Pašreizējā adrese†: OX11 0DE, Apvienotā Karaliste, Diamond Building, Harwell Science and Innovation Park, Dietcote, Oxfordshire, Apvienotā Karaliste, Diamond Light Source Co., Ltd., Elektroniskās bioloģiskās attēlveidošanas centrs.
Reakcijas centra gaismu savācošais komplekss 1 (RC-LH1) ir purpursarkano fototrofo baktēriju galvenā fotosintēzes sastāvdaļa. Mēs ieviesām divas Rhodopseudomonas palustris RC-LH1 kompleksa krioelektronu mikroskopijas struktūras. RC-LH114-W kompleksa 2,65 Å izšķirtspējas struktūra sastāv no 14 apakšvienību LH1 cilpām, kas ieskauj RC, kuru pārtrauc proteīns W, savukārt komplekss bez proteīna-W pilnībā sastāv no RC sastāva, ko ieskauj RC. Slēgta 16 apakšvienību LH1 cilpa. Šo struktūru salīdzinājums sniedz ieskatu hinona dinamikā RC-LH1 kompleksā, tostarp iepriekš nenoteiktās konformācijas izmaiņās, saistoties ar hinonu RC QB vietā, kā arī palīghinona saistīšanās vietu atrašanās vietā, kas palīdz tās nodot RC. W proteīna unikālā struktūra novērš LH1 cilpas slēgšanos, tādējādi radot kanālu hinona/hinolona apmaiņas paātrināšanai.
Fotosintēzes nodrošinātā enerģija var uzturēt gandrīz visu dzīvību uz Zemes, un tai ir liels potenciāls Saules biotehnoloģijai. Veicinot globālo fotosintēzi, purpursarkanās fototrofās baktērijas demonstrē arī dažādus enerģijas režīmus un vielmaiņas spējas. Tās var izvairīties no fotosintēzes un augt kā heterotrofas baktērijas tumsā, var piesaistīt slāpekli un oglekļa dioksīdu, ražot ūdeņradi un noārdīt aromātiskos savienojumus (1–3). Lai nodrošinātu enerģiju šiem procesiem, gaisma ir ātri un efektīvi jāpārvērš ķīmiskajā enerģijā. Šis process sākas, kad gaismu uztverošais antenu komplekss absorbē gaismu un nodod uztverto enerģiju reakcijas centram (RC), tādējādi uzsākot lādiņu atdalīšanu (4–7). Purpursarkano fototrofo baktēriju fotosintēzes pamatvienība sastāv no 2. tipa RC, ko ieskauj gaismu uztverošais komplekss 1 (LH1), veidojot RC-LH1 kodola kompleksu. LH1 veido virkne izliektu αβ heterodimēru, no kuriem katrs saista divas baktēriju hlorofila (BChl) α molekulas un vienu vai divus karotinoīdus (8–12). Vienkāršākā LH1 antena sastāv no 16 vai 17 αβ heterodimēriem, kas slēgtā cilpā aptver RC (9-13), bet citos kodola kompleksos transmembrānas peptīdi pārtrauc apkārtējā LH1 nepārtrauktību, tādējādi veicinot hinola/hinona difūziju starp RC un citohroma bc1 kompleksu (11, 13-15). Violetais fototrofiskais augs Rhodopseudomonas (Rps.) ir modeļa organisms, kas spēj izprast enerģijas un elektronu pārnesi, kas nodrošina fotosintēzi. Rps pirmā kristāliskā struktūra. Palustris RC-LH1 kompleksa modelis ir RC, ko ieskauj 15 heterodimēriskas LH1 cilpas, kuras pārtrauc nezināms proteīns, ko sauc par "Proteīnu W" (14). Proteīns-W vēlāk tika identificēts kā RPA4402, kas ir neraksturots 10,5 kDa proteīns ar trim paredzētām transmembrānas spirālēm (TMH) (16). Mēs ierosinām pārdēvēt rpa4402 gēnu, kas kodē proteīnu W, par pufW, lai tas atbilstu nomenklatūrai, ko izmanto gēniem, kas kodē RC-L, M (pufL, pufM) un LH1α, β (pufA, pufB) apakšvienības. Interesanti, ka proteīns W ir sastopams tikai aptuveni 10% RC-LH1, atklājot, ka Rps. palustris ražo divus dažādus RC-LH1 kompleksus. Šeit mēs ziņojam par divu galveno kompleksu augstas izšķirtspējas krio-EM (krio-EM) struktūrām: vienu ar proteīnu W un 14 αβ heterodimēriem, otru bez proteīna W un slēgtu 16 heterodimēru LH1 cilpu. Mūsu struktūra atspoguļo pakāpenisku maiņu izpratnē par Rps. palustris RC-LH1 kompleksu, jo mēs esam analizējuši katra varianta homogēno populāciju un mums ir pietiekama izšķirtspēja, lai skaidri noteiktu katru peptīdu un saistītos pigmentus, kā arī saistītos lipīdus un hinonus. Šo struktūru salīdzinājums parāda, ka trīs TMH proteīni-W, kas līdz šim nav atrasti nevienā citā RC-LH1 kompleksā, ģenerē hinona kanālu, lai paātrinātu hinona/hinolona apmaiņu. Ir identificētas vairākas konservētas lipīdu un hinona saistīšanās vietas, un mēs esam atklājuši jaunas konformācijas izmaiņas pēc hinona un RC kombinācijas, kas varētu būt piemērota skābekli saturošu fototrofisko organismu fotosistēmas II (PSII) RC. Mūsu atklājumi sniedz jaunu ieskatu hinona/hinolona saistīšanās un apmaiņas kinētikā purpursarkano fototrofisko baktēriju RC-LH1 kodola kompleksā.
Lai atvieglotu divu Rps. palustris atrodamo kompleksu detalizētu izpēti, mēs katru RC-LH1 izolējam ar bioķīmiskām metodēm. Komplekss ar proteīna W deficītu (turpmāk tekstā — ΔpufW) tika attīrīts no celma, kuram trūkst pufW gēna (16), un var tikt ražots tikai viens RC-LH1 komplekss. Kompleksu, kas satur proteīnu W, ražo celms. Šī celma proteīns W ir modificēts ar 10x His tagu tā C galā, lai proteīnu W saturošo kompleksu varētu efektīvi apvienot ar lielāko daļu proteīna W, kam trūkst proteīna, imobilizējot metālu. Komplekss tiek efektīvi atdalīts (16) ar afinitātes hromatogrāfijas (IMAC) palīdzību.
Kā parādīts 1. attēlā, abi kompleksi satur trīs apakšvienības RC (RC-L, RC-M un RC-H), ko ieskauj LH1 antena. Kompleksa 2,80-A struktūra bez proteīna-W uzrāda 16 αβ heterodimērus, veidojot slēgtu LH1 cilpu, kas pilnībā ieskauj RC, turpmāk tekstā saukts par RC-LH116 kompleksu. Proteīnu-W saturošā kompleksa 2,65Å struktūrai ir 14 heterodimērs LH1, ko pārtrauc proteīns-W, turpmāk tekstā saukts par RC-LH114-W.
(A un B) Savienojuma virsmas attēlojums. (C un D) Saistītie pigmenti, kas izteikti stieņos. (E un F) No citoplazmas virsmas novērotajiem kompleksiem peptīdi un LH1 apakšvienības ir attēlotas karikatūrās un ir numurētas pulksteņrādītāja virzienā no proteīna-W spraugas [saskaņā ar Rba numerāciju. sphaeroides komplekss (13)]. LH1-α proteīna apakšvienības krāsa ir dzeltena; LH1-β proteīna apakšvienības krāsa ir zila; proteīna-W proteīns ir sarkans; RC-H tas ir ciāna; RC-L tas ir oranžs; RC-M - fuksīna. Kofaktorus attēlo stieņi, zaļa krāsa apzīmē BChl un BPh a molekulas, violeta krāsa apzīmē karotinoīdus un dzeltena krāsa apzīmē UQ10 molekulas. (G un H) Proteīna-W spraugas palielinājums RC-LH114-W kompleksa (G) un RC-LH116 kompleksa (H) ekvivalentajā reģionā. Kofaktori ir attēloti kā telpas aizpildījums, helatēts hinons ir attēlots zilā krāsā. Proteīna-W sprauga ir iezīmēta ar zilu pārtrauktu līniju (G) attēlā, un mazie caurumiņi, kur hinons/hinolols difundē uz LH116 gredzena, ir iezīmēti ar melnu pārtrauktu līniju (H) attēlā.
1. attēlā (A un B) redzams RC, ko ieskauj atvērti vai slēgti LH1αβ heterodimēru masīvi, no kuriem katrs saistās ar diviem BChl un vienu karotinoīdu (1., C un D attēls). Iepriekšējie pētījumi ir parādījuši, ka Rps ir LH1 komplekss. Spirulīnas ksantīna biosintēzes ceļā šīs sugas satur jauktas karotinoīdu populācijas (17). Tomēr spiropirroksantīns ir dominējošais karotinoīds, un tā blīvums ir apmierinošs. Tāpēc mēs izvēlējāmies modelēt spiroksantīnu visās LH1 saistīšanās vietās. Alfa un beta polipeptīdi ir atsevišķi TMH ar īsiem membrānas ārējiem reģioniem (1. attēls, A, B, E un F). Lai gan 17 atlikumu blīvums C-galā netika novērots, alfa polipeptīds abos kompleksos tika sašķelts no Met1 uz Ala46. β polipeptīds tika reducēts no Gly4 uz Tyr52 RC-LH116 un no Ser5 uz Tyr52 RC-LH114-W. Netika novērots 3 vai 4 N-terminālu vai 13 C-terminālu atlikumu blīvums (1. attēls). No savvaļas tipa celma sagatavotā jauktā RC-LH1 kompleksa masas spektrometrijas analīze parādīja, ka trūkstošais reģions ir šo peptīdu heterologas šķelšanās rezultāts (1. un 2. attēls). Tika novērota arī α-Met1 N-termināla formilēšana (f). Analīze parādīja, ka α-peptīds sastāv no atlikumiem fMet1 līdz Asp42/Ala46/Ala47/Ala50, un β-peptīds sastāv no atlikumiem Ser2 līdz Ala53, kas labi atbilst zemas temperatūras EM blīvuma kartei.
