstrādes metodes, piemēram, grilēšana, cepšana cepeškrāsnī, kūpināšana, cepšana eļļā, žāvēšana, cepšana cepeškrāsnī un gatavošana uz oglēm, arī var izraisīt ievērojamu PAO daudzumu pārtikā. Tas lielā mērā ir atkarīgs no kūpināšanas materiāla izvēles, fenolu/aromātisko ogļūdeņražu satura, gatavošanas procedūras, sildītāja veida, mitruma satura, skābekļa piegādes un degšanas temperatūras (Guillén et al., 2000; Gomes et al., 2013). Policikliskie aromātiskie ogļūdeņraži (PAO) ir konstatēti arī pienā dažādās koncentrācijās (0,75–2,1 mg/l) (Girelli et al., 2014). Šo PAO uzkrāšanās pārtikā ir atkarīga arī no pārtikas fizikāli ķīmiskajām īpašībām, savukārt to toksiskā iedarbība ir saistīta ar fizioloģiskajām funkcijām, vielmaiņas aktivitāti, absorbciju, izplatīšanos un izplatīšanos organismā (Mechini et al., 2011).
Policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (PAO) toksicitāte un kaitīgā ietekme ir zināma jau ilgu laiku (Cherniglia, 1984). Zemas molekulmasas policikliskie aromātiskie ogļūdeņraži (ZMV-PAO) (divi līdz trīs gredzeni) var kovalenti saistīties ar dažādām makromolekulām, piemēram, DNS, RNS un olbaltumvielām, un ir kancerogēni (Santarelli et al., 2008). To hidrofobās dabas dēļ tos atdala lipīdu membrānas. Cilvēkiem citohroma P450 monooksigenāzes oksidē PAO par epoksīdiem, no kuriem daži ir ļoti reaģējoši (piemēram, baediola epoksīds) un var izraisīt normālu šūnu pārveidošanos par ļaundabīgām (Marston et al., 2001). Turklāt PAO transformācijas produkti, piemēram, hinoni, fenoli, epoksīdi, dioli utt., ir toksiskāki nekā pamatsavienojumi. Daži PAO un to metabolisma starpprodukti var ietekmēt hormonus un dažādus metabolisma enzīmus, tādējādi negatīvi ietekmējot augšanu, centrālo nervu sistēmu, reproduktīvo un imūnsistēmu (Swetha un Phale, 2005; Vamsee-Krishna et al., 2006; Oostingh et al., 2008). Ir ziņots, ka īslaicīga zemas molekulmasas PAO iedarbība izraisa plaušu darbības traucējumus un trombozi astmas slimniekiem, kā arī palielina ādas, plaušu, urīnpūšļa un kuņģa-zarnu trakta vēža risku (Olsson et al., 2010; Diggs et al., 2011). Pētījumi ar dzīvniekiem ir arī parādījuši, ka PAO iedarbība var nelabvēlīgi ietekmēt reproduktīvo funkciju un attīstību un var izraisīt kataraktu, nieru un aknu bojājumus, kā arī dzelti. Ir pierādīts, ka dažādi PAO biotransformācijas produkti, piemēram, dioli, epoksīdi, hinoni un brīvie radikāļi (katjoni), veido DNS aduktus. Ir pierādīts, ka stabili adukti maina DNS replikācijas mehānismu, savukārt nestabili adukti var depurināt DNS (galvenokārt līdz adenīnam un dažreiz līdz guanīnam); abi var radīt kļūdas, kas noved pie mutācijām (Schweigert et al. 2001). Turklāt hinoni (benzo-/pan-) var radīt reaktīvās skābekļa sugas (ROS), izraisot letālus DNS un citu makromolekulu bojājumus, tādējādi ietekmējot audu funkciju/dzīvotspēju (Ewa un Danuta 2017). Ir ziņots, ka hroniska pakļaušana zemām pirēna, bifenila un naftalīna koncentrācijām izraisa vēzi eksperimentāliem dzīvniekiem (Diggs et al. 2012). To letālās toksicitātes dēļ prioritāte ir šo PAO attīrīšana/izņemšana no skartajām/piesārņotajām vietām.
PAO atdalīšanai no piesārņotām vietām/vides ir izmantotas dažādas fizikālas un ķīmiskas metodes. Tādiem procesiem kā sadedzināšana, dehlorēšana, UV oksidēšana, fiksācija un šķīdinātāju ekstrakcija ir daudz trūkumu, tostarp toksisku blakusproduktu veidošanās, procesa sarežģītība, drošības un regulējuma jautājumi, zema efektivitāte un augstas izmaksas. Tomēr mikrobiālā biodegradācija (saukta par bioremediāciju) ir daudzsološa alternatīva pieeja, kas ietver mikroorganismu izmantošanu tīrkultūru vai koloniju veidā. Salīdzinot ar fizikālām un ķīmiskām metodēm, šis process ir videi draudzīgs, neinvazīvs, rentabls un ilgtspējīgs. Bioremediāciju var veikt skartajā vietā (in situ) vai speciāli sagatavotā vietā (ex situ), un tāpēc tā tiek uzskatīta par ilgtspējīgāku sanācijas metodi nekā tradicionālās fizikālās un ķīmiskās metodes (Juhasz un Naidu, 2000; Andreoni un Gianfreda, 2007; Megharaj et al., 2011; Phale et al., 2020; Sarkar et al., 2020).
Izpratnei par mikrobu metabolisma posmiem, kas saistīti ar aromātisko piesārņotāju noārdīšanos, ir milzīga zinātniska un ekonomiska ietekme uz ekoloģisko un vides ilgtspējību. Tiek lēsts, ka visā pasaulē nogulumos un organiskajos savienojumos (t. i., naftā, dabasgāzē un oglēs, t. i., fosilajā kurināmajā) ir uzkrāti aptuveni 2,1 × 1018 grami oglekļa (C), kas sniedz ievērojamu ieguldījumu globālajā oglekļa ciklā. Tomēr straujā industrializācija, fosilā kurināmā ieguve un cilvēku darbība noplicina šīs litosfēras oglekļa krātuves, katru gadu atmosfērā izdalot aptuveni 5,5 × 1015 g organiskā oglekļa (kā piesārņotāju) (Gonzalez-Gaya et al., 2019). Lielākā daļa šī organiskā oglekļa nonāk sauszemes un jūras ekosistēmās caur sedimentāciju, transportu un noteci. Turklāt jauni sintētiski piesārņotāji, kas iegūti no fosilā kurināmā, piemēram, plastmasa, plastifikatori un plastmasas stabilizatori (ftalāti un to izomēri), nopietni piesārņo jūras, augsnes un ūdens ekosistēmas un to biotu, tādējādi saasinot globālos klimata riskus. Klusajā okeānā starp Ziemeļameriku un Dienvidaustrumāziju ir uzkrājušies dažādi mikroplastmasas, nanoplastmasas, plastmasas fragmenti un to toksiskie monomēru produkti, kas iegūti no polietilēntereftalāta (PET), veidojot “Lielo Klusā okeāna atkritumu pleķi” un kaitējot jūras dzīvībai (Newell et al., 2020). Zinātniskie pētījumi ir pierādījuši, ka šādus piesārņotājus/atkritumus nav iespējams noņemt ar fizikālām vai ķīmiskām metodēm. Šajā kontekstā visnoderīgākie mikroorganismi ir tie, kas spēj oksidatīvi metabolizēt piesārņotājus oglekļa dioksīdā, ķīmiskajā enerģijā un citos netoksiskos blakusproduktos, kas galu galā nonāk citos barības vielu aprites procesos (H, O, N, S, P, Fe utt.). Tādējādi aromātisko piesārņotāju mineralizācijas mikrobiālās ekofizioloģijas un tās vides kontroles izpratne ir ļoti svarīga, lai novērtētu mikrobu oglekļa ciklu, neto oglekļa budžetu un nākotnes klimata riskus. Ņemot vērā steidzamo nepieciešamību noņemt šādus savienojumus no vides, ir parādījušās dažādas ekoindustrijas, kas koncentrējas uz tīrām tehnoloģijām. Alternatīvi, ekosistēmās uzkrāto rūpniecisko atkritumu/atkritumu ķīmisko vielu valorizācija (t. i., pieeja “no atkritumiem līdz bagātībai”) tiek uzskatīta par vienu no aprites ekonomikas un ilgtspējīgas attīstības mērķu pīlāriem (Close et al., 2012). Tāpēc šo potenciālo degradācijas kandidātu vielmaiņas, fermentatīvo un ģenētisko aspektu izpratne ir ārkārtīgi svarīga, lai efektīvi atdalītu un bioremediētu šādus aromātiskos piesārņotājus.