α-His29 un β-His36 koordinācija veido BChls aci pret aci; katrs αβ heterodimērs apvienojas ar saviem kaimiņiem, veidojot atvērtu cilpu (RC-LH114-W) vai slēgtu cilpu (RC-LH116) ap RC. Eksitonu savienoto pigmentu masīvu (1. attēls, C un D). Salīdzinot ar RC-LH114-W 877 nm joslu, RC-LH116 absorbcijas sarkanā nobīde 880 nm ir 3 nm (2. attēls A). Tomēr cirkulārā dihroisma spektrs ir gandrīz vienāds (2. attēls B), kas norāda, ka, lai gan pastāv skaidra atšķirība starp atvērtām un slēgtām cilpām, BChls lokālā vide ir ļoti līdzīga. Absorbcijas sarkanā nobīde var būt samazinātas termiskās kustības un palielinātas stabilitātes rezultāts slēgtā cilpā (18, 19), slēgtās cilpas izraisītas pigmentu savienojuma izmaiņas (20, 21) vai šo divu efektu kombinācija (11).
(A) Ultravioletā/redzamā/tuvi infrasarkanā spektra absorbcijas spektrs, kura maksimumi ir atzīmēti ar atbilstošajiem pigmentiem un normalizēti attiecībā pret BPh maksimumu pie 775 nm. (B) Cirkulārā dihroisma spektrs, kas normalizēts attiecībā pret BChl absorbciju pie 805 nm. (C un D) Atlasītie ΔA spektri no RC-LH114-W kompleksa (C) un RC-LH116 kompleksa (D) laika izšķirtspējas absorbcijas spektriem. Labākai salīdzināmībai visi spektri ir normalizēti attiecībā pret ∆A no −A pie 0,2 ps. (E) Citohroma c2 oksidēšanās ātrums pēc apstarošanas dažādu UQ2 koncentrāciju klātbūtnē (neapstrādātus datus skatīt S8. attēlā). (F) Šūnās, kas audzētas zemas, vidējas vai augstas intensitātes apgaismojumā (attiecīgi 10, 30 vai 300 μMm-2 s-1), olbaltumvielu W un RC-L apakšvienības attīrītajā kompleksā un atdalīto membrānu attiecība. Nosakiet olbaltumvielu līmeni ar SDS-poliakrilamīda gela elektroforēzi un imūnanalīzi (neapstrādātus datus skatīt S9. attēlā). Nosakiet attiecību attiecībā pret attīrīto RC-LH114-W kompleksu. RC-L un proteīna-W stehiometriskā attiecība kompleksā ir 1:1.
RC-LH114-W deformētajā αβ14 cilpā 1. pozīcijā esošie BChl (1. attēls, A, C un E) atrodas par 6,8 Å tuvāk RC primārajam donoram (P) nekā ekvivalentie BChl RC-LH116 (1. attēls, B, D un F, un S3. attēls); tomēr abu kompleksu pārejas absorbcijas kinētika rāda, ka RC-LH114-W un RC-LH116 ierosmes enerģijas pārneses laika konstantes no LH1 uz RC ir 40 ± 4 un 44 ± 3 ps (2. attēls). , C un D, ​​S4. attēls un S2. tabula). Arī elektronisko pārnesi RC ietvaros būtiski neatšķir (S5. attēls un saistītais papildu teksts). Mēs pieņemam, ka enerģijas pārneses laika ciešā atbilstība starp LH1 un RC-P ir saistīta ar līdzīgo attālumu, leņķi un potenciālo enerģiju lielākajai daļai BChl abās LH1 cilpās. Šķiet, ka LH1 enerģijas modeļa izpēte, lai sasniegtu minimālo attālumu, nav ātrāka par tiešu enerģijas pārnesi no suboptimālām vietām uz RC. Atvērtās cilpas LH1 cilpa RC-LH114-W struktūrā zemas temperatūras apstākļos var arī piedzīvot nenozīmīgu termisko kustību, un istabas temperatūrā ir garāka αβ14 gredzena konformācija no βBChls pigmentācijas attāluma RC1 pozīcijā.
RC-LH116 komplekss satur 32 BChl un 16 karotinoīdus, un tā kopējais izkārtojums ir tāds pats kā iegūts no Thermochromatium (Tch.) pidpidum [Protein Data Bank (PDB) ID 5Y5S] (9), Thiorhodovibrio (Trv.) 970 celma (PDB ID 7C9R) (12) un zaļaļģēm (Blc.viridis) (PDB ID 6ET5) (10). Pēc izlīdzināšanas tika novērotas tikai nelielas novirzes αβ heterodimēru pozīcijās, īpaši 1-5, 15 un 16 (S6. attēls). W proteīna klātbūtne būtiski ietekmē LH1 struktūru. Tā trīs TMH ir savienoti ar īsām cilpām, N-galam atrodoties kompleksa lūmena pusē un C-galam citoplazmas pusē (1.A un 3. attēls, no A līdz D). W proteīns lielākoties ir hidrofobs (3.B attēls), un TMH2 un TMH3 mijiedarbojas ar LH1αβ-14, veidojot transmembrānas virsmu (3. attēls, B un E līdz G). Saskarni galvenokārt veido Phe, Leu un Val atlikumi transmembrānas reģionā. Šie atlikumi ir sakrauti ar hidrofobām aminoskābēm un αβ-14 pigmentiem. Mijiedarbību veicina arī daži polārie atlikumi, tostarp ūdeņraža saite starp W-Thr68 un β-Trp42 uz kompleksa dobuma virsmas (3. attēls, F un G). Citoplazmas virsmā Gln34 atrodas blakus αβ-14 karotinoīdu keto grupai. Turklāt n-dodecil-β-d-maltozīda (β-DDM) molekula tika atdalīta, un tās hidrofobā aste tika pagarināta līdz W proteīna un αβ-14 saskarnei, un lipīdu aste var atrasties ķermenī. Mēs arī ievērojām, ka proteīna W un RCH C-termināla izšķirtspējas reģioni atrodas ļoti tuvu viens otram, taču ne tik tuvu, lai veidotos specifiskas mijiedarbības (1. attēls, A un E). Tomēr mijiedarbība var pastāvēt arī šo divu proteīnu neatrisinātajās C-termināla aminoskābēs, kas varētu nodrošināt mehānismu proteīna-W piesaistei RC-LH114-W kompleksa montāžas laikā.
(A) W proteīnam, kas multfilmas veidā ir vērsts pret saskarni ar LH1αβ14, ir stieņa formas sānu ķēde (sarkana), kas attēlota elektrostatiskā potenciāla diagrammas daļā (caurspīdīga pelēka virsma ar kontūras līmeni 0,13). (B) W proteīns, ko attēlo hidrofoba krāsaina virsma. Polārie un lādētie apgabali ir attēloti ciāna krāsā, hidrofobie apgabali ir attēloti baltā krāsā, bet stipri hidrofobie apgabali ir attēloti oranžā krāsā. (C un D) W proteīns, kas attēlots multfilmā, tā orientācija ir tāda pati kā (A) (C) attēlā, un pagriezts par 180° (D). Atbilstoši pozīcijai secībā atšķiramie atlikumi pieņem varavīksnes krāsu shēmu, kur N-gals ir zils un C-gals ir sarkans. (E) W proteīns tādā pašā skatā kā (A), un atlikumi W proteīna:LH1 saskarnē ir attēloti ar stieņiem ar piestiprinātām atzīmēm. (F) W proteīns ir pagriezts par 90° attiecībā pret (E) un LH1αβ14 multfilmas attēlojumā, un attiecībā pret saskarnes atlikumiem stieņu attēlojumā. Pārkarenās beta polipeptīda atliekas ir iezīmētas. Kofaktors ir parādīts kā josla, kas atbilst 1. attēla krāsai, sadalītais β-DDM ir parādīts pelēkā krāsā, bet skābeklis ir parādīts sarkanā krāsā. (G) Skats (F) ir pagriezts par 180°, un tajā ir redzamas iezīmētā alfa polipeptīda redzamās atliekas.
Proteīns-W aizvieto αβ heterodimēru (15. 1.F attēlā), tādējādi novēršot cilpas aizvēršanos un noliecot pirmos trīs αβ heterodimērus. Tika novērots, ka pirmā αβ-1 heterodimēra maksimālais slīpuma leņķis attiecībā pret plēves normāli bija no 25° līdz 29° (1. attēls, A un E), ko veidoja αβ-1 slīpums no 2° līdz 8° RC A asajā kontrastā-LH116 (1. attēls, B un F). Otrais un trešais heterodimērs ir slīpi attiecīgi no 12° līdz 22° un no 5° līdz 10°. RC steriskā šķēršļa dēļ αβ-1 slīpums neietver otro αβ pāri (kas atbilst 16. αβ 1.F attēlā), tādējādi veidojot skaidru spraugu LH1 gredzenā (1. attēls, A un E). Divu αβ heterodimēru trūkuma dēļ, kā arī četru BChl un divu karotinoīdu zuduma dēļ neviens no karotinoīdiem nesaistās ar savīto αβ-1 apakšvienību, kā rezultātā LH114-W gredzens satur 13 karotinoīdus – veģetāros un 28 BChl. Abu kompleksu lokālās izšķirtspējas aprēķini αβ1 līdz 7 reģionos ir zemāki nekā pārējai LH1 cilpai, kas var atspoguļot LH1 apakšvienības raksturīgo plastiskumu blakus RC QB vietai (4. attēls).