Starp daudzajiem aromātiskajiem piesārņotājiem mēs īpašu uzmanību pievēršam zemas molekulmasas PAO, piemēram, naftalīnam un aizvietotiem naftalīniem. Šie savienojumi ir galvenās no naftas iegūtas degvielas, tekstilizstrādājumu krāsvielu, patēriņa preču, pesticīdu (nadeņu bumbiņu un kukaiņu atbaidīšanas līdzekļu), plastifikatoru un tanīnu sastāvdaļas, un tāpēc tie ir plaši izplatīti daudzās ekosistēmās (Preuss et al., 2003). Jaunākie ziņojumi izceļ naftalīna koncentrāciju uzkrāšanos ūdens nesējslāņa nogulumos, gruntsūdeņos un pazemes augsnēs, vadozes zonās un upju gultnēs, kas liecina par tā bioakumulāciju vidē (Duttagupta et al., 2019, 2020). 2. tabulā ir apkopotas naftalīna un tā atvasinājumu fizikāli ķīmiskās īpašības, pielietojums un ietekme uz veselību. Salīdzinot ar citiem augstas molekulmasas PAO, naftalīns un tā atvasinājumi ir mazāk hidrofobi, vairāk šķīst ūdenī un plaši izplatīti ekosistēmās, tāpēc tos bieži izmanto kā modeļu substrātus, lai pētītu PAO metabolismu, ģenētiku un metabolisma daudzveidību. Liels skaits mikroorganismu spēj metabolizēt naftalīnu un tā atvasinājumus, un ir pieejama visaptveroša informācija par to metabolisma ceļiem, enzīmiem un regulējošajām funkcijām (Mallick et al., 2011; Phale et al., 2019, 2020). Turklāt naftalīns un tā atvasinājumi ir atzīti par prototipa savienojumiem vides piesārņojuma novērtēšanai to augstā daudzuma un biopieejamības dēļ. ASV Vides aizsardzības aģentūra lēš, ka vidējais naftalīna līmenis ir 5,19 μg uz kubikmetru no cigarešu dūmiem, galvenokārt no nepilnīgas sadegšanas, un no 7,8 līdz 46 μg no blakusplūsmas dūmiem, savukārt kreozota un naftalīna iedarbība ir 100 līdz 10 000 reižu lielāka (Preuss et al. 2003). Jo īpaši naftalīnam ir konstatēta sugai, reģionam un dzimumam specifiska elpceļu toksicitāte un kancerogenitāte. Pamatojoties uz pētījumiem ar dzīvniekiem, Starptautiskā vēža izpētes aģentūra (IARC) ir klasificējusi naftalīnu kā "iespējamu cilvēka kancerogēnu" (2B grupa)1. Aizvietotu naftalīnu iedarbība, galvenokārt ieelpojot vai parenterāli (iekšķīgi) ievadot, izraisa plaušu audu bojājumus un palielina plaušu audzēju sastopamību žurkām un pelēm (Nacionālā toksikoloģijas programma 2). Akūtas blakusparādības ir slikta dūša, vemšana, sāpes vēderā, caureja, galvassāpes, apjukums, spēcīga svīšana, drudzis, tahikardija utt. No otras puses, ir ziņots, ka plaša spektra karbamāta insekticīds karbarils (1-naftil-N-metilkarbamāts) ir toksisks ūdens bezmugurkaulniekiem, abiniekiem, medus bitēm un cilvēkiem, un ir pierādīts, ka tas inhibē acetilholīnesterāzi, izraisot paralīzi (Smulders et al., 2003; Bulen and Distel, 2011). Tāpēc mikrobiālās degradācijas, ģenētiskās regulācijas, fermentatīvo un šūnu reakciju mehānismu izpratne ir ļoti svarīga, lai izstrādātu bioremediācijas stratēģijas piesārņotā vidē.
2. tabula. Detalizēta informācija par naftalīna un tā atvasinājumu fizikāli ķīmiskajām īpašībām, lietojumiem, identifikācijas metodēm un ar tiem saistītajām slimībām.
Piesārņotās nišās hidrofobie un lipofīlie aromātiskie piesārņotāji var izraisīt dažādas šūnu ietekmes uz vides mikrobiomu (kopienu), piemēram, izmaiņas membrānas plūstamībā, membrānas caurlaidībā, lipīdu dubultslāņa pietūkumu, enerģijas pārneses traucējumus (elektronu transporta ķēde/protonu kustības spēks) un ar membrānu saistīto olbaltumvielu aktivitāti (Sikkema et al., 1995). Turklāt daži šķīstoši starpprodukti, piemēram, kateholi un hinoni, ģenerē reaktīvās skābekļa sugas (ROS) un veido aduktus ar DNS un olbaltumvielām (Penning et al., 1999). Tādējādi šādu savienojumu pārpilnība ekosistēmās rada selektīvu spiedienu uz mikrobu kopienām, lai tās kļūtu par efektīviem noārdītājiem dažādos fizioloģiskos līmeņos, tostarp uzņemšanā/transportā, intracelulārā transformācijā, asimilācijā/izmantošanā un nodalīšanā.
Ribosomu datubāzes projekta II (RDP-II) meklēšana atklāja, ka no barotnēm vai bagātināšanas kultūrām, kas piesārņotas ar naftalīnu vai tā atvasinājumiem, tika izdalītas kopumā 926 baktēriju sugas. Proteobaktēriju grupai bija vislielākais pārstāvju skaits (n = 755), kam sekoja Firmicutes (52), Bacteroidetes (43), Actinobacteria (39), Tenericutes (10) un neklasificētas baktērijas (8) (2. attēls). γ-proteobaktēriju (Pseudomonadales un Xanthomonadales) pārstāvji dominēja visās gramnegatīvajās grupās ar augstu G+C saturu (54%), savukārt Clostridiales un Bacillales (30%) bija grampozitīvās grupas ar zemu G+C saturu. Ir ziņots, ka Pseudomonas (vislielākais skaits — 338 sugas) spēj noārdīt naftalīnu un tā metilatvasinājumus dažādās piesārņotās ekosistēmās (akmeņogļu darva, nafta, jēlnafta, dūņas, naftas noplūdes, notekūdeņi, organiskie atkritumi un atkritumu poligoni), kā arī neskartās ekosistēmās (augsnē, upēs, nogulumos un gruntsūdeņos) (2. attēls). Turklāt dažu šo reģionu bagātināšanas pētījumi un metagenomikas analīze atklāja, ka nekultivētām Legionella un Clostridium sugām var būt noārdīšanās spēja, kas norāda uz nepieciešamību kultivēt šīs baktērijas, lai pētītu jaunus metaboliskos ceļus un metabolisma daudzveidību.
2. att. Baktēriju pārstāvju taksonomiskā daudzveidība un ekoloģiskā izplatība vidē, kas piesārņota ar naftalīnu un naftalīna atvasinājumiem.
Starp dažādajiem aromātiskos ogļūdeņražus noārdošajiem mikroorganismiem lielākā daļa spēj noārdīt naftalīnu kā vienīgo oglekļa un enerģijas avotu. Naftalīna metabolisma notikumu secība ir aprakstīta Pseudomonas sp. (celmi: NCIB 9816-4, G7, AK-5, PMD-1 un CSV86), Pseudomonas stutzeri AN10, Pseudomonas fluorescens PC20 un citi celmi (ND6 un AS1) (Mahajan et al., 1994; Resnick et al., 1996; Annweiler et al., 2000; Basu et al., 2003; Dennis un Zylstra, 2004; Sota et al., 2006; Metabolismu ierosina daudzkomponentu dioksigenāze [naftalīna dioksigenāze (NDO), gredzenu hidroksilējoša dioksigenāze], kas katalizē viena no naftalīna aromātiskajiem gredzeniem oksidēšanos, izmantojot molekulāro skābekli kā otru substrātu, pārvēršot naftalīnu par cis-naftalēndiolu (3. attēls). Cis-dihidrodiolu dehidrogenāze pārvērš par 1,2-dihidroksinaftalīnu. A Gredzenu šķeļošā dioksigenāze, 1,2-dihidroksinaftalīna dioksigenāze (12DHNDO), pārvērš 1,2-dihidroksinaftalīnu par 2-hidroksihromēn-2-karbonskābi. Enzimātiskā cis-trans izomerizācija rada trans-o-hidroksibenzilidenpiruvātu, ko hidratāzes aldolāze sašķeļ salicilaldehīdā un piruvātā. Organiskās skābes piruvāts bija pirmais C3 savienojums, kas iegūts no naftalīna oglekļa skeleta un novirzīts uz centrālo oglekļa ceļu. Turklāt NAD+ atkarīgā salicilaldehīda dehidrogenāze pārvērš salicilaldehīdu par salicilskābi. Metabolismu šajā posmā sauc par naftalīna noārdīšanās "augšējo ceļu". Šis ceļš ir ļoti izplatīts lielākajā daļā naftalīnu noārdošo baktēriju. Tomēr ir daži izņēmumi; piemēram, termofilajā Bacillus hamburgii 2 naftalīna noārdīšanos ierosina naftalīna 2,3-dioksigenāze, veidojot 2,3-dihidroksinaftalīnu (Annweiler et al., 2000).
3. attēls. Naftalīna, metilnaftalīna, naftoīnskābes un karbarila degradācijas ceļi. Apvilktie skaitļi apzīmē enzīmus, kas ir atbildīgi par naftalīna un tā atvasinājumu secīgu pārvēršanu turpmākajos produktos. 1 — naftalīna dioksigenāze (NDO); 2, cis-dihidrodiola dehidrogenāze; 3, 1,2-dihidroksinaftalīna dioksigenāze; 4, 2-hidroksihromēn-2-karbonskābes izomerāze; 5, trans-O-hidroksibenzilidenpiruvāta hidratāzes aldolāze; 6, salicilaldehīda dehidrogenāze; 7, salicilāta 1-hidroksilāze; 8, katehola 2,3-dioksigenāze (C23DO); 9, 2-hidroksimukonāta semialdehīda dehidrogenāze; 10, 2-oksopent-4-enoāta hidratāze; 11, 4-hidroksi-2-oksopentanoāta aldolāze; 12, acetaldehīda dehidrogenāze; 13, katehol-1,2-dioksigenāze (C12DO); 14, mukonāta cikloizomerāze; 15, mukonolaktona delta-izomerāze; 16, β-ketoadipatenollaktona hidrolāze; 17, β-ketoadipāta sukcinil-CoA transferāze; 18, β-ketoadipāta-CoA tiolāze; 19, sukcinil-CoA: acetil-CoA sukciniltransferāze; 20, salicilāta 5-hidroksilāze; 21 – gentisāta 1,2-dioksigenāze (GDO); 22, maleilpiruvāta izomerāze; 23, fumarilpiruvāta hidrolāze; 24, metilnaftalīna hidroksilāze (NDO); 25, hidroksimetilnaftalīna dehidrogenāze; 26, naftaldehīda dehidrogenāze; 27, 3-formilsalicilskābes oksidāze; 28, hidroksiizoftalāta dekarboksilāze; 29, karbarilhidrolāze (CH); 30, 1-naftol-2-hidroksilāze.
Atkarībā no organisma un tā ģenētiskā uzbūves iegūtā salicilskābe tiek tālāk metabolizēta vai nu pa katehola ceļu, izmantojot salicilāta 1-hidroksilāzi (S1H), vai pa gentisāta ceļu, izmantojot salicilāta 5-hidroksilāzi (S5H) (3. attēls). Tā kā salicilskābe ir galvenais naftalīna metabolisma starpprodukts (augšējais ceļš), posmus no salicilskābes līdz TCA starpproduktam bieži sauc par apakšējo ceļu, un gēni ir organizēti vienā operonā. Bieži ir redzams, ka augšējā ceļa operona (nah) un apakšējā ceļa operona (sal) gēnus regulē kopīgi regulējoši faktori; piemēram, NahR un salicilskābe darbojas kā induktori, ļaujot abiem operoniem pilnībā metabolizēt naftalīnu (Phale et al., 2019, 2020).
Turklāt katehols tiek cikliski šķelts par 2-hidroksimukonāta semialdehīdu pa meta ceļu ar katehola 2,3-dioksigenāzi (C23DO) (Yen et al., 1988) un tālāk hidrolizēts ar 2-hidroksimukonāta semialdehīda hidrolāzi, veidojot 2-hidroksipent-2,4-dienskābi. Pēc tam 2-hidroksipent-2,4-dienoāts tiek pārveidots par piruvātu un acetaldehīdu ar hidratāzes (2-oksopent-4-enoāta hidratāzes) un aldolāzes (4-hidroksi-2-oksopentanoāta aldolāzes) palīdzību un pēc tam nonāk centrālajā oglekļa ceļā (3. attēls). Alternatīvi, katehols tiek cikliski šķelts par cis,cis-mukonātu pa orto ceļu ar katehola 1,2-oksigenāzes (C12DO) palīdzību. Mukonāta cikloizomerāze, mukonolaktona izomerāze un β-ketoadipāta-nollaktona hidrolāze pārvērš cis,cis-mukonātu par 3-oksoadipātu, kas nonāk centrālajā oglekļa ceļā caur sukcinil-CoA un acetil-CoA (Nozaki et al., 1968) (3. attēls).
Gentisāta (2,5-dihidroksibenzoāta) metabolisma ceļā aromātisko gredzenu sašķeļ gentisāta 1,2-dioksigenāze (GDO), veidojot maleilpiruvātu. Šo produktu var tieši hidrolizēt par piruvātu un malātu vai arī izomerizēt, veidojot fumarilpiruvātu, ko pēc tam var hidrolizēt par piruvātu un fumarātu (Larkin un Day, 1986). Alternatīvā metabolisma ceļa izvēle ir novērota gan gramnegatīvām, gan grampozitīvām baktērijām bioķīmiskā un ģenētiskā līmenī (Morawski et al., 1997; Whyte et al., 1997). Gramnegatīvās baktērijas (Pseudomonas) dod priekšroku salicilskābes lietošanai, kas ir naftalīna metabolisma induktors, dekarboksilējot to par kateholu, izmantojot salicilāta 1-hidroksilāzi (Gibson un Subramanian, 1984). No otras puses, grampozitīvās baktērijās (Rhodococcus) salicilāta 5-hidroksilāze pārvērš salicilskābi par gentisīnskābi, turpretī salicilskābei nav induktīvas ietekmes uz naftalīna gēnu transkripciju (Grund et al., 1992) (3. attēls).
Ir ziņots, ka tādas sugas kā Pseudomonas CSV86, Oceanobacterium NCE312, Marinhomonas naphthotrophicus, Sphingomonas paucimobilis 2322, Vibrio cyclotrophus, Pseudomonas fluorescens LP6a, Pseudomonas un Mycobacterium sugas var noārdīt monometilnaftalīnu vai dimetilnaftalīnu (Dean-Raymond un Bartha, 1975; Cane un Williams, 1982; Mahajan et al., 1994; Dutta et al., 1998; Hedlund et al., 1999). Starp tām Pseudomonas sp. CSV86 1-metilnaftalīna un 2-metilnaftalīna noārdīšanās ceļš ir skaidri pētīts bioķīmiskā un fermentatīvā līmenī (Mahajan et al., 1994). 1-metilnaftalīns tiek metabolizēts pa diviem ceļiem. Vispirms aromātiskais gredzens (metilnaftalīna neaizvietotais gredzens) tiek hidroksilēts, veidojot cis-1,2-dihidroksi-1,2-dihidro-8-metilnaftalīnu, kas tālāk tiek oksidēts par metilsalicilātu un metilkateholu, un pēc gredzena šķelšanas nonāk centrālajā oglekļa ceļā (3. attēls). Šo ceļu sauc par "oglekļa avota ceļu". Otrajā "detoksikācijas ceļā" metilgrupu var hidroksilēt ar NDO, veidojot 1-hidroksimetilnaftalīnu, kas tālāk tiek oksidēts par 1-naftalīnu un izdalīts barotnē kā strupceļa produkts. Pētījumi liecina, ka CSV86 celms nespēj augt ar 1- un 2-naftalīnu kā vienīgo oglekļa un enerģijas avotu, apstiprinot tā detoksikācijas ceļu (Mahajan et al., 1994; Basu et al., 2003). 2-metilnaftalīnā metilgrupa tiek hidroksilēta ar hidroksilāzi, veidojot 2-hidroksimetilnaftalīnu. Turklāt naftalīna gredzena neaizvietotais gredzens tiek pakļauts gredzena hidroksilēšanai, veidojot dihidrodiolu, kas virknē enzīmu katalizētu reakciju tiek oksidēts par 4-hidroksimetilkateholu un caur meta-gredzena šķelšanās ceļu nonāk centrālajā oglekļa ceļā. Līdzīgi ziņots, ka S. paucimobilis 2322 izmanto NDO, lai hidroksilētu 2-metilnaftalīnu, kas tālāk tiek oksidēts, veidojot metilsalicilātu un metilkateholu (Dutta et al., 1998).
Naftoīnskābes (aizvietotas/neaizvietotas) ir detoksikācijas/biotransformācijas blakusprodukti, kas veidojas metilnaftalīna, fenantrēna un antracēna noārdīšanās laikā un izdalās izlietotajā barotnē. Ir ziņots, ka augsnes izolāts Stenotrophomonas maltophilia CSV89 spēj metabolizēt 1-naftoīnskābi kā oglekļa avotu (Phale et al., 1995). Metabolisms sākas ar aromātiskā gredzena dihidroksilēšanu, veidojot 1,2-dihidroksi-8-karboksinaftalīnu. Iegūtais diols tiek oksidēts par kateholu caur 2-hidroksi-3-karboksibenzilidenpiruvātu, 3-formilsalicilskābi, 2-hidroksiizoftalskābi un salicilskābi un nonāk centrālajā oglekļa ceļā caur meta-gredzena šķelšanās ceļu (3. attēls).