RC-LH114-W (A un B) un RC-LH116 (C un D) attēli ir parādīti no tā paša skata no augšas/sāna (A un B) (A un C) un dobuma virsmas, kas redzama 1. attēlā (B un D). Krāsainie taustiņi ir parādīti labajā pusē.
Vienīgais cits raksturīgais kodola komplekss ar stehiometrisko attiecību 1:14 ir Rhodococcus sphaeroides (Rba.) RC-LH1-PufX dimērs (13). Tomēr proteīnam W un PufX nav acīmredzamas homoloģijas, un tiem ir būtiska ietekme uz to attiecīgajām LH1 struktūrām. PufX ir viens TMH ar N-terminālu citoplazmatisko domēnu, kas mijiedarbojas ar RC-H apakšvienības citoplazmatisko pusi (13) pozīcijā, kas atbilst Rps. palustris LH116αβ-16. PufX rada kanālu hinona/hinolona apmaiņai starp RC-LH1 un citohroma bcl kompleksu un ir sastopams visos Rba. sphaeroides kodola kompleksos (13). Lai gan monomēra-monomēra saskarne atrodas Rba. Sphaeroides RC-LH1-PufX dimērs atrodas proteīna W saistīšanās pozīcijā RC-LH114-W, un PufX un proteīna-W inducētā sprauga atrodas līdzvērtīgā pozīcijā (S7A. attēls). RC-LH114-W sprauga atbilst arī hipotētiskajam Pseudomonas rosea LH1 hinona kanālam (8), ko veido peptīdi, kas nav saistīti ar proteīnu W vai PufX (S7B attēls). Turklāt hinona kanāls Blc. Smaragdzaļais LH1, kas veidojas, izslēdzot vienu γ apakšvienību (7), atrodas līdzīgā pozīcijā (S7C attēls). Lai gan to mediē dažādi proteīni, šo hinona/hinolola kanālu parādīšanās kopīgā pozīcijā RC-LH1 kompleksā, šķiet, ir konverģentas evolūcijas piemērs, kas norāda, ka proteīna W radītā sprauga var darboties kā hinona kanāls.
Sprauga LH114-W cilpā ļauj veidot nepārtrauktu membrānas reģionu starp RC-LH114-W kompleksa iekšējo telpu un kopējo membrānu (1.G attēls), nevis savienojot abus domēnus caur olbaltumvielu poru, kā tas ir olbaltumvielās. RC-LH116 komplekss ir līdzīgs slēgtam Tch. Adatai līdzīgam kompleksam (22) (1.H attēls). Tā kā hinona difūzija caur membrānu ir ātrāka nekā difūzija caur šauru olbaltumvielu kanālu, atvērtā LH114-W cilpa var nodrošināt ātrāku RC apgrozījumu nekā slēgtā LH116 cilpa, un hinona difūzija RC var būt ierobežotāka. Lai pārbaudītu, vai proteīns W ietekmē hinonu konversiju caur RC, mēs veicām citohroma oksidācijas testu ar noteiktu ubikinona 2 (UQ2) koncentrāciju (dabiskā UQ10 analogs ar īsāku izoprēna asti) (2.E attēls). Lai gan helatēta hinona klātbūtne kavē precīzu šķietamās Miķeļa konstantes noteikšanu (RC-LH114-W un RC-LH116 ir piemēroti attiecīgi 0,2±0,1μM un 0,5±0,2μM koncentrācijām), RC-LH114-W maksimālais ātrums (4,6±0,2 e-RC-1 s-1) ir par 28±5% lielāks nekā RC-LH116 (3,6±0,1 e-RC-1 s-1).
Sākotnēji mēs lēsām, ka proteīns-W ir aptuveni 10% no kodola kompleksa (16); šeit vāja, vidēja un augsta apgaismojuma augšanas šūnu aizpildīšanas rādītāji ir attiecīgi 15±0,6%, 11±1% un 0,9±0,5% (2.F attēls). Masas spektrometrijas kvantitatīvais salīdzinājums parādīja, ka histidīna marķējuma pievienošana nesamazināja proteīna-W relatīvo daudzumu salīdzinājumā ar savvaļas tipa celmiem (P = 0,59), tāpēc šie līmeņi nav modificēta proteīna-W artefakts (S10 attēls). Tomēr šī zemā proteīna-W aizpildīšana RC-LH1 kompleksā var ļaut dažiem RC apgriezties paātrinātā ātrumā, tādējādi mazinot lēnāku hinona/hinolona apmaiņu RC-LH116 kompleksā. Mēs pamanījām, ka augstais gaismas aizpildīšanas līmenis neatbilst jaunākajiem transkriptomikas datiem, kas norāda, ka pufW gēna ekspresija palielinās spēcīgā apgaismojumā (S11 attēls) (23). Atšķirība starp pufW transkripciju un proteīna-W iekļaušanu RC-LH1 kompleksā ir mulsinoša un var atspoguļot proteīna sarežģīto regulāciju.
RC-LH114-W kompleksā ir izdalītas un modelētas 6 kardiolipīna (CDL), 7 fosfatidilholīna (POPC), 1 fosfatidilglicerīna (POPG) un 29 β-DDM molekulas – 6 CDL, 24 POPC, 2 POPG un 12 βDDM. RC-LH116 (5. attēls, A un B). Šajās divās struktūrās CDL gandrīz atrodas kompleksa citoplazmatiskajā pusē, savukārt POPC, POPG un β-DDM galvenokārt atrodas lūmena pusē. RC-LH114-W kompleksa αβ-1 līdz αβ-6 reģionā tika izolētas divas lipīdu un mazgāšanas līdzekļa molekulas (5. attēls, A), un piecas tika izolētas RC-LH116 ekvivalentajā reģionā (5. attēls, B). Vairāk lipīdu tika atrasti kompleksa otrā pusē, galvenokārt CDL, kas uzkrājās starp RC un αβ-7 līdz αβ-13 (5. attēls, A un B). Citi strukturāli izšķirti lipīdi un detergenti atrodas ārpus LH1 gredzena, un labi izšķirtas acilķēdes stiepjas starp LH1 apakšvienībām, kas RC-LH114-W provizoriski apzīmētas kā β-DDM un RC A maisījumā, kas sastāv no β-DDM un POPC-LH116, definētas kā β-DDM. Helātu veidojošo lipīdu un detergentu līdzīgās pozīcijas mūsu struktūrā norāda, ka tās ir fizioloģiski nozīmīgas saistīšanās vietas (S12A attēls). Arī ekvivalentu molekulu pozīcijām Tch ir laba konsekvence. Gentle un Trv. 970. celma RC-LH1 (S12. attēls, no B līdz E) (9, 12) un lipīdu galvas grupas ūdeņraža saišu atlikumi uzrādīja diezgan labu saglabāšanos secības izlīdzināšanā (S13. attēls), norādot, ka konservēts CDL, kas saistās ar RC (24), šīs vietas var būt saglabājušās RC-LH1 kompleksā.
(A un B) RC-LH114-W (A) un RC-LH116 (B) peptīdi ir attēloti ar zīmējumiem, un pigmenti ir attēloti ar stieņiem, izmantojot 1. attēlā redzamo krāsu shēmu. Lipīdi ir attēloti sarkanā krāsā, bet detergenti - pelēkā krāsā. Ar RC QA un QB vietām saistītais UQ ir dzeltens, bet izolētais UQ ir zils. (C un D) Tie paši skati kā (A) un (B), bez lipīdiem. (E līdz G) Palielināts Q1(E), Q2(F) un Q3(G) skats no RC-LH116 ar sānu ķēdēm, kas ietekmē viena otru. Ūdeņraža saites ir attēlotas kā melnas pārtrauktas līnijas.
RC-LH116 struktūrā gan RC QA, gan QB UQ, kas piedalās elektronu pārnesē lādiņa atdalīšanas procesā, tiek sadalīti to saistīšanās vietās. Tomēr RC-LH114-W struktūrā QB hinons nav atdalīts un tiks detalizēti aplūkots turpmāk. Papildus QA un QB hinoniem divas helatētas UQ molekulas (kas atrodas starp RC un LH1 gredzeniem) RC-LH114-W struktūrā ir izvietotas atbilstoši to labi atdalītajām galvas grupām (atrodas attiecīgi Q1 un Q2). 5.C attēls). Q1 ir piešķirtas divas izoprēna vienības, un blīvuma karte izšķir visas 10 Q2 izoprēna astes. RC-LH116 struktūrā tika atdalītas trīs helatētas UQ10 molekulas (no Q1 līdz Q3, 5.D attēls), un visām molekulām ir skaidrs blīvums visā astē (5. attēls, no D līdz G). Abās struktūrās hinona galvas grupu Q1 un Q2 pozīcijām ir lieliska konsistence (S12F attēls), un tās mijiedarbojas tikai ar RC. Q1 atrodas RC-LH114-W W spraugas ieejā (1.G attēls un 5. attēls, C, D un E), un Q2 atrodas netālu no QB saistīšanās vietas (5. attēls, C, D un F). Konservētie L-Trp143 un L-Trp269 atlikumi atrodas ļoti tuvu Q1 un Q2 un nodrošina potenciālas π-kraušanas mijiedarbības (5. attēls, E un F, un S12 attēls). L-Gln88, 3,0 Å attālumā no Q1 distālā skābekļa, nodrošina spēcīgu ūdeņraža saiti (5.E attēls); šis atlikums ir konservēts visos RC, izņemot visattālāko radniecību (S13 attēls). L-Ser91 vairumā citu RC ir konservatīvi aizvietots ar Thr (S13. attēls), atrodas 3,8 angstrēmu attālumā no Q1 metilskābekļa un var nodrošināt vājas ūdeņraža saites (5.E attēls). Q3, šķiet, neveic specifisku mijiedarbību, bet tas atrodas hidrofobajā reģionā starp RC-M apakšvienību un LH1-α apakšvienību 5 līdz 6 (5.E attēls). Q1, Q2 un Q3 vai tuvumā esošie helatētie hinoni ir atšķirti arī Tch. Gentle, Trv. Strain 970 un Blc. Varavīksnenes struktūra (9, 10, 12) norāda uz konservētu palīghinona saistīšanās vietu RC-LH1 kompleksā (S12G attēls). Pieci sadalītie UQ RC-LH116 labi atbilst katra kompleksa 5,8 ± 0,7 vērtībai, kas noteikta ar augstas veiktspējas šķidruma hromatogrāfiju (HPLC), savukārt trīs sadalītie UQ RC-LH114-W ir zemāki par . Izmērītā vērtība 6,2 ± 0,3 (S14. att.) norāda, ka struktūrā ir neatrisinātas UQ molekulas.