Karbarils ir naftilkarbamāta pesticīds. Kopš Zaļās revolūcijas Indijā 20. gs. septiņdesmitajos gados ķīmisko mēslošanas līdzekļu un pesticīdu lietošana ir izraisījusi policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (PAO) emisiju palielināšanos no lauksaimniecības izkliedētiem avotiem (Pingali, 2012; Duttagupta et al., 2020). Tiek lēsts, ka 55 % (85 722 000 hektāru) no kopējās aramzemes Indijā tiek apstrādāta ar ķīmiskiem pesticīdiem. Pēdējo piecu gadu laikā (2015.–2020. gadā) Indijas lauksaimniecības nozare katru gadu ir izmantojusi vidēji 55 000 līdz 60 000 tonnu pesticīdu (Kooperatīvu un lauksaimnieku labklājības departaments, Lauksaimniecības ministrija, Indijas valdība, 2020. gada augusts). Gangas līdzenumu ziemeļu un centrālajā daļā (štatos ar vislielāko iedzīvotāju skaitu un iedzīvotāju blīvumu) pesticīdu lietošana kultūraugiem ir plaši izplatīta, un pārsvarā tiek lietoti insekticīdi. Karbarils (1-naftil-N-metilkarbamāts) ir plaša spektra, vidēji līdz ļoti toksisks karbamāta insekticīds, ko izmanto Indijas lauksaimniecībā vidēji 100–110 tonnu apmērā. To parasti pārdod ar tirdzniecības nosaukumu Sevin un izmanto, lai kontrolētu kukaiņus (laputis, ugunsskudras, blusas, ērces, zirnekļus un daudzus citus āra kaitēkļus), kas ietekmē dažādas kultūras (kukurūzu, sojas pupas, kokvilnu, augļus un dārzeņus). Dažus mikroorganismus, piemēram, Pseudomonas (NCIB 12042, 12043, C4, C5, C6, C7, Pseudomonas putida XWY-1), Rhodococcus (NCIB 12038), Sphingobacterium spp. (CF06), Burkholderia (C3), Micrococcus un Arthrobacter, var izmantot arī citu kaitēkļu apkarošanai. Ir ziņots, ka RC100 var noārdīt karbarilu (Larkin un Day, 1986; Chapalamadugu un Chaudhry, 1991; Hayatsu et al., 1999; Swetha un Phale, 2005; Trivedi et al., 2017). Karbarila noārdīšanās ceļš ir plaši pētīts bioķīmiskā, fermentatīvā un ģenētiskā līmenī Pseudomonas sp. celmu C4, C5 un C6 augsnes izolātos (Swetha un Phale, 2005; Trivedi et al., 2016) (3. att.). Metabolisma ceļš sākas ar estera saites hidrolīzi ar karbarilhidrolāzi (CH), veidojot 1-naftolu, metilamīnu un oglekļa dioksīdu. Pēc tam 1-naftolu hidroksilāze (1-NH2) pārvērš par 1,2-dihidroksinaftalīnu, kas tālāk tiek metabolizēts pa centrālo oglekļa ceļu caur salicilātu un gentisātu. Ir ziņots, ka dažas karbarilu noārdošās baktērijas to metabolizē par salicilskābi, šķeļot katehola orto gredzenu (Larkin un Day, 1986; Chapalamadugu un Chaudhry, 1991). Jāatzīmē, ka naftalīnu noārdošās baktērijas galvenokārt metabolizē salicilskābi, izmantojot kateholu, savukārt karbarilu noārdošās baktērijas dod priekšroku salicilskābes metabolizēšanai, izmantojot gentisāta ceļu.
Naftalīnsulfonskābes/disulfonskābes un naftilamīnsulfonskābes atvasinājumus var izmantot kā starpproduktus azokrāsvielu, mitrinošu vielu, disperģētāju u. c. ražošanā. Lai gan šiem savienojumiem ir zema toksicitāte cilvēkiem, citotoksicitātes novērtējumi liecina, ka tie ir letāli zivīm, dafnijām un aļģēm (Greim et al., 1994). Ir ziņots, ka Pseudomonas ģints pārstāvji (celmi A3, C22) uzsāk metabolismu, dubulti hidroksilējot aromātisko gredzenu, kas satur sulfonskābes grupu, veidojot dihidrodiolu, kas tālāk tiek pārveidots par 1,2-dihidroksinaftalīnu, spontāni sadaloties sulfīta grupai (Brilon et al., 1981). Iegūtais 1,2-dihidroksinaftalīns tiek katabolizēts pa klasisko naftalīna ceļu, t. i., katehola vai gentisāta ceļu (4. attēls). Ir pierādīts, ka aminonaftalīnsulfonskābi un hidroksinaftalīnsulfonskābi var pilnībā noārdīt jaukti baktēriju konsorciji ar komplementāriem kataboliskiem ceļiem (Nortemann et al., 1986). Ir pierādīts, ka viens konsorcija loceklis desulfurē aminonaftalīnsulfonskābi vai hidroksinaftalīnsulfonskābi ar 1,2-dioksigenācijas palīdzību, savukārt aminosalicilāts vai hidroksisalicilāts tiek izdalīts barotnē kā strupceļa metabolīts, un to pēc tam uzņem citi konsorcija locekļi. Naftalēndisulfonskābe ir relatīvi polāra, bet slikti bioloģiski noārdāma, tāpēc to var metabolizēt pa dažādiem ceļiem. Pirmā desulfurizācija notiek aromātiskā gredzena un sulfonskābes grupas regioselektīvas dihidroksilēšanas laikā; otrā desulfurizācija notiek 5-sulfosalicilskābes hidroksilēšanas laikā ar salicilskābes 5-hidroksilāzi, veidojot gentisīnskābi, kas nonāk centrālajā oglekļa ceļā (Brilon et al., 1981) (4. attēls). Enzīmi, kas ir atbildīgi par naftalīna noārdīšanos, ir atbildīgi arī par naftalīna sulfonāta metabolismu (Brilon et al., 1981; Keck et al., 2006).
4. attēls. Naftalīna sulfonāta noārdīšanās metabolisma ceļi. Apļos esošie skaitļi apzīmē fermentus, kas ir atbildīgi par naftilsulfonāta metabolismu, līdzīgi/identiski 3. attēlā aprakstītajiem fermentiem.
Zemas molekulmasas PAO (ZMPA-PAO) ir reducējami, hidrofobi un slikti šķīstoši, tāpēc tie nav uzņēmīgi pret dabisku sadalīšanos/degradāciju. Tomēr aerobie mikroorganismi spēj tos oksidēt, absorbējot molekulāro skābekli (O2). Šie enzīmi galvenokārt pieder pie oksidoreduktāžu klases un var veikt dažādas reakcijas, piemēram, aromātiskā gredzena hidroksilēšanu (mono- vai dihidroksilēšanu), dehidrogenēšanu un aromātiskā gredzena šķelšanu. Šajās reakcijās iegūtie produkti ir augstākā oksidācijas pakāpē un vieglāk metabolizējas caur centrālo oglekļa ceļu (Phale et al., 2020). Ir ziņots, ka enzīmi degradācijas ceļā ir inducējami. Šo enzīmu aktivitāte ir ļoti zema vai niecīga, ja šūnas tiek audzētas uz vienkāršiem oglekļa avotiem, piemēram, glikozes vai organiskajām skābēm. 3. tabulā ir apkopoti dažādi enzīmi (oksigenāzes, hidrolāzes, dehidrogenāzes, oksidāzes utt.), kas iesaistīti naftalīna un tā atvasinājumu metabolismā.
3. tabula. Naftalīna un tā atvasinājumu noārdīšanā iesaistīto enzīmu bioķīmiskās īpašības.
Radioizotopu pētījumi (18O2) ir parādījuši, ka molekulārā O2 iekļaušana aromātiskajos gredzenos ar oksigenāžu palīdzību ir vissvarīgākais solis savienojuma tālākas biodegradācijas aktivizēšanā (Hayaishi et al., 1955; Mason et al., 1955). Viena skābekļa atoma (O) iekļaušanu no molekulārā skābekļa (O2) substrātā ierosina vai nu endogēnas, vai eksogēnas monooksigenāzes (sauktas arī par hidroksilāzēm). Vēl viens skābekļa atoms tiek reducēts līdz ūdenim. Eksogēnas monooksigenāzes reducē flavīnu ar NADH vai NADPH, savukārt endomonooksigenāzēs flavīnu reducē substrāts. Hidroksilēšanas pozīcija rada produktu veidošanās daudzveidību. Piemēram, salicilāta 1-hidroksilāze hidroksilē salicilskābi C1 pozīcijā, veidojot kateholu. No otras puses, daudzkomponentu salicilāta 5-hidroksilāze (kas satur reduktāzes, ferredoksīna un oksigenāzes apakšvienības) hidroksilē salicilskābi C5 pozīcijā, veidojot gentisīnskābi (Yamamoto et al., 1965).