Pseidosimetriskie L un M polipeptīdi katrs satur piecus TMH un veido heterodimēru, kas apvieno vienu BChl dimēru, divus BChl monomērus, divus bakteriofāga (BPh) monomērus un vienu nehēma dzelzi un vienu vai divas UQ10 molekulas. Pateicoties ūdeņraža saišu klātbūtnei terminālajā ketonu grupā un tā zināmajai uzkrāšanai Rps, karotinoīdi tiek iekļauti M apakšvienībā, ko sauc par cis-3,4-dehidroorodopīnu. Suga (25). RC-H ārējās membrānas domēns ir piestiprināts pie membrānas ar vienu TMH. Kopējā RC struktūra ir līdzīga radniecīgu sugu (piemēram, Rba) trīs apakšvienību RC. sphaeroides (PDB ID: 3I4D). BChl un BPh makrocikli, karotinoīdu pamatķēde un nehēma dzelzs pārklājas šo struktūru izšķirtspējas diapazonā, tāpat kā UQ10 galvas grupa QA vietā un QB hinons pie RC-LH116 (S15. attēls).
Divu RC struktūru pieejamība ar atšķirīgu QB vietu aizpildīšanas ātrumu sniedz jaunu iespēju izpētīt pastāvīgās konformācijas izmaiņas, kas pavada QB hinona saistīšanos. RC-LH116 kompleksā QB hinons atrodas pilnībā saistītā "proksimālā" pozīcijā (26), bet RC-LH114-W atdalīšanai nav QB hinona. RC-LH114-W nav QB hinona, kas ir pārsteidzoši, jo komplekss ir aktīvs, vairāk nekā RC-LH116 komplekss ar strukturāli atdalītu QB hinonu. Lai gan divi LH1 gredzeni helatē aptuveni sešus hinonus, pieci ir strukturāli atdalīti slēgtajā RC-LH116 gredzenā, savukārt tikai trīs ir strukturāli ierobežoti atvērtajā RC-LH114-W gredzenā. Šī palielinātā strukturālā nesakārtotība var atspoguļot ātrāku RC-LH114-W QB vietu aizvietošanu, ātrāku hinona kinētiku kompleksā un palielinātu LH1 cilpas šķērsošanas varbūtību. Mēs pieņemam, ka UQ trūkums RC-LH114-W RC QB vietā varētu būt sarežģītāka un aktīvāka kompleksa rezultāts, un RC-LH114-W QB vieta ir nekavējoties iesaldēta UQ apritē. Konkrētais posms (ieeja QB vietā ir slēgta) atspoguļo šīs aktivitātes konformāciju.
Bez QB notiek L-Phe217 rotācija pozīcijā, kas nav savienojama ar UQ10 saistīšanos, jo tā izraisīs telpisku sadursmi ar astes pirmo izoprēna vienību (6.A attēls). Turklāt ir acīmredzamas galvenās konformācijas izmaiņas, īpaši spirāle de (īsa spirāle cilpā starp TMH D un E), kur L-Phe217 tiek nobīdīta uz QB saistīšanās kabatu, un L-Tyr223 rotācija (6.A attēls), lai pārrautu ūdeņraža saiti ar M-Asp45 karkasu un aizvērtu QB saistīšanās vietas ieeju (6.B attēls). Helix de pagriežas pie pamatnes, L-Ser209 Cα tiek nobīdīts par 0,33 Å, savukārt L-Val221Cα tiek nobīdīts par 3,52 Å. TMH D un E nav novērojamu izmaiņu, kas ir pārklājamas abās struktūrās (6.A attēls). Cik mums zināms, šī ir pirmā struktūra dabiskajā RC, kas noslēdz QB vietu. Salīdzinājums ar pilno (ar QB saistīto) struktūru parāda, ka pirms hinona reducēšanas ir nepieciešamas konformācijas izmaiņas, lai tas iekļūtu hinonā. L-Phe217 rotē, veidojot π-krāvuma mijiedarbību ar hinona galvas grupu, un spirāle nobīdās uz āru, ļaujot L-Gly222 skeletam un L-Tyr223 sānu ķēdei veidot ūdeņraža saišu tīklu ar stabilu ūdeņraža saites struktūru (6. attēls, A un C).
(A) Pārklājoša hologrammas (L ķēde, oranža/M ķēde, fuksīna krāsa) un apo (pelēka) struktūras karikatūra, kurā galvenie atlikumi ir attēloti stieņa formā. UQ10 ir attēlots ar dzeltenu joslu. Punktētā līnija norāda ūdeņraža saites, kas izveidojušās visā struktūrā. (B un C) Apolipoproteīna un visas gredzena struktūras virsmas attēlojums, izceļot L-Phe217 sānu ķēdes skābekli attiecīgi zilā krāsā un L-Tyr223 sarkanā krāsā. L apakšvienība ir oranža; M un H apakšvienības nav iekrāsotas. (D un E) Apolipoproteīns (D) un viss (E) RC QB vietas [iekrāsots atbilstoši (A)] un Thermophilus thermophilus PSII (zaļa, zila ar plastmasas hinonu; PDB ID: 3WU2) Izlīdzināt (58).
Negaidīti, lai gan ir pieejamas vairākas QB deficītu RC struktūras bez LH1, šajā pētījumā novērotās konformācijas izmaiņas iepriekš nav ziņotas. Tās ietver QB noplicināšanas struktūru no Blc. viridis (PDB ID: 3PRC) (27), Tch. tepidum (PDB ID: 1EYS) (28) un Rba. sphaeroides (PDB ID: 1OGV) (29), kas visas ir gandrīz identiskas to kopējai QB struktūrai. Rūpīga 3PRC pārbaude atklāja, ka LDAO (laurildimetilamīna oksīda) mazgāšanas līdzekļa molekulas saistās pie QB pozīcijas ieejas, kas var novērst pārkārtošanos slēgtā konformācijā. Lai gan LDAO nesadalās vienā un tajā pašā pozīcijā 1EYS vai 1OGV, šie RC tiek sagatavoti, izmantojot to pašu mazgāšanas līdzekli, un tāpēc var radīt tādu pašu efektu. Šķiet, ka arī Rba. Sphaeroides RC kristāliskā struktūra, kas kokristalizēta ar citohromu c2 (PDB ID: 1L9B), satur slēgtu QB vietu. Tomēr šajā gadījumā RC-M polipeptīda N-terminālais reģions (mijiedarbojoties ar QB saistīšanās vietu caur Tyr atlikuma H saiti uz Q spirāles) iegūst nedabisku konformāciju, un QB konformācijas izmaiņas netiek tālāk pētītas (30). Nomierinoši ir tas, ka mēs neesam novērojuši šāda veida M polipeptīda deformāciju RC-LH114-W struktūrā, kas ir gandrīz tāda pati kā RC-LH116 RC N-terminālais reģions. Jāatzīmē arī, ka pēc uz mazgāšanas līdzekļa bāzes veidotās LH1 antenas likvidēšanas apolipoproteīnu RC PDB tika izzuduši, kas likvidēja iekšējās hinona kopas un lipīdus spraugā starp RC un apkārtējā LH1 gredzena iekšējo virsmu (31, 32). RC saglabā funkcionālu, jo tas saglabā visus kofaktorus, izņemot sadalāmo QB hinonu, kas ir mazāk stabils un bieži tiek zaudēts sagatavošanas procesā (33). Turklāt ir zināms, ka LH1 un dabisko ciklisko lipīdu atdalīšana no RC var ietekmēt funkcijas, piemēram, saīsināt lādiņdalītā P+QB stāvokļa dzīves ilgumu (31, 34, 35). Tāpēc mēs pieņemam, ka lokālā LH1 gredzena esamība ap RC varētu saglabāt “slēgto” QB vietu, tādējādi saglabājot lokālo vidi QB tuvumā.
Lai gan apolipoproteīns (bez QB hinona) un pilnīgā struktūra atspoguļo tikai divus QB vietas aprites momentuzņēmumus, nevis notikumu virkni, pastāv norādes, ka saistīšanos var ierobežot, lai novērstu atkārtotu saistīšanos ar hidrohinonu, kas kavē substrāta inhibīciju. Hinolola un hinona mijiedarbība apolipoproteīna QB vietas tuvumā var būt atšķirīga, kas noved pie tā atgrūšanas ar RC. Jau sen ir ierosināts, ka konformācijas izmaiņām ir nozīme hinonu saistīšanā un reducēšanā. Saldētu RC spēja reducēt hinonus pēc tumsas adaptācijas ir traucēta (36); rentgenkristalogrāfija parāda, ka šis bojājums rodas tāpēc, ka QB hinoni ir iesprostoti "distālā" konformācijā aptuveni 4,5 Å attālumā no aktīvās proksimālās pozīcijas (26), 37). Mēs pieņemam, ka šī distālā saistīšanās konformācija ir starpposma stāvokļa momentuzņēmums starp apolipoproteīnu un pilno gredzena struktūru, kas seko sākotnējai mijiedarbībai ar hinonu un QB vietas atvēršanai.