Dioksigenāzes iekļauj substrātā divus O2 atomus. Atkarībā no veidotajiem produktiem tās iedala gredzena hidroksilēšanas dioksigenāzēs un gredzena šķelšanas dioksigenāzēs. Gredzena hidroksilēšanas dioksigenāzes pārveido aromātiskos substrātus par cis-dihidrodioliem (piemēram, naftalīnu) un ir plaši izplatītas baktēriju vidū. Līdz šim ir pierādīts, ka organismi, kas satur gredzena hidroksilēšanas dioksigenāzes, spēj augt uz dažādiem aromātiskā oglekļa avotiem, un šie enzīmi tiek klasificēti kā NDO (naftalīns), toluola dioksigenāze (TDO, toluols) un bifenila dioksigenāze (BPDO, bifenils). Gan NDO, gan BPDO var katalizēt dažādu policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (toluola, nitrotoluola, ksilola, etilbenzola, naftalīna, bifenila, fluorēna, indola, metilnaftalīna, naftalīnsulfonāta, fenantrēna, antracēna, acetofenona u. c.) dubulto oksidēšanos un sānu ķēžu hidroksilēšanu (Boyd and Sheldrake, 1998; Phale et al., 2020). NDO ir daudzkomponentu sistēma, kas sastāv no oksidoreduktāzes, ferredoksīna un aktīvās vietas saturoša oksigenāzes komponenta (Gibson and Subramanian, 1984; Resnick et al., 1996). NDO katalītiskā vienība sastāv no lielas α apakšvienības un mazas β apakšvienības, kas izvietotas α3β3 konfigurācijā. NDO pieder pie lielas oksigenāžu saimes, un tā α apakšvienība satur Rīskes vietu [2Fe-2S] un mononukleāru nehēma dzelzi, kas nosaka NDO substrāta specifiskumu (Parales et al., 1998). Parasti viena katalītiskā cikla laikā divi elektroni no piridīna nukleotīda reducēšanas tiek pārnesti uz Fe(II) jonu aktīvajā centrā, izmantojot reduktāzi, ferredoksīnu un Rīskes vietu. Reducējošie ekvivalenti aktivizē molekulāro skābekli, kas ir priekšnoteikums substrāta dihidroksilēšanai (Ferraro et al., 2005). Līdz šim tikai daži NDO ir attīrīti un detalizēti raksturoti no dažādiem celmiem, un naftalīna degradācijā iesaistīto ceļu ģenētiskā kontrole ir detalizēti pētīta (Resnick et al., 1996; Parales et al., 1998; Karlsson et al., 2003). Gredzenu šķeļošās dioksigenāzes (endo- vai orto-gredzenu šķeļošie enzīmi un eksodiolu vai meta-gredzenu šķeļošie enzīmi) iedarbojas uz hidroksilētiem aromātiskiem savienojumiem. Piemēram, orto-gredzenu šķeļošā dioksigenāze ir katehola-1,2-dioksigenāze, savukārt meta-gredzenu šķeļošā dioksigenāze ir katehola-2,3-dioksigenāze (Kojima et al., 1961; Nozaki et al., 1968). Papildus dažādām oksigenāzēm pastāv arī dažādas dehidrogenāzes, kas ir atbildīgas par aromātisko dihidrodiolu, spirtu un aldehīdu dehidrogenēšanu un izmanto NAD+/NADP+ kā elektronu akceptorus, kas ir daži no svarīgākajiem metabolismā iesaistītajiem enzīmiem (Gibson un Subramanian, 1984; Shaw un Harayama, 1990; Fahle et al., 2020).
Fermenti, piemēram, hidrolāzes (esterāzes, amidāzes), ir otra svarīga enzīmu klase, kas izmanto ūdeni, lai šķeltu kovalentās saites, un kuriem piemīt plaša substrāta specifiskums. Karbarilhidrolāze un citas hidrolāzes tiek uzskatītas par periplazmas (transmembrānas) komponentiem gramnegatīvajās baktērijās (Kamini et al., 2018). Karbarilam ir gan amīda, gan estera saite; tāpēc to var hidrolizēt vai nu ar esterāzi, vai amidāzi, veidojot 1-naftolu. Ir ziņots, ka karbarils Rhizobium rhizobium celmā AC10023 un Arthrobacter celmā RC100 darbojas attiecīgi kā esterāze un amidāze. Karbarils Arthrobacter celmā RC100 darbojas arī kā amidāze. Ir pierādīts, ka RC100 hidrolizē četrus N-metilkarbamāta klases insekticīdus, piemēram, karbarilu, metomilu, mefenāmskābi un XMC (Hayaatsu et al., 2001). Ir ziņots, ka CH Pseudomonas sp. C5pp var iedarboties uz karbarilu (100% aktivitāte) un 1-naftilacetātu (36% aktivitāte), bet ne uz 1-naftilacetamīdu, kas norāda, ka tā ir esterāze (Trivedi et al., 2016).
Bioķīmiskie pētījumi, enzīmu regulācijas modeļi un ģenētiskā analīze ir parādījuši, ka naftalīna noārdīšanās gēni sastāv no divām inducējamām regulējošām vienībām jeb "operoniem": nah ("augšupvērstais ceļš", kas naftalīnu pārvērš salicilskābē) un sal ("lejupvērstais ceļš", kas salicilskābi pārvērš centrālajā oglekļa ceļā caur kateholu). Salicilskābe un tās analogi var darboties kā induktori (Shamsuzzaman un Barnsley, 1974). Glikozes vai organisko skābju klātbūtnē operons tiek represēts. 5. attēlā parādīta pilnīga naftalīna noārdīšanās ģenētiskā organizācija (operona formā). Ir aprakstīti vairāki nosaukti nah gēna varianti/formas (ndo/pah/dox), un tiem ir konstatēta augsta secības homoloģija (90%) starp visām Pseudomonas sugām (Abbasian et al., 2016). Naftalīna augšupvērstā ceļa gēni parasti bija sakārtoti konsensa secībā, kā parādīts 5.A attēlā. Tika ziņots, ka vēl viens gēns, nahQ, ir iesaistīts naftalīna metabolismā un parasti atrodas starp nahC un nahE, taču tā faktiskā funkcija vēl nav noskaidrota. Līdzīgi nahY gēns, kas ir atbildīgs par naftalīna jutīgo hemotaksi, dažiem locekļiem tika atrasts nah operona distālajā galā. Ralstonia sp. ēkā U2 gēns, kas kodē glutationa S-transferāzi (gsh), tika atrasts starp nahAa un nahAb, bet neietekmēja naftalīna izmantošanas raksturlielumus (Zylstra et al., 1997).
5. attēls. Naftalīna noārdīšanās laikā novērotā ģenētiskā organizācija un daudzveidība baktēriju sugās; (A) Augšējais naftalīna ceļš, naftalīna metabolisms par salicilskābi; (B) Apakšējais naftalīna ceļš, salicilskābe caur kateholu uz centrālo oglekļa ceļu; (C) salicilskābe caur gentisātu uz centrālo oglekļa ceļu.
“Apakšējais ceļš” (sal operons) parasti sastāv no nahGTHINLMOKJ un pārvērš salicilātu par piruvātu un acetaldehīdu, izmantojot katehola metaringa šķelšanās ceļu. Tika konstatēts, ka nahG gēns (kas kodē salicilāta hidroksilāzi) ir konservēts operona proksimālajā galā (5.B att.). Salīdzinot ar citiem naftalīnu noārdošiem celmiem, P. putida CSV86 nah un sal operoni ir tandēmā un ļoti cieši saistīti (apmēram 7,5 kb). Dažās gramnegatīvās baktērijās, piemēram, Ralstonia sp. U2, Polaromonas naphthalenivorans CJ2 un P. putida AK5, naftalīns tiek metabolizēts kā centrālais oglekļa metabolīts, izmantojot gentisāta ceļu (sgp/nag operona veidā). Gēna kasete parasti tiek attēlota formā nagAaGHAbAcAdBFCQEDJI, kur nagR (kas kodē LysR tipa regulatoru) atrodas augšējā galā (5.C attēls).
Karbarils nonāk centrālajā oglekļa ciklā, metabolizējot 1-naftolu, 1,2-dihidroksinaftalīnu, salicilskābi un gentisīnskābi (3. attēls). Pamatojoties uz ģenētiskiem un vielmaiņas pētījumiem, ir ierosināts šo ceļu sadalīt “augšupējā” (karbarila pārvēršana salicilskābē), “vidējā” (salicilskābes pārvēršana gentisīnskābē) un “lejupējā” (gentisīnskābes pārvēršana centrālā oglekļa ceļa starpproduktos) (Singh et al., 2013). C5pp (superkontigs A, 76,3 kb) genomiskā analīze atklāja, ka mcbACBDEF gēns ir iesaistīts karbarila pārvēršanā salicilskābē, kam seko mcbIJKL salicilskābes pārvēršanā gentisīnskābē un mcbOQP gentisīnskābes pārvēršanā centrālā oglekļa starpproduktos (fumarāts un piruvāts, Trivedi et al., 2016) (6. attēls).
Ir ziņots, ka aromātisko ogļūdeņražu (tostarp naftalīna un salicilskābes) noārdīšanā iesaistītos enzīmus var inducēt atbilstošie savienojumi un inhibēt vienkārši oglekļa avoti, piemēram, glikoze vai organiskās skābes (Shingler, 2003; Phale et al., 2019, 2020). Starp dažādajiem naftalīna un tā atvasinājumu metabolisma ceļiem zināmā mērā ir pētītas naftalīna un karbarila regulējošās iezīmes. Naftalīna gadījumā gan augšupējā, gan lejupējā ceļa gēnus regulē NahR, LysR tipa transaktīvais pozitīvs regulators. Tas ir nepieciešams nah gēna indukcijai ar salicilskābi un tā sekojošai augsta līmeņa ekspresijai (Yen un Gunsalus, 1982). Turklāt pētījumi ir parādījuši, ka integratīvais saimniekfaktors (IHF) un XylR (sigma 54 atkarīgs transkripcijas regulators) ir arī kritiski svarīgi gēnu transkripcijas aktivācijai naftalīna metabolismā (Ramos et al., 1997). Pētījumi liecina, ka naftalīna un/vai salicilskābes klātbūtnē tiek inducēti katehola meta-gredzena atvēršanas ceļa enzīmi, proti, katehola 2,3-dioksigenāze (Basu et al., 2006). Pētījumi liecina, ka benzoskābes un cis,cis-mukonāta klātbūtnē tiek inducēti katehola orto-gredzena atvēršanas ceļa enzīmi, proti, katehola 1,2-dioksigenāze (Parsek et al., 1994; Tover et al., 2001).
C5pp celmā pieci gēni — mcbG, mcbH, mcbN, mcbR un mcbS — kodē regulatorus, kas pieder pie LysR/TetR transkripcijas regulatoru saimes, kas ir atbildīgi par karbarila degradācijas kontroli. Tika konstatēts, ka homologais gēns mcbG ir visciešāk saistīts ar LysR tipa regulatoru PhnS (58 % aminoskābju identitāte), kas iesaistīts fenantrēna metabolismā Burkholderia RP00725 (Trivedi et al., 2016). Tika konstatēts, ka mcbH gēns ir iesaistīts starpposma ceļā (salicilskābes pārvēršana par gentisīnskābi) un pieder pie LysR tipa transkripcijas regulatora NagR/DntR/NahR Pseudomonas un Burkholderia. Ir ziņots, ka šīs saimes locekļi atpazīst salicilskābi kā specifisku efektora molekulu degradācijas gēnu indukcijai. No otras puses, lejupējā ceļā (gentisāta-centrālā oglekļa ceļa metabolīti) tika identificēti trīs gēni - mcbN, mcbR un mcbS, kas pieder pie LysR un TetR tipa transkripcijas regulatoriem.
Prokariotos horizontālie gēnu pārneses procesi (iegūšana, apmaiņa vai pārnešana), izmantojot plazmīdas, transpozonus, profāgus, genoma salas un integratīvos konjugatīvos elementus (ICE), ir galvenie baktēriju genomu plastiskuma cēloņi, kas noved pie specifisku funkciju/iezīmju iegūšanas vai zaudēšanas. Tas ļauj baktērijām ātri pielāgoties dažādiem vides apstākļiem, nodrošinot saimniekam potenciālas adaptīvas vielmaiņas priekšrocības, piemēram, aromātisko savienojumu noārdīšanos. Vielmaiņas izmaiņas bieži tiek panāktas, precīzi pielāgojot noārdīšanās operonus, to regulēšanas mehānismus un enzīmu specifiskumu, kas veicina plašāka aromātisko savienojumu klāsta noārdīšanos (Nojiri et al., 2004; Phale et al., 2019, 2020). Ir konstatēts, ka naftalīna noārdīšanās gēnu kasetes atrodas uz dažādiem mobilajiem elementiem, piemēram, plazmīdām (konjugatīvām un nekonjugatīvām), transpozoniem, genomiem, ICE un dažādu baktēriju sugu kombinācijām (5. attēls). Pseudomonas G7 celmā plazmīdā NAH7 nah un sal operoni tiek transkribēti vienā orientācijā un ir daļa no defektīva transpozona, kura mobilizācijai nepieciešama transpozāze Tn4653 (Sota et al., 2006). Pseudomonas celmā NCIB9816-4 gēns tika atrasts konjugatīvajā plazmīdā pDTG1 kā divi operoni (aptuveni 15 kb attālumā viens no otra), kas tika transkribēti pretējos virzienos (Dennis un Zylstra, 2004). Pseudomonas putida celmā AK5 nekonjugatīvā plazmīdā pAK5 ir kodējoša enzīma, kas ir atbildīgs par naftalīna noārdīšanos, izmantojot gentisāta ceļu (Izmalkova et al., 2013). Pseudomonas celmā PMD-1 nah operons atrodas hromosomā, savukārt sal operons atrodas konjugatīvajā plazmīdā pMWD-1 (Zuniga et al., 1981). Tomēr Pseudomonas stutzeri AN10 visi naftalīna degradācijas gēni (nah un sal operoni) atrodas hromosomā un, domājams, tiek piesaistīti transpozīcijas, rekombinācijas un pārkārtošanās notikumu rezultātā (Bosch et al., 2000). Pseudomonas sp. CSV86 nah un sal operoni atrodas genomā ICE (ICECSV86) formā. Struktūru aizsargā tRNAGly, kam seko tieši atkārtojumi, kas norāda uz rekombinācijas/piestiprināšanās vietām (attR un attL), un fāgam līdzīga integrāze, kas atrodas abos tRNAGly galos, tādējādi strukturāli līdzīgs ICEclc elementam (ICEclcB13 Pseudomonas knackmusii hlorokatehola degradācijai). Ir ziņots, ka ICE esošos gēnus var pārnest ar konjugāciju, izmantojot ārkārtīgi zemu pārneses frekvenci (10-8), tādējādi pārnesot degradācijas īpašības uz recipientu (Basu un Phale, 2008; Phale et al., 2019).
Lielākā daļa gēnu, kas ir atbildīgi par karbarila degradāciju, atrodas plazmīdās. Arthrobacter sp. RC100 satur trīs plazmīdas (pRC1, pRC2 un pRC300), no kurām divas konjugatīvās plazmīdas, pRC1 un pRC2, kodē enzīmus, kas pārvērš karbarilu par gentisātu. No otras puses, enzīmi, kas iesaistīti gentisāta pārvēršanā par centrālajiem oglekļa metabolītiem, atrodas hromosomā (Hayaatsu et al., 1999). Rhizobium ģints baktērijas. Celms AC100, ko izmanto karbarila pārvēršanai par 1-naftols, satur plazmīdu pAC200, kurā ir cehA gēns, kas kodē CH, kā daļa no Tnceh transpozona, ko ieskauj ievietošanas elementam līdzīgas sekvences (istA un istB) (Hashimoto et al., 2002). Tiek uzskatīts, ka Sphingomonas celmā CF06 karbarila degradācijas gēns atrodas piecās plazmīdās: pCF01, pCF02, pCF03, pCF04 un pCF05. Šo plazmīdu DNS homoloģija ir augsta, kas norāda uz gēnu dublēšanās notikuma esamību (Feng et al., 1997). Karbarilu noārdošajā simbiontā, kas sastāv no divām Pseudomonas sugām, celms 50581 satur konjugatīvo plazmīdu pCD1 (50 kb), kas kodē mcd karbarila hidrolāzes gēnu, savukārt konjugatīvā plazmīda celmā 50552 kodē 1-naftolu noārdošo enzīmu (Chapalamadugu un Chaudhry, 1991). Achromobacter celmā WM111 mcd furadāna hidrolāzes gēns atrodas 100 kb plazmīdā (pPDL11). Ir pierādīts, ka šis gēns atrodas dažādās plazmīdās (100, 105, 115 vai 124 kb) dažādās baktērijās no dažādiem ģeogrāfiskiem reģioniem (Parekh et al., 1995). Pseudomonas sp. C5pp visi gēni, kas ir atbildīgi par karbarila degradāciju, atrodas genomā, kas aptver 76,3 kb secības (Trivedi et al., 2016). Genoma analīze (6,15 Mb) atklāja 42 MGE un 36 GEI klātbūtni, no kuriem 17 MGE atradās superkontigā A (76,3 kb) ar vidējo asimetrisku G+C saturu (54–60 mol%), kas liecina par iespējamiem horizontāliem gēnu pārneses notikumiem (Trivedi et al., 2016). P. putida XWY-1 uzrāda līdzīgu karbarila degradācijas gēnu izkārtojumu, bet šie gēni atrodas plazmīdā (Zhu et al., 2019).
Papildus vielmaiņas efektivitātei bioķīmiskajā un genomiskajā līmenī mikroorganismiem piemīt arī citas īpašības vai reakcijas, piemēram, hemotaksis, šūnu virsmas modifikācijas īpašības, nodalījumi, preferenciāla izmantošana, biosurfaktantu ražošana utt., kas palīdz tiem efektīvāk metabolizēt aromātiskos piesārņotājus piesārņotā vidē (7. attēls).
7. attēls. Ideālu aromātiskos ogļūdeņražus noārdošu baktēriju dažādas šūnu atbildes reakcijas stratēģijas efektīvai svešu piesārņotāju savienojumu biodegradācijai.