II tipa RC, kas atrodams noteiktu fototrofisko baktēriju un cianobaktēriju, aļģu un augu PSII kompleksā, ir strukturāli un funkcionāli saglabājies (38). 6. attēlā (D un E) parādītā strukturālā izlīdzināšana uzsver līdzību starp PSII RC un baktēriju RC kompleksa QB vietu. Šis salīdzinājums jau sen ir bijis modelis cieši saistīto hinonu saistīšanās un reducēšanas sistēmu izpētei. Iepriekšējās publikācijās tika norādīts, ka konformācijas izmaiņas pavada hinonu PSII reducēšanās (39, 40). Tādēļ, ņemot vērā RC evolūcijas saglabāšanos, šis iepriekš nenovērotais saistīšanās mehānisms var būt piemērojams arī PSII RC QB vietai skābekli saturošos fototrofos augos.
Rps ΔpufW (neiezīmēta pufW delēcija) un PufW-His (C-termināla 10x His-iezīmēts proteīns-W, kas ekspresēts no dabiskā pufW lokusa) celmi. palustris CGA009 tika aprakstīts mūsu iepriekšējā darbā (16). Šie celmi un izogēnais savvaļas tipa vecāks tika iegūti no saldētavas, nelielu skaitu šūnu svītrojot uz PYE (katra 5 g litrā -1) (uzglabāta LB barotnē -80 °C temperatūrā, kas satur 50% (w/v) glicerīna) proteīna, rauga ekstrakta un sukcināta agara [1,5% (w/v)] plates. Plate tika inkubēta nakti tumsā istabas temperatūrā anaerobos apstākļos un pēc tam 3 līdz 5 dienas apgaismota ar baltu gaismu (~50 μmolm-2 s-1), ko nodrošināja OSRAM 116-W halogēna spuldzes (RS Components, UK), līdz parādījās viena kolonija. Viena kolonija tika izmantota, lai inokulētu 10 ml M22+ barotnes (41), kas papildināta ar 0,1% (w/v) kazinoskābēm (turpmāk tekstā — M22). Kultūra tika audzēta zema skābekļa apstākļos tumsā 34°C temperatūrā, kratot ar ātrumu 180 apgr./min 48 stundas, un pēc tam 70 ml kultūras tika inokulēti tādos pašos apstākļos 24 stundas. Pusaerobā kultūra ar tilpumu 1 ml tika izmantota, lai inokulētu 30 ml M22 barotnes 30 ml universālā skrūvējamā caurspīdīgā stikla pudelē un apstarotu, kratot (~50μmolm-2 s-1) 48 stundas ar sterilu magnētiskā spēka maisīšanas stieni. Pēc tam 30 ml kultūras inokulēja ar aptuveni 1 litru kultūras tādos pašos apstākļos, kas pēc tam tika izmantota, lai inokulētu aptuveni 9 litrus kultūras, kas apgaismota ar ātrumu ~200 μmolm-2 s-1 72 stundas. Šūnas tika savāktas, centrifugējot pie 7132 RCF 30 minūtes, atkārtoti suspendētas ~10 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) un uzglabātas -20°C temperatūrā līdz nepieciešamībai.
Pēc atkausēšanas atkārtoti suspendētajām šūnām pievieno dažus dezoksiribonukleāzes I kristālus (Merck, Apvienotā Karaliste), lizocīmu (Merck, Apvienotā Karaliste) un divas Roche holoenzīma proteāzes inhibitora tabletes (Merck, Apvienotā Karaliste). 20 000 psi franču spiediena kamerā (Aminco, ASV) šūnas tika sagrautas 8 līdz 12 reizes. Pēc nesalauztu šūnu un nešķīstošo gružu atdalīšanas, centrifugējot ar 18 500 RCF 15 minūtes 4°C temperatūrā, membrāna tika nogulsnēta no pigmentētā lizāta, centrifugējot ar 113 000 RCF 2 stundas 43 000°C temperatūrā. Izmet šķīstošo frakciju un atkārtoti suspendē krāsaino membrānu 100 līdz 200 ml 20 mM tris-HCl (pH 8,0) un homogenizē, līdz vairs nav redzamu agregātu. Suspendēto membrānu inkubēja 20 mM tris-HCl (pH 8,0) (Anatrace, ASV), kas satur 2% (w/v) β-DDM, 1 stundu tumsā 4°C temperatūrā, viegli maisot. Pēc tam centrifugēja 70°C temperatūrā, lai izšķīdinātu 150 000 RCF 4°C temperatūrā 1 stundu, lai atdalītu atlikušās nešķīstošās vielas.
ΔpufW celma šķīdināšanas membrāna tika uzklāta uz 50 ml DEAE Sepharose jonu apmaiņas kolonnas ar trīs kolonnas tilpumiem (CV) saistīšanas buferšķīduma [20 mM tris-HCl (pH 8,0), kas satur 0,03% (w/v) β-DDM]. Kolonnu mazgā ar diviem CV saistīšanas buferšķīdumiem un pēc tam ar diviem saistīšanas buferšķīdumiem, kas satur 50 mM NaCl. RC-LH116 kompleksu eluēja ar lineāru gradientu no 150 līdz 300 mM NaCl (saistīšanas buferšķīdumā) uz 1,75 CV, bet atlikušo saistīšanas kompleksu eluēja ar saistīšanas buferšķīdumu, kas satur 300 mM NaCl, uz 0,5 CV. Savāc absorbcijas spektru starp 250 un 1000 nm, saglabā frakciju ar absorbcijas attiecību (A880/A280) lielāku par 1 pie 880 līdz 280 nm, divreiz atšķaida to saistīšanas buferšķīdumā un vēlreiz izmanto to pašu procedūru DEAE kolonnā attīrīšanas laikā. Atšķaida frakcijas ar A880/A280 attiecībām, kas lielākas par 1,7, un A880/A805 attiecībām, kas lielākas par 3,0, veic trešo jonu apmaiņas kārtu un saglabā frakcijas ar A880/A280 attiecībām, kas lielākas par 2,2, un A880/A805 attiecībām, kas lielākas par 5,0. Daļēji attīrītais komplekss tika koncentrēts līdz ~2 ml Amicon 100 000 molekulmasas robežvērtības (MWCO) centrbēdzes filtrā (Merck, Apvienotā Karaliste) un ielādēts Superdex 200 16/600 izmēra izslēgšanas kolonnā (GE Healthcare, ASV), kas satur 200 mM NaCl buferšķīdumu, un pēc tam eluēts tajā pašā buferšķīdumā ar 1,5 CV. Savāciet izmēru izslēgšanas frakcijas absorbcijas spektrus un koncentrējiet absorbcijas spektrus ar A880/A280 attiecībām virs 2,4 un A880/A805 attiecībām virs 5,8 līdz 100 A880, un nekavējoties izmantojiet tos krio-TEM režģa sagatavošanai vai uzglabāšanai. Uzglabājiet -80°C temperatūrā līdz nepieciešamībai.
PufW-His celma šķīdināšanas membrāna tika uzklāta uz 20 ml HisPrep FF Ni-NTA Sepharose kolonnas (20 mM tris-HCl (pH 8,0), kas satur 200 mM NaCl un 0,03% (m/m)) IMAC buferšķīdumā (GE Healthcare). v) β-DDM]. Kolonna tika mazgāta ar pieciem IMAC buferšķīduma tilpumiem un pēc tam ar pieciem IMAC buferšķīduma tilpumiem, kas satur 10 mM histidīnu. Kodola komplekss tika eluēts no kolonnas ar pieciem IMAC buferšķīdumiem, kas satur 100 mM histidīnu. Frakcija, kas satur RC-LH114-W kompleksu, tika koncentrēta līdz ~10 ml maisīšanas tvertnē, kas aprīkota ar Amicon 100 000 MWCO filtru (Merck, Apvienotā Karaliste), 20 reizes atšķaidīta ar saistīšanas buferšķīdumu un pēc tam pievienota 25 ml DEAE Sepharose kolonnā iepriekš tika izmantoti četri ar buferšķīdumu saistīti tilpumi. Kolonnu mazgā ar četriem CV saistīšanās buferšķīdumiem, pēc tam kompleksu eluē astoņos CV lineārā gradientā no 0 līdz 100 mM NaCl (saistīšanās buferšķīdumā), un atlikušajos četros CV, kas satur 100 mM saistīšanās buferšķīdumu. Atlikušie kompleksi, kas eluēti uz nātrija hlorīda, apvienojumā ar A880/A280 attiecību, kas lielāka par 2,4, un A880/A805 attiecību, kas lielāka par 4,6, frakcijas tika koncentrētas līdz ~2 ml Amicon 100 000 MWCO centrbēdzes filtrā un piepildītas ar 1,5 CV IMAC iepriekš buferšķīdumā līdzsvarotā Superdex 200 16/600 izmēra izslēgšanas kolonnā un pēc tam eluētas tajā pašā buferšķīdumā ar 1,5 CV tilpumu. Savāc izmēru izslēgšanas frakciju absorbcijas spektrus un koncentrē absorbcijas spektrus ar A880/A280 attiecībām virs 2,1 un A880/A805 attiecībām virs 4,6 līdz 100 A880, ko nekavējoties izmanto saldēta TEM režģa sagatavošanai vai uzglabā -80°C temperatūrā līdz nepieciešamībai.
Zemas temperatūras TEM režģu sagatavošanai tika izmantota Leica EM GP iegremdēšanas saldētava. Komplekss tika atšķaidīts IMAC buferšķīdumā līdz A880 50, un pēc tam 5 μl tika ielādēti jaunā, ar kvēlojošu izlādi izlādētā QUANTIFOIL 1.2/1.3 ar oglekli pārklātā vara sietā (Agar Scientific, Apvienotā Karaliste). Režģi inkubēja 20 °C temperatūrā un 60 % relatīvajā mitrumā 30 sekundes, pēc tam 3 sekundes žāvēja un pēc tam atdzesēja šķidrā etānā -176 °C temperatūrā.