Ķīmiskās atbildes reakcijas tiek uzskatītas par faktoriem, kas veicina organisko piesārņotāju noārdīšanos heterogēni piesārņotās ekosistēmās. (2002) pierādīja, ka Pseudomonas sp. G7 ķīmijtakse uz naftalīnu palielināja naftalīna noārdīšanās ātrumu ūdens sistēmās. Savvaļas tipa celms G7 noārdīja naftalīnu daudz ātrāk nekā mutantu celms ar ķīmijtakses deficītu. Tika konstatēts, ka NahY proteīns (538 aminoskābes ar membrānas topoloģiju) tiek kotranskribēts ar metašķelšanās ceļa gēniem NAH7 plazmīdā, un, tāpat kā ķīmijtakses pārveidotāji, šis proteīns, šķiet, darbojas kā naftalīna noārdīšanās hemoreceptors (Grimm un Harwood 1997). Cits Hansel et al. (2009) pētījums parādīja, ka proteīns ir ķīmijtakses proteīns, bet tā noārdīšanās ātrums ir augsts. (2011) pierādīja Pseudomonas (P. putida) ķīmijtakses reakciju uz gāzveida naftalīnu, kur gāzes fāzes difūzija izraisīja stabilu naftalīna plūsmu uz šūnām, kas kontrolēja šūnu ķīmijtakses reakciju. Pētnieki izmantoja šo hemotaktisko uzvedību, lai konstruētu mikrobus, kas palielinātu degradācijas ātrumu. Pētījumi liecina, ka hemosensorie ceļi regulē arī citas šūnu funkcijas, piemēram, šūnu dalīšanos, šūnu cikla regulēšanu un bioplēves veidošanos, tādējādi palīdzot kontrolēt degradācijas ātrumu. Tomēr šīs īpašības (hemotaksises) izmantošanu efektīvai degradācijai kavē vairāki šķēršļi. Galvenie šķēršļi ir: (a) dažādi paralogi receptori atpazīst tos pašus savienojumus/ligandus; (b) alternatīvu receptoru esamība, t.i., enerģētiskais tropisms; (c) būtiskas secības atšķirības vienas receptoru saimes sensoros domēnos; un (d) informācijas trūkums par galvenajiem baktēriju sensorproteīniem (Ortega et al., 2017; Martin-Mora et al., 2018). Dažreiz aromātisko ogļūdeņražu biodegradācija rada vairākus metabolītus/starpproduktus, kas var būt hemotaktiski vienai baktēriju grupai, bet atbaidoši citām, vēl vairāk sarežģot procesu. Lai identificētu ligandu (aromātisko ogļūdeņražu) mijiedarbību ar ķīmiskajiem receptoriem, mēs konstruējām hibrīdus sensoru proteīnus (PcaY, McfR un NahY), sapludinot Pseudomonas putida un Escherichia coli sensoru un signalizācijas domēnus, kas attiecīgi vērsti uz aromātisko skābju, TCA starpproduktu un naftalīna receptoriem (Luu et al., 2019).
Naftalīna un citu policiklisko aromātisko ogļūdeņražu (PAO) ietekmē baktēriju membrānas struktūra un mikroorganismu integritāte piedzīvo būtiskas izmaiņas. Pētījumi liecina, ka naftalīns traucē acilķēdes mijiedarbību, izmantojot hidrofobas mijiedarbības, tādējādi palielinot membrānas pietūkumu un plūstamību (Sikkema et al., 1995). Lai novērstu šo kaitīgo ietekmi, baktērijas regulē membrānas plūstamību, mainot attiecību un taukskābju sastāvu starp izo/anteizo sazarotās ķēdes taukskābēm un izomerizējot cis-nepiesātinātās taukskābes atbilstošajos trans-izomēros (Heipieper un de Bont, 1994). Pseudomonas stutzeri, kas audzēti, apstrādājot ar naftalīnu, piesātināto un nepiesātināto taukskābju attiecība palielinājās no 1,1 līdz 2,1, savukārt Pseudomonas JS150 šī attiecība palielinājās no 7,5 līdz 12,0 (Mrozik et al., 2004). Audzējot uz naftalīna, Achromobacter KAs 3–5 šūnas uzrādīja šūnu agregāciju ap naftalīna kristāliem un šūnu virsmas lādiņa samazināšanos (no -22,5 līdz -2,5 mV), ko pavadīja citoplazmas kondensācija un vakuolizācija, kas norāda uz izmaiņām šūnu struktūrā un šūnu virsmas īpašībās (Mohapatra et al., 2019). Lai gan šūnu/virsmas izmaiņas ir tieši saistītas ar labāku aromātisko piesārņotāju uzņemšanu, attiecīgās bioinženierijas stratēģijas nav pilnībā optimizētas. Šūnu formas manipulācijas reti ir izmantotas, lai optimizētu bioloģiskos procesus (Volke un Nikel, 2018). Šūnu dalīšanos ietekmējošo gēnu dzēšana izraisa izmaiņas šūnu morfoloģijā. Šūnu dalīšanos ietekmējošo gēnu dzēšana izraisa izmaiņas šūnu morfoloģijā. Bacillus subtilis ir pierādīts, ka šūnu starpsienas proteīns SepF ir iesaistīts starpsienas veidošanā un ir nepieciešams turpmākajiem šūnu dalīšanās posmiem, taču tas nav būtisks gēns. Peptīdu glikāna hidrolāzes kodējošo gēnu dzēšana Bacillus subtilis izraisīja šūnu pagarināšanos, palielināja īpatnējo augšanas ātrumu un uzlaboja enzīmu ražošanas jaudu (Cui et al., 2018).
Lai panāktu efektīvu Pseudomonas celmu C5pp un C7 noārdīšanu, ir ierosināta karbarila noārdīšanās ceļa nodalījuma veidošana (Kamini et al., 2018). Tiek ierosināts, ka karbarils tiek transportēts periplazmatiskajā telpā caur ārējās membrānas starpsienu un/vai caur difūzām porīnām. CH ir periplazmatisks enzīms, kas katalizē karbarila hidrolīzi par 1-naftoolu, kas ir stabilāks, hidrofobāks un toksiskāks. CH ir lokalizēts periplazmā un tam ir zema afinitāte pret karbarilu, tādējādi kontrolējot 1-naftola veidošanos, novēršot tā uzkrāšanos šūnās un samazinot tā toksicitāti šūnām (Kamini et al., 2018). Iegūtais 1-naftols tiek transportēts citoplazmā caur iekšējo membrānu, sadaloties un/vai difūzijas ceļā, un pēc tam ar augstas afinitātes enzīmu 1NH to hidroksilē par 1,2-dihidroksinaftalīnu tālākai metabolismam centrālajā oglekļa ceļā.
Lai gan mikroorganismiem piemīt ģenētiskas un vielmaiņas spējas noārdīt ksenobiotiskos oglekļa avotus, to izmantošanas hierarhiskā struktūra (t. i., vienkāršu oglekļa avotu priekšroka pār sarežģītiem oglekļa avotiem) ir būtisks šķērslis biodegradācijai. Vienkāršu oglekļa avotu klātbūtne un izmantošana nomāc gēnus, kas kodē enzīmus, kuri noārda sarežģītus/nevēlamus oglekļa avotus, piemēram, PAO. Labi pētīts piemērs ir tas, ka, kad Escherichia coli kopā baro glikozi un laktozi, glikoze tiek izmantota efektīvāk nekā laktoze (Jacob un Monod, 1965). Ir ziņots, ka Pseudomonas noārda dažādus PAO un ksenobiotiskos savienojumus kā oglekļa avotus. Oglekļa avotu izmantošanas hierarhija Pseudomonas ir organiskās skābes > glikoze > aromātiskie savienojumi (Hylemon un Phibbs, 1972; Collier et al., 1996). Tomēr ir izņēmums. Interesanti, ka Pseudomonas sp. CSV86 baktērijai ir unikāla hierarhiska struktūra, kas priekšroku dod aromātisko ogļūdeņražu (benzoskābes, naftalīna u. c.) izmantošanai glikozes vietā un aromātisko ogļūdeņražu kometabolizē ar organiskajām skābēm (Basu et al., 2006). Šajā baktērijā aromātisko ogļūdeņražu noārdīšanas un transportēšanas gēni netiek samazināti pat otrā oglekļa avota, piemēram, glikozes vai organisko skābju, klātbūtnē. Audzējot glikozes un aromātisko ogļūdeņražu vidē, tika novērots, ka glikozes transportēšanas un metabolisma gēni tika samazināti, aromātiskie ogļūdeņraži tika izmantoti pirmajā log fāzē, bet glikoze — otrajā log fāzē (Basu et al., 2006; Choudhary et al., 2017). Savukārt organisko skābju klātbūtne neietekmēja aromātisko ogļūdeņražu metabolisma ekspresiju, tāpēc sagaidāms, ka šī baktērija būs kandidātu celms biodegradācijas pētījumiem (Phale et al., 2020).
Ir labi zināms, ka ogļūdeņražu biotransformācija var izraisīt oksidatīvo stresu un antioksidantu enzīmu regulācijas palielināšanos mikroorganismos. Neefektīva naftalīna biodegradācija gan stacionārās fāzes šūnās, gan toksisku savienojumu klātbūtnē noved pie reaktīvo skābekļa sugu (ROS) veidošanās (Kang et al. 2006). Tā kā naftalīnu noārdošie enzīmi satur dzelzs-sēra klasterus, oksidatīvā stresa ietekmē dzelzs hēma un dzelzs-sēra proteīnos tiks oksidēts, izraisot olbaltumvielu inaktivāciju. Ferredoksīna-NADP+ reduktāze (Fpr) kopā ar superoksīda dismutāzi (SOD) mediē atgriezenisku redoksreakciju starp NADP+/NADPH un divām ferredoksīna vai flavodoksīna molekulām, tādējādi iznīcinot ROS un atjaunojot dzelzs-sēra centru oksidatīvā stresa ietekmē (Li et al. 2006). Ir ziņots, ka gan Fpr, gan SodA (SOD) Pseudomonas celmos var izraisīt oksidatīvais stress, un četros Pseudomonas celmos (O1, W1, As1 un G1) augšanas laikā naftalīna pievienošanas apstākļos tika novērota palielināta SOD un katalāzes aktivitāte (Kang et al., 2006). Pētījumi liecina, ka antioksidantu, piemēram, askorbīnskābes vai dzelzs (Fe2+) pievienošana var palielināt naftalīna augšanas ātrumu. Kad Rhodococcus erythropolis auga naftalīna vidē, palielinājās ar oksidatīvo stresu saistīto citohroma P450 gēnu, tostarp sodA (Fe/Mn superoksīda dismutāze), sodC (Cu/Zn superoksīda dismutāze) un recA, transkripcija (Sazykin et al., 2019). Naftalīnā kultivētu Pseudomonas šūnu salīdzinošā kvantitatīvā proteomikas analīze parādīja, ka dažādu ar oksidatīvā stresa reakciju saistītu olbaltumvielu regulācijas pastiprināšana ir stresa pārvarēšanas stratēģija (Herbst et al., 2013).
Ir ziņots, ka mikroorganismi hidrofobu oglekļa avotu iedarbībā ražo biosurfaktantus. Šīs virsmaktīvās vielas ir amfifīli virsmaktīvās vielas, kas var veidot agregātus eļļas-ūdens vai gaisa-ūdens saskarvirsmās. Tas veicina pseidošķīdināšanu un atvieglo aromātisko ogļūdeņražu adsorbciju, kā rezultātā tiek panākta efektīva biodegradācija (Rahman et al., 2002). Šo īpašību dēļ biosurfaktanti tiek plaši izmantoti dažādās nozarēs. Ķīmisko virsmaktīvo vielu vai biosurfaktantu pievienošana baktēriju kultūrām var uzlabot ogļūdeņražu noārdīšanās efektivitāti un ātrumu. Starp biosurfaktantiem ir plaši pētīti un raksturoti Pseudomonas aeruginosa ražotie ramnolipīdi (Hisatsuka et al., 1971; Rahman et al., 2002). Turklāt cita veida biosurfaktanti ir lipopeptīdi (mucīni no Pseudomonas fluorescens), emulgators 378 (no Pseudomonas fluorescens) (Rosenberg un Ron, 1999), trehalozes disaharīdu lipīdi no Rhodococcus (Ramdahl, 1985), lihenīns no Bacillus (Saraswathy un Hallberg, 2002) un virsmaktīvās vielas no Bacillus subtilis (Siegmund un Wagner, 1991) un Bacillus amyloliquefaciens (Zhi et al., 2017). Ir pierādīts, ka šīs spēcīgās virsmaktīvās vielas samazina virsmas spraigumu no 72 diniem/cm līdz mazāk nekā 30 diniem/cm, nodrošinot labāku ogļūdeņražu absorbciju. Ir ziņots, ka Pseudomonas, Bacillus, Rhodococcus, Burkholderia un citas baktēriju sugas, audzējot naftalīna un metilnaftalīna vidē, var producēt dažādas uz ramnolipīdiem un glikolipīdiem balstītas biosurfaktantu vielas (Kanga et al., 1997; Puntus et al., 2005). Pseudomonas maltophilia CSV89, audzējot uz aromātiskiem savienojumiem, piemēram, naftoīnskābes, var producēt ekstracelulāru biosurfaktantu Biosur-Pm (Phale et al., 1995). Biosur-Pm veidošanās kinētika parādīja, ka tā sintēze ir no augšanas un pH atkarīgs process. Tika konstatēts, ka šūnu saražotā Biosur-Pm daudzums neitrālā pH līmenī bija lielāks nekā pie pH 8,5. Šūnas, audzētas pie pH 8,5, bija hidrofobākas un tām bija lielāka afinitāte pret aromātiskiem un alifātiskiem savienojumiem nekā šūnām, audzētām pie pH 7,0. Rhodococcus spp. N6, augstāka oglekļa un slāpekļa (C:N) attiecība un dzelzs ierobežojums ir optimāli apstākļi ekstracelulāro biosurfaktantu ražošanai (Mutalik et al., 2008). Ir mēģināts uzlabot biosurfaktantu (surfaktīnu) biosintēzi, optimizējot celmus un fermentāciju. Tomēr virsmaktīvās vielas titrs barotnē ir zems (1,0 g/l), kas rada izaicinājumu liela mēroga ražošanai (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Tāpēc, lai uzlabotu tās biosintēzi, ir izmantotas ģenētiskās inženierijas metodes. Tomēr tās inženierijas modifikācija ir sarežģīta operona lielā izmēra (∼25 kb) un sarežģītās kvoruma noteikšanas sistēmas biosintēzes regulācijas dēļ (Jiao et al., 2017; Wu et al., 2019). Bacillus baktērijās ir veiktas vairākas ģenētiskās inženierijas modifikācijas, galvenokārt vērstas uz surfaktīna ražošanas palielināšanu, aizstājot promotoru (srfA operonu), pārmērīgi ekspresējot surfaktīna eksporta proteīnu YerP un regulējošos faktorus ComX un PhrC (Jiao et al., 2017). Tomēr šīs ģenētiskās inženierijas metodes ir panākušas tikai vienu vai dažas ģenētiskās modifikācijas un vēl nav sasniegušas komerciālu ražošanu. Tāpēc ir nepieciešama turpmāka uz zināšanām balstītu optimizācijas metožu izpēte.
PAO biodegradācijas pētījumi galvenokārt tiek veikti standarta laboratorijas apstākļos. Tomēr ir pierādīts, ka piesārņotās vietās vai vidē daudzi abiotiskie un biotiskie faktori (temperatūra, pH, skābeklis, barības vielu pieejamība, substrāta biopieejamība, citi ksenobiotikas, galaproduktu inhibīcija utt.) maina un ietekmē mikroorganismu noārdīšanās spēju.
Temperatūrai ir būtiska ietekme uz PAO biodegradāciju. Pieaugot temperatūrai, samazinās izšķīdušā skābekļa koncentrācija, kas ietekmē aerobo mikroorganismu metabolismu, jo tiem ir nepieciešams molekulārais skābeklis kā viens no substrātiem oksigenāzēm, kas veic hidroksilēšanas vai gredzena šķelšanas reakcijas. Bieži tiek atzīmēts, ka paaugstināta temperatūra pārveido PAO pamatsavienojumus toksiskākos savienojumos, tādējādi kavējot biodegradāciju (Muller et al., 1998).
Ir atzīmēts, ka daudzās ar PAO piesārņotās vietās ir ekstremālas pH vērtības, piemēram, skābi saturošu raktuvju drenāžas piesārņotās vietās (pH 1–4) un dabasgāzes/ogļu gazifikācijas vietās, kas piesārņotas ar sārmainu filtrātu (pH 8–12). Šie apstākļi var nopietni ietekmēt biodegradācijas procesu. Tāpēc pirms mikroorganismu izmantošanas bioremediācijā ieteicams pielāgot pH, pievienojot piemērotas ķīmiskas vielas (ar mērenu līdz ļoti zemu oksidācijas-reducēšanas potenciālu), piemēram, amonija sulfātu vai amonija nitrātu sārmainās augsnēs vai kaļķošanu ar kalcija karbonātu vai magnija karbonātu skābās vietās (Bowlen et al. 1995; Gupta un Sar 2020).
Skābekļa piegāde skartajai zonai ir PAO biodegradācijas ātrumu ierobežojošais faktors. Sakarā ar vides redoksa apstākļiem, in situ bioremediācijas procesiem parasti ir nepieciešama skābekļa ievadīšana no ārējiem avotiem (aršana, gaisa padeve un ķimikāliju pievienošana) (Pardieck et al., 1992). Odenkranz et al. (1996) pierādīja, ka magnija peroksīda (skābekli atbrīvojoša savienojuma) pievienošana piesārņotam ūdens nesējslānim varētu efektīvi bioremediēt BTEX savienojumus. Citā pētījumā tika pētīta fenola un BTEX noārdīšanās in situ piesārņotā ūdens nesējslānī, injicējot nātrija nitrātu un izbūvējot ieguves akas, lai panāktu efektīvu bioremediāciju (Bewley and Webb, 2001).