RC-LH114-W kompleksa dati tika ierakstīti eBIC (Elektroniskajā bioattēlveidošanas centrā) (British Diamond Light Source) ar Titan Krios mikroskopu, kas darbojas ar paātrinājuma spriegumu 300 kV, ar nominālo palielinājumu 130 000× un enerģiju - izvēlieties atstarpi 20 eV. Attēlu ierakstīšanai skaitīšanas režīmā tika izmantots Gatan 968 GIF Quantum mikroskops ar K2 pīķa detektoru. Kalibrētā pikseļa izmērs ir 1,048 Å, un devas jauda ir 3,83 e-Å-2s-1. Video tika uzņemts 11 sekundēs un sadalīts 40 daļās. Izmantojiet ar ogli pārklāto laukumu, lai pārfokusētu mikroskopu, un pēc tam savāciet trīs video katrā caurumā. Kopumā tika savākti 3130 video ar defokusēšanas vērtībām no -1 līdz -3 μm.
RC-LH116 kompleksa dati tika apkopoti, izmantojot to pašu mikroskopu Asterberijas Biostruktūras laboratorijā (Līdsas Universitātē, Apvienotajā Karalistē). Dati tika apkopoti skaitīšanas režīmā ar 130 k palielinājumu, un pikseļu izmērs tika kalibrēts līdz 1,065 Å ar devu 4,6 e-Å-2s-1. Filma tika ierakstīta 12 sekundēs un sadalīta 48 daļās. Kopumā tika savāktas 3359 filmas ar defokusēšanas vērtībām no -1 līdz -3 μm.
Visa datu apstrāde tiek veikta Relion 3.0 cauruļvadā (42). Izmantojiet Motioncorr 2 (43), lai koriģētu stara kustību, izmantojot devas svēršanu, un pēc tam izmantojiet CTFFIND 4.1 (44), lai noteiktu CTF (kontrasta pārneses funkcijas) parametru. Tipiski fotomikrogrāfi pēc šiem sākotnējiem apstrādes posmiem ir parādīti 2. attēlā. S16. Automātiskās atlases veidne tiek ģenerēta, manuāli atlasot aptuveni 250 pikseļus ar 1000 daļiņām 250 pikseļu kadrā un bez atsauces divdimensiju (2D) klasifikācijas, tādējādi noraidot tās klasifikācijas, kas atbilst parauga piesārņojumam vai kurām nav saskatāmas īpašības. Pēc tam visām mikrogrāfijām tika veikta automātiskā atlase, un RC-LH114-W bija 849 359 daļiņas, bet RC-LH116 komplekss bija 476 547 daļiņas. Visas atlasītās daļiņas ir pakļautas divām 2D nekvalificētas klasifikācijas kārtām, un pēc katras kārtas tiek noraidītas daļiņas, kas atbilst oglekļa zonai, parauga piesārņojumam, bez acīmredzamām pazīmēm vai stipri pārklājošām daļiņām, kā rezultātā tiek iegūtas attiecīgi 772 033 (90,9 %) un 359 678 (75,5 %) daļiņas. Daļiņas tiek izmantotas RC-LH114-W un RC-LH116 3D klasifikācijai. Sākotnējais 3D atsauces modelis tika ģenerēts, izmantojot stohastisko gradienta nolaišanās metodi. Izmantojot sākotnējo modeli kā atsauci, atlasītās daļiņas tiek klasificētas četrās 3D kategorijās. Izmantojot šīs kategorijas modeli kā atsauci, veiciet 3D precizēšanu ar daļiņām lielākajā kategorijā, pēc tam izmantojiet sākotnējo 15 Å zemfrekvences filtru, lai pārklātu šķīdinātāja zonu, pievienojiet 6 pikseļus ar mīkstām malām un veiciet pikseļu pēcapstrādi, lai koriģētu augšējā detektora Gatan K2 pīķa modulācijas pārneses funkciju. RC-LH114-W datu kopai šis sākotnējais modelis tika modificēts, noņemot spēcīgo blīvumu maskas malās (atvienots no kodola kompleksa blīvuma UCSF himērā). Iegūtie modeļi (RC-LH114-W un RC-LH116 izšķirtspējas ir attiecīgi 3,91 un 4,16 Å) tiek izmantoti kā atsauce 3D klasifikācijas otrajai kārtai. Izmantotās daļiņas ir sagrupētas sākotnējā 3D klasē un nesatur spēcīgu korelāciju ar apkārtni. Pārklāšanās vai acīmredzamu strukturālo pazīmju trūkums. Pēc 3D klasifikācijas otrās kārtas tika izvēlēta kategorija ar augstāko izšķirtspēju [RC-LH114-W viena kategorija ir 377 703 daļiņas (44,5%), RC-LH116 ir divas kategorijas, kopā 260 752 daļiņas (54,7%), kur tās ir vienādas tikai tad, ja pēc sākotnējās rotācijas ir izlīdzinātas ar nelielu atšķirību]. Atlasītās daļiņas tiek atkārtoti ekstrahētas 400 pikseļu lodziņā un precizētas, izmantojot 3D precizēšanu. Šķīdinātāja maska ​​tiek ģenerēta, izmantojot sākotnējo 15 Å zemfrekvences filtru, 3 pikseļu kartes paplašināšanu un 3 pikseļu mīksto masku. Izmantojot daļiņu CTF precizēšanu, daļiņu kustības korekciju un otro daļiņu CTF precizēšanas kārtu, pēc katra soļa tiek veikta 3D precizēšana, šķīdinātāja maskēšana un pēcapstrāde, lai vēl vairāk precizētu iegūto tekstūru. Izmantojot FSC (Furjē čaulas korelācijas koeficienta) robežvērtību 0,143, RC-LH114-W un RC-LH116 galīgo modeļu izšķirtspēja ir attiecīgi 2,65 un 2,80 Å. Galīgā modeļa FSC līkne ir parādīta 2. attēlā. S17.
Visas olbaltumvielu sekvences ir lejupielādētas no UniProtKB: LH1-β (PufB; UniProt ID: Q6N9L5); LH1-α (PufA; UniProt ID: Q6N9L4); RC-L (PufL; UniProt ID: O83005); RC-M (PufM; UniProt ID: A0A4Z7); RC-H (PuhA; UniProt ID: A0A4Z9); Protein-W (PufW; UniProt ID: Q6N1K3). SWISS-MODEL (45) tika izmantots, lai konstruētu RC homoloģijas modeli, kas satur RC-L, RC-M un RC-H olbaltumvielu sekvences un Rba kristālisko struktūru. Kā veidne tika izmantots sphaeroides RC (PDB ID: 5LSE) (46). Izmantojiet UCSF Chimera rīku “fit map” (pielāgot karti), lai pielāgotu ģenerēto modeli kartei (47), uzlabotu olbaltumvielu struktūru un kofaktoru [4×BChl a (monomēru bibliotēkas atlikumu nosaukums = BCL), 2×BPh a (BPH), viena vai divu veidu UQ10 (U10), viena veida nehēma dzelzs (Fe) un viena 3,4-dihidroheksakarbonilholīna (QAK)] pievienošanai izmantojiet Kūta (48) rīku. Tā kā QAK nav pieejams monomēru bibliotēkā, tas tika parametrizēts, izmantojot eLBOW rīku PHENIX (49).
Pēc tam tika konstruēta LH1 apakšvienība. Sākotnēji tika izmantots PHENIX (49) automātiskās konstruēšanas rīks, lai automātiski konstruētu daļu no LH1 secības, izmantojot karti un LH1-α un LH1-β proteīnu secības kā ievades datus. Atlasiet pilnīgāko LH1 apakšvienību, izvelciet to un ielādējiet to Coot, manuāli pievienojiet tajā trūkstošo secību un manuāli precizējiet visu struktūru, pirms pievienojat divus BCls a (BCL) un spirilloksantīnu (CRT) [saskaņā ar attiecīgajiem Rps]. LH1 kompleksa blīvums un zināmais karotinoīdu saturs. Sugas (17)]. Kopējiet pilno LH1 apakšvienību un izmantojiet UCSF Chimera “Docking Map Tool”, lai piestiprinātu blakus esošo LH1 blīvuma nemodeļa apgabalu, un pēc tam precizējiet to Coot; atkārtojiet procesu, līdz visas LH1 apakšvienības ir modelētas. RC-LH114-W struktūrai, iegūstot nepiešķirto blīvumu Coot, proteīns tiek segmentēts no atlikušajiem neproteīnu komponentiem USCF himēras kartē un automātiskās būvēšanas rīks tiek izmantots sākotnējā modeļa izveidei un atlikušo apakšvienību (proteīns-W) modelēšanai. Programmā PHENIX (49). Pievienojiet visas trūkstošās sekvences iegūtajam modelim Coot (48) un pēc tam manuāli precizējiet visu apakšvienību. Atlikušais nepiešķirtais blīvums atbilst lipīdu (PDB monomēru bibliotēkas ID CDL = CDL, POPC = 6PL un POPG = PGT), β-DDM mazgāšanas līdzekļa (LMT) un UQ10 molekulu (U10) kombinācijai. Izmantojiet PHENIX optimizāciju (49) un manuālo optimizāciju Coot (48), lai pilnveidotu pilnīgu sākotnējo modeli, līdz modeļa statistiku un atbilstības vizuālo kvalitāti vairs nevar uzlabot. Visbeidzot, izmantojiet LocScale (50), lai asinātu lokālo karti, un pēc tam veiciet vairākus citus nepiešķirtā blīvuma modelēšanas ciklus un automātisko un manuālo optimizāciju.
Attiecīgie peptīdi, kofaktori un citi lipīdi un hinoni, kas piesaistīti to attiecīgajiem blīvumiem, ir parādīti 1. un 2. attēlā. S18. līdz S23. Galīgā modeļa statistiskā informācija ir parādīta S1. tabulā.
Ja vien nav norādīts citādi, UV/Vis/NIR absorbcijas spektri tika savākti ar Cary60 spektrofotometru (Agilent, ASV) ar 1 nm intervālu no 250 nm līdz 1000 nm un integrācijas laiku 0,1 s.
Paraugu atšķaida kvarca kivetē ar 2 mm ceļu līdz A880 1 un savāc absorbcijas spektru starp 400 un 1000 nm. Cirkulārie dihroiskie spektri tika savākti ar Jasco 810 spektropolarimetru (Jasco, Japāna) ar 1 nm intervālu starp 400 nm un 950 nm, skenēšanas ātrumu 20 nm min-1.
Molāro ekstinkcijas koeficientu nosaka, atšķaidot kodolkompleksu līdz aptuveni 50 A880. 10 μl tilpumu atšķaida 990 μl saistošajā buferšķīdumā vai metanolā un nekavējoties savāc absorbcijas spektru, lai samazinātu BChl degradāciju. Katra metanola parauga BChl saturs tika aprēķināts pēc ekstinkcijas koeficienta 54,8 mM-1 cm-1 pie 771 nm, un tika noteikts ekstinkcijas koeficients (51). Izmērīto BChl koncentrāciju dala ar 32 (RC-LH114-W) vai 36 (RC-LH116), lai noteiktu kodolkompleksa koncentrāciju, ko pēc tam izmanto, lai noteiktu tā paša parauga, kas savākts buferšķīdumā, absorbcijas spektru. Ekstinkcijas koeficients. Katram paraugam tika veikti trīs atkārtoti mērījumi, un aprēķinam tika izmantota BChl Qy maksimālās absorbcijas vidējā vērtība. RC-LH114-W ekstinkcijas koeficients, mērīts pie 878 nm, ir 3280±140 mM-1 cm-1, savukārt RC-LH116 ekstinkcijas koeficients, mērīts pie 880 nm, ir 3800±30 mM-1 cm-1.
UQ10 tika kvantitatīvi noteikts saskaņā ar metodi (52). Īsumā, apgrieztās fāzes HPLC (RP-HPLC) tika veikta, izmantojot Agilent 1200 HPLC sistēmu. Izšķīdiniet aptuveni 0,02 nmol RC-LH116 vai RC-LH114-W 50 μl 50:50 metanola:hloroforma šķīdumā, kas satur 0,02% (w/v) dzelzs hlorīda, un injicējiet iepriekš līdzsvarotu Beckman Coulter Ultrasphere ODS 4,6 mm, izšķīdinot to 1 ml-1 min-1 40°C temperatūrā HPLC šķīdinātājā (80:20 metanols:2-propanols) ×25 cm kolonnā. Veiciet izokrātisku eluēšanu HPLC šķīdinātājā, lai 1 stundu kontrolētu absorbciju pie 275 nm (UQ10), 450 nm (karotinoīdi) un 780 nm (BChl). 275 nm hromatogrammā 25,5 minūtē tika integrēts maksimums, kas nesaturēja citus nosakāmus savienojumus. Integrēto laukumu izmanto, lai aprēķinātu ekstrahēto UQ10 molāro daudzumu, atsaucoties uz kalibrēšanas līkni, kas aprēķināta no tīru standartu injekcijas no 0 līdz 5,8 nmol (S14. attēls). Katrs paraugs tika analizēts trīs atkārtojumos, un ziņotā kļūda atbilst vidējās vērtības standartnovirzei.
Ar 30 μM reducēta zirga sirds citohroma c2 (Merck, Apvienotā Karaliste) un 0 līdz 50 μMUQ2 (Merck, Apvienotā Karaliste) tika sagatavots šķīdums, kas saturēja RC-LH1 kompleksu ar maksimālo Qy absorbciju 0,1. Katrā UQ2 koncentrācijā tika sagatavoti trīs 1 ml paraugi un inkubēti nakti tumsā 4°C temperatūrā, lai pirms mērīšanas nodrošinātu pilnīgu adaptāciju tumsā. Šķīdums tika ielādēts OLIS RSM1000 modulārā spektrofotometrā, kas aprīkots ar 300 nm liesmas/500 līniju režģi, 1,24 mm ieplūdi, 0,12 mm vidējo un 0,6 mm izejas spraugām. Parauga fototuba un atsauces fotoelektronu pavairotāja tubā ieejā tika novietots 600 nm garš caurlaides filtrs, lai izslēgtu ierosmes gaismu. Absorbcija tika kontrolēta pie 550 nm ar integrācijas laiku 0,15 s. Ierosmes gaismu izstaro 880 nm M880F2 LED (gaismu emitējošā diode) (Thorlabs Ltd., Apvienotā Karaliste) caur optisko šķiedru kabeli ar 90% intensitāti, izmantojot DC2200 kontrolieri (Thorlabs Ltd., Apvienotā Karaliste), un tā tiek izstarota uz gaismas avotu 90° leņķī. Mērīšanas stars ir vērsts pret spoguli, lai atgrieztu gaismu, ko paraugs sākotnēji neabsorbēja. Absorbciju kontrolē 10 s pirms 50 s apgaismojuma. Pēc tam absorbcija tika vēl 60 s kontrolēta tumsā, lai novērtētu, cik lielā mērā hinolols spontāni reducē citohromu c23+ (neapstrādātus datus skatīt S8. attēlā).
Dati tika apstrādāti, pielāgojot lineāru sākotnējo ātrumu 0,5 līdz 10 s robežās (atkarībā no UQ2 koncentrācijas) un aprēķinot visu trīs paraugu ātrumu vidējo vērtību katrā UQ2 koncentrācijā. RC-LH1 koncentrācija, kas aprēķināta, izmantojot attiecīgo ekstinkcijas koeficientu, tika izmantota, lai pārvērstu ātrumu katalītiskajā efektivitātē, attēlota programmā Origin Pro 2019 (OriginLab, ASV) un pielāgota Michaelis-Menten modelim, lai noteiktu šķietamās Km un Kcat vērtības.
Pārejošas absorbcijas mērījumiem RC-LH1 paraugs tika atšķaidīts līdz ~2 μM IMAC buferšķīdumā, kas satur 50 mM nātrija askorbātu (Merck, ASV) un 0,4 mM terbutīnu (Merck, ASV). Askorbīnskābe tiek izmantota kā upurēšanas elektronu donors, un tert-butaklofēns tiek izmantots kā QB inhibitors, lai nodrošinātu, ka galvenais RC donors visā mērīšanas procesā paliek reducēts (tas ir, netiek fotooksidēts). Aptuveni 3 ml parauga tiek pievienots pielāgotā rotējošā šūnā (apmēram 0,1 m diametrā, 350 apgr./min) ar 2 mm optiskā ceļa garumu, lai nodrošinātu, ka paraugam lāzera ceļā ir pietiekami daudz laika tumsas adaptācijai starp ierosmes impulsiem. Izmantojiet ~100 fs lāzera impulsus, lai pastiprinātu Ti:Sapphire lāzera sistēmu (Spectra Physics, ASV), lai ierosinātu paraugu pie 880 nm ar atkārtošanās frekvenci 1 kHz (20 nJ NIR vai 100 nJ Vis). Pirms datu vākšanas paraugs jāpakļauj ierosmes gaismai apmēram 30 minūtes. Iedarbība izraisīs QA inaktivāciju (iespējams, vienu vai divas reizes samazinot QA). Taču, lūdzu, ņemiet vērā, ka šis process ir atgriezenisks, jo pēc ilga tumsas adaptācijas perioda RC lēnām atgriezīsies QA aktivitātē. Pārejošu spektru mērīšanai ar aizkaves laiku no -10 līdz 7000 ps tika izmantots Helios spektrometrs (Ultrafast Systems, ASV). Izmantojiet Surface Xplorer programmatūru (Ultrafast Systems, ASV), lai atgrupētu datu kopas, pēc tam apvienotu un standartizētu. Izmantojiet CarpetView programmatūras pakotni (Light Conversion Ltd., Lietuva), lai izmantotu apvienoto datu kopu un iegūtu ar sabrukšanu saistītus diferenciālos spektrus, vai izmantojiet funkciju, kas konvolvē vairākus eksponentus ar instrumenta reakciju, lai pielāgotu viena viļņa garuma spektra evolūciju Origin (OriginLab, ASV).
Kā minēts iepriekš (53), tika sagatavota fotosintēzes plēve, kas satur LH1 kompleksu, kuram trūkst gan RC, gan perifērās LH2 antenas. Membrāna tika atšķaidīta ar 20 mM Tris (pH 8,0) un pēc tam ievietota kvarca kivetē ar 2 mm optisko ceļu. Parauga ierosināšanai pie 540 nm ar aiztures laiku no -10 līdz 7000 ps tika izmantots 30 nJ lāzera impulss. Apstrādājiet datu kopu, kā aprakstīts Rps.pal paraugam.
Membrāna tika sapresēta, centrifugējot ar 150 000 RCF 2 stundas 4°C temperatūrā, un pēc tam tās absorbcija pie 880 nm tika atkārtoti suspendēta 20 mM tris-HCl (pH 8,0) un 200 mM NaCl. Membrānu izšķīdināja, lēnām maisot 2% (w/v) β-DDM 1 stundu tumsā 4°C temperatūrā. Paraugu atšķaidīja 100 mM trietilamonija karbonātā (pH 8,0) (TEAB; Merck, Apvienotā Karaliste) līdz olbaltumvielu koncentrācijai 2,5 mg ml-1 (Bio-Rad analīze). Turpmāka apstrāde tika veikta, izmantojot iepriekš publicēto metodi (54), sākot ar 50 μg olbaltumvielu atšķaidīšanu kopā 50 μl TEAB, kas satur 1% (w/v) nātrija laurāta (Merck, Apvienotā Karaliste). Pēc 60 s ilgas ultraskaņas apstrādes tas tika reducēts ar 5 mM tris(2-karboksietil)fosfīnu (Merck, Apvienotā Karaliste) 37°C temperatūrā 30 minūtes. S-alkilēšanai paraugu inkubēja ar 10 mM metil-S-metiltiometānsulfonātu (Merck, Apvienotā Karaliste) un pievienoja to no 200 mM izopropanola standarta šķīduma 10 minūtes istabas temperatūrā. Proteolītisko šķelšanu veica, pievienojot 2 μg tripsīna/endoproteināzes Lys-C maisījuma (Promega UK) un inkubējot 37°C temperatūrā 3 stundas. Laurāta virsmaktīvo vielu ekstrahēja, pievienojot 50 μl etilacetāta un 10 μl 10% (v/v) LC kvalitātes trifluoretiķskābes (TFA; Thermo Fisher Scientific, Apvienotā Karaliste) un kratot 60 s. Fāžu atdalīšanu veicināja centrifugēšana ar 15 700 RCF 5 minūtes. Saskaņā ar ražotāja protokolu, apakšējās fāzes, kas satur peptīdu, rūpīgai aspirācijai un atūdeņošanai tika izmantota C18 centrifūgas kolonna (Thermo Fisher Scientific, Apvienotā Karaliste). Pēc žāvēšanas vakuuma centrifugēšanā paraugs tika izšķīdināts 0,5% TFA un 3% acetonitrilā, un 500 ng tika analizēts ar nanoplūsmas RP hromatogrāfiju, kas savienota ar masas spektrometriju, izmantojot iepriekš detalizēti aprakstītos sistēmas parametrus.
Izmantojiet MaxQuant v.1.5.3.30 (56) olbaltumvielu identificēšanai un kvantitatīvai noteikšanai, lai meklētu Rps. palustris proteomu datubāzē (www.uniprot.org/proteomes/UP000001426). Masas spektrometrijas proteomikas dati ir deponēti ProteomeXchange Alliance, izmantojot PRIDE partneru repozitoriju (http://proteomecentral.proteomexchange.org), ar datu kopas identifikatoru PXD020402.
Analīzei ar RPLC, kas apvienota ar elektrospray jonizācijas masas spektrometriju, RC-LH1 komplekss tika sagatavots no savvaļas tipa Rps. Izmantojot iepriekš publicēto metodi (16), palustris šūnās saražotā proteīna koncentrācija bija 2 mg ml-1 20 mM Hepes (pH 7,8), 100 mM NaCl un 0,03% (w/v) β- (Bio-Rad analīze) ) DDM. Saskaņā ar ražotāja protokolu, izmantojot 2D attīrīšanas komplektu (GE Healthcare, ASV), ar nogulsnēšanas metodi ekstrahēja 10 μg proteīna un izšķīdināja nogulsnes 20 μl 60% (v/v) skudrskābes (FA), 20% (v/v) acetonitrila un 20% (v/v) ūdens. Pieci mikrolitri tika analizēti ar RPLC (Dionex RSLC) kopā ar masas spektrometriju (Maxis UHR-TOF, Bruker). Atdalīšanai 60°C temperatūrā un ar ātrumu 100μlmin-1 izmantojiet MabPac 1,2×100 mm kolonnu (Thermo Fisher Scientific, Apvienotā Karaliste), izmantojot gradientu no 85% (v/v) šķīdinātāja A [0,1% (v/v) FA un 0,02% (V/v) TFA ūdens šķīdums] līdz 85% (v/v) šķīdinātājam B [0,1% (v/v) FA un 0,02% (v/v) 90% (v/v) acetonitrila TFA]. Izmantojot standarta elektroizsmidzināšanas jonizācijas avotu un noklusējuma parametrus ilgāk par 60 minūtēm, masas spektrometrs iegūst no 100 līdz 2750 m/z (masas un lādiņa attiecība). Ar ExPASy bioinformātikas resursu portāla FindPept rīka (https://web.expasy.org/findpept/) palīdzību kartējiet masas spektru kompleksa apakšvienībām.
Šūnas tika audzētas 72 stundas 100 ml NF-zemā (10 μMm-2 s-1), vidējā (30 μMm-2 s-1) vai augsta (300 μMm-2 s-1) apgaismojumā. M22 barotne (M22 barotne, kurā nav amonija sulfāta un nātrija sukcināts ir aizstāts ar nātrija acetātu) 100 ml pudelē ar skrūvējamu vāciņu (23). Piecos 30 sekunžu ciklos 0,1 mikrona stikla lodītes tika uzsmidzinātas ar tilpuma attiecību 1:1, lai lizētu šūnas, un atdzesētas uz ledus 5 minūtes. Nešķīstošās vielas, nesalauztās šūnas un stikla lodītes tika atdalītas, centrifugējot ar 16 000 RCF 10 minūtes galda mikrocentrifūgā. Membrāna tika atdalīta Ti 70.1 rotorā ar 100 000 RCF 20 mM tris-HCl (pH 8,0) ar 40/15% (m/m) saharozes gradientu 10 stundas.
Kā aprakstīts mūsu iepriekšējā darbā, His marķējuma imūndetekcija uz PufW (16). Īsāk sakot, attīrīts kodola komplekss (11,8 nM) vai membrāna, kas satur tādu pašu RC koncentrāciju (noteikta ar oksidāciju, atņemot reducēto diferenciālo spektru un saskaņojot slodzi uz iekrāsotā gela) 2x SDS ielādes buferšķīdumā (Merck, Apvienotā Karaliste), kas atšķaidīts divreiz. Olbaltumvielas tika atdalītas uz replikas 12% bis-tris NuPage gela (Thermo Fisher Scientific, Apvienotā Karaliste). Gels tika iekrāsots ar Coomassie Brilliant Blue (Bio-Rad, Apvienotā Karaliste), lai ielādētu un vizualizētu RC-L apakšvienību. Otrā gela olbaltumvielas tika pārnestas uz metanola aktivētas polivinilidēnfluorīda (PVDF) membrānu (Thermo Fisher Scientific, Apvienotā Karaliste) imūnanalīzei. PVDF membrāna tika bloķēta 50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0,2% (v/v) Tween-20 un 5% (w/v) vājpiena pulverī, un pēc tam 4 stundas inkubēta ar anti-His primāro antivielu (atšķaidītā antivielu buferšķīdumā [50 mM tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl un 0,05% (v/v) Tween-20] 1:1000 A190-114A, Bethyl Laboratories, ASV). Pēc 3 minūšu mazgāšanas antivielu buferšķīdumā 5 minūtes, membrāna tika apvienota ar mārrutku peroksidāzes (Sigma-Aldrich, Apvienotā Karaliste) antivielām pret pelēm (atšķaidītas 1:10 000 antivielu buferšķīdumā). Inkubēja, lai nodrošinātu noteikšanu (5 minūtes pēc 3 mazgāšanas antivielu buferšķīdumā), izmantojot WESTAR ETA C 2.0 ķīmiskās luminiscences substrātu (Cyanagen, Itālija) un Amersham Imager 600 (GE Healthcare, Apvienotā Karaliste).
Uzzīmējot katra iekrāsotā gela vai imūnanalīzes joslas intensitātes sadalījumu, integrējot laukumu zem pīķa un aprēķinot RC-L (iekrāsotā gela) un proteīna-W (imūnanalīzes) intensitātes attiecību, apstrādājiet attēlu programmā ImageJ (57). Šīs attiecības tika pārveidotas par molārajām attiecībām, pieņemot, ka RC-L un proteīna-W attiecība tīrā RC-LH114-W paraugā ir 1:1, un attiecīgi normalizējot visu datu kopu.
Papildu materiālus šim rakstam skatiet vietnē http://advances.sciencemag.org/cgi/content/full/7/3/eabe2631/DC1.
Šis ir brīvas piekļuves raksts, kas izplatīts saskaņā ar Creative Commons Attribution licences noteikumiem. Rakstu drīkst neierobežoti izmantot, izplatīt un reproducēt jebkurā vidē ar nosacījumu, ka oriģināldarbs tiek pareizi citēts.
Piezīme. Lūdzam norādīt savu e-pasta adresi tikai tāpēc, lai persona, kuru iesakāt lapai, zinātu, ka vēlaties, lai tā redzētu e-pastu un ka tas nav surogātpasts. Mēs neiegūsim nevienu e-pasta adresi.
Šis jautājums tiek izmantots, lai pārbaudītu, vai esat apmeklētājs, un novērstu automātisku surogātpasta iesniegšanu.
Deivids Dž. K. Sveinsberijs, Parks Čians, Filips Dž. Džeksons, Keitlina M. Fariesa, Dariušs M. Ņedzki, Elizabete K. Mārtina, Deivids A. Farmere, Lorna A. Malone, Rebeka F. Tompsone, Nīls A. Ransons, Daniels P. Kanife, Marks Dž. Dikmens, Djūijs Holtens, Kristīne Kirmaiere, Endrjū Hičkoks, K. Nīls Hanters
Gaismas slazda 1 kompleksa augstas izšķirtspējas struktūra reakcijas centrā sniedz jaunu ieskatu hinona dinamikā.
Deivids Dž. K. Sveinsberijs, Parks Čians, Filips Dž. Džeksons, Keitlina M. Fariesa, Dariušs M. Ņedzki, Elizabete K. Mārtina, Deivids A. Farmere, Lorna A. Malone, Rebeka F. Tompsone, Nīls A. Ransons, Daniels P. Kanife, Marks Dž. Dikmens, Djūijs Holtens, Kristīne Kirmaiere, Endrjū Hičkoks, K. Nīls Hanters
Gaismas slazda 1 kompleksa augstas izšķirtspējas struktūra reakcijas centrā sniedz jaunu ieskatu hinona dinamikā.
©2021 Amerikas Zinātnes attīstības asociācija. visas tiesības paturētas. AAAS ir HINARI, AGORA, OARE, CHORUS, CLOCKSS, CrossRef un COUNTER partneris. ScienceAdvances ISSN 2375-2548